Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Streszczenie

Korzeń pełni funkcję fizycznej kotwicy rośliny i jest organem odpowiedzialnym za pobieranie wody oraz składników mineralnych, takich jak azot, fosfor, siarczany i mikroelementy, które rośliny pozyskują z gleby. Aby opracować zrównoważone podejścia do osiągania wysokich plonów upraw, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób korzeń się rozwija, pobiera szerokie spektrum składników odżywczych i wchodzi w interakcje z organizmami symbiotycznymi i patogennymi. Aby zrealizować te cele, musimy mieć możliwość badania korzeni w szczegółach mikroskopowych w przedziałach czasowych od kilku minut do wielu dni.

Opracowaliśmy RootChip, mikrofluidyczne urządzenie oparte na polidimetylosiloksanie (PDMS), które pozwala na hodowlę i obrazowanie korzeni siewek Arabidopsis przy jednoczesnym uniknięciu jakiegokolwiek stresu fizycznego korzeni podczas przygotowania do obrazowania¹ (Rysunek 1). Urządzenie zawiera rozwidloną strukturę kanałów z zaworami mikromechanicznymi, które kierują przepływem cieczy z wlotów roztworów do każdej z ośmiu komór obserwacyjnych². Ten system perfuzji pozwala na precyzyjną i szybką kontrolę oraz modyfikację mikrośrodowiska korzeni. Objętość komór wynosi około 400 nl, co sprawia, że wymagane są jedynie minimalne ilości roztworów testowych.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania biologii korzeni z wykorzystaniem RootChip oraz metod obrazowania z rozdzielczością czasową w czasie rzeczywistym. Korzenie można analizować przez kilka dni, stosując mikroskopię poklatkową. Istnieje możliwość perfuzji korzeni roztworami odżywczymi lub inhibitorami, a w sposób równoległy można analizować do ośmiu siewek. System ten stwarza potencjał dla szerokiego zakresu zastosowań, w tym analizy wzrostu korzeni w obecności lub przy braku substancji chemicznych, analizy ekspresji genów opartej na fluorescencji oraz analizy biosensorów, np. nanosensorów FRET³.

Protokół

Uwaga: Wszystkie kroki przygotowawcze należy przeprowadzić w warunkach sterylnych.

1. Przygotowanie plastikowych stożków do kiełkowania nasion

1. Wypełnij szalkę Petriego o średnicy 10 cm pożywką wzrostową zawierającą 1% agaru do grubości 5 mm. Stosujemy zmodyfikowaną pożywkę Hoaglanda o połowicznym stężeniu⁴, jednak skład pożywki należy dobrać do indywidualnych wymagań eksperymentalnych.
2. Gdy pożywka jest jeszcze w stanie ciekłym, użyj pipety wielokanałowej, aby napełnić końcówki do pipety o pojemności 10 μl ilością 5 μl pożywki z szalki Petriego.
3. Przechowuj napełnione końcówki w pudełku na końcówki do czasu zastygnięcia pożywki, Następnie odetnij je, tworząc plastikowe stożki o długości 4 mm, i ustaw je pionowo w szalce Petriego zawierającej stałą pożywkę wzrostową.

2. Kiełkowanie nasion i wzrost siewek

1. Zdezynfekuj powierzchnię nasion w 5% NaOCl przez 5 min, przemyj trzykrotnie sterylną wodą, a następnie umieść pojedyncze nasiono na wierzchu każdego z stożków wypełnionych pożywką.
2. Uszczelnij szalkę taśmą Micropore (3M) i przechowuj w temperaturze 4 °C w celu synchronizacji kiełkowania.
3. Po trzech dniach przenieś płytki do komory wzrostowej, aby rozpocząć kiełkowanie. Warunki wzrostu to 23 °C przy cyklu 16h światła/8h ciemności (natężenie światła: 100 μE m^-2 s^-1).
4. Od 5 do 7 dni po wykiełkowaniu siewki powinny być gotowe do przeniesienia na RootChip. W tym czasie wierzchołki korzeni powinny znajdować się w pobliżu dolnych wylotów plastikowych stożków. Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź kondycję siewek, długość korzeni oraz, jeśli dotyczy, ekspresję markera fluorescencyjnego.
5. Zaznacz poszczególne siewki do przeniesienia na chip. Wybierz około dziesięciu siewek na wypadek uszkodzenia którejś z nich podczas przenoszenia.

3. Przeniesienie siewek na RootChip

1. Aby wysterylizować RootChip do eksperymentów długoterminowych, należy owinąć urządzenie papierem chłonnym, umieścić w szklanej szalce Petriego i poddać autoklawowaniu.
2. Po ostygnięciu RootChipu należy zalać go płynną pożywką wzrostową. RootChip powinien być całkowicie zanurzony, jednak poziom cieczy nie powinien przekraczać 3 mm powyżej powierzchni urządzenia.
3. Za pomocą pipety 20 μl należy pobrać pożywkę przez wlot korzenia i wylot komory, aby wypełnić komorę obserwacyjną pożywką.
4. Do wlotów RootChipu należy włożyć plastikowe stożki wybrane w kroku 2.5. Stożki powinny ściśle przylegać do wlotów. Ponieważ RootChip jest zamontowany na cienkiej warstwie szkła optycznego, nie należy wywierać zbyt dużego nacisku na chip.
5. RootChip należy inkubować przez noc w płynnej pożywce. Aby zapobiec wypływaniu, na chip należy położyć dwa szkiełka podstawowe. Należy dodać magnetyczny mieszadło i zamknąć szalkę.
6. Cały zestaw należy przenieść na mieszadło magnetyczne i delikatnie mieszać pożywkę.
7. Wloty RootChipu przecinają kanały pod kątem 30° względem normalnej urządzenia, aby ułatwić wzrost korzeni do wnętrza kanałów (Rysunek 1A). Aby dodatkowo wspomóc wzrost w pożądanym kierunku, należy lekko przechylić zestaw, kładąc szkiełko podstawowe pod szalką Petriego po stronie chipu przeciwnej do wylotów.
8. W celu zachowania cyklu światło/ciemność, należy oświetlać siewki lampą pierścieniową (natężenie światła: 100 μE m^-2 s^-1) podłączoną do programatora czasowego.

4. Podłączenie RootChip do nośnika

1. Następnego dnia napełnij szczelną fiolkę odporną na ciśnienie płynną pożywką wzrostową (Rysunek 1B).
2. Odwróć uchwyt chipa i postaw go na stabilnej powierzchni. Wyjmij RootChip z pożywki płynnej i włóż go stroną PDMS w dół do dolnego otworu uchwytu chipa. Zorientuj chip tak, aby strona zawierająca wloty warstwy sterującej była skierowana w stronę złączy przewodów linii ciśnieniowej w bocznej ściance uchwytu.
3. Osusz szkiełko podstawowe na spodzie chipa, delikatnie przykładając chusteczkę higieniczną. Przymocuj RootChip do uchwytu taśmą i ustaw cały zestaw w pozycji pionowej.
4. Złącza przewodów wykonuje się poprzez pocięcie elastycznych plastikowych przewodów mikrobore (TYGON, 0.20" ID x 0.060" OD) na odcinki o długości 5 cm i połączenie ich ze stalowymi rurkami mikrobore (New England Small Tube, 0.025" OD x 0.013" ID x 0.75" long). Napełnij złącza przewodów wodą za pomocą strzykawki i podłącz każde złącze do odpowiedniego wlotu warstwy sterującej na chipie. Woda wypełni później kanały warstwy sterującej i będzie służyć do przekazywania ciśnienia do zaworów mikromechanicznych.
5. Włóż przeciwległe końce przewodów do fiolki(ek) z pożywką/roztworem. Przyłóż ciśnienie do fiolki z roztworem za pomocą strzykawki z powietrzem. Zwiększone ciśnienie powietrza w fiolce z roztworem wymusi przepływ cieczy do przewodów.

5. Montaż RootChipu pod mikroskopem

1. Umieść nośnik na stoliku mikroskopu. Aby zmniejszyć ryzyko przesunięcia się układu w trakcie eksperymentu na skutek wibracji w pomieszczeniu, nośnik powinien dokładnie pasować do nacięć wkładki stolika.
2. Zawory w chipie oraz przepływ medium przez chip są kontrolowane za pomocą ciśnienia powietrza. Od głównej linii ciśnienia odchodzą dwie linie z regulatorami – jedna służy do sterowania przepływem medium przez kanały, a druga jest podłączona do elektrozaworów powietrznych, które uruchamiają zawory wypychające warstwy sterującej. Elektrozawory są obsługiwane z komputera za pomocą kontrolera zaworów USB (opracowanego przez Rafaela Gómeza-Sjöberga z Lawrence Berkeley National Lab). Przed podłączeniem chipa zamknij oba regulatory ciśnienia.
3. Do zbiorników nośnika dodaj kilka ml wody, aby utrzymać wysoką wilgotność wewnątrz układu. Krok ten należy powtarzać w trakcie dłuższych eksperymentów, aby zapobiec wysychaniu roślin. Utrzymuj niską objętość, aby zminimalizować ilość cieczy, która mogłaby zostać rozlana na mikroskop. W przypadku eksperymentów długoterminowych odpływ z wylotów chipa można skierować do zbiorników nośnika, łącząc wyloty chipa ze zbiornikami za pomocą rurek o małej średnicy (patrz krok 4.4). Alternatywnie, odpływ gromadzący się na powierzchni chipa można zbierać za pomocą pipety.
4. Przygotuj kwadratowe arkusze przezroczystego plastiku z koszulek ochronnych (C-Line). Przymocuj przezroczysty plastik do nośnika za pomocą taśmy dwustronnej, aby utrzymać wysoką wilgotność w układzie.
5. Umieść pierścieniowe oświetlenie nad chipem i zachowaj cykl światła/ciemności. Oświetlenie pierścieniowe należy wyłączyć przed rozpoczęciem każdego eksperymentu z użyciem markerów fluorescencyjnych, ponieważ bezpośrednie oświetlenie będzie zakłócać obrazowanie.

6. Obsługa RootChip za pomocą interfejsu LabView

Interfejs sterownika RootChip dla platformy programistycznej LabView można pobrać z naszej strony internetowej http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip.

1. Zawory na chipie są zamykane poprzez wywieranie nacisku na warstwę sterującą, w tym przypadku poprzez otwarcie elektrozaworów powietrznych. Interfejs sterownika umożliwia aktywację zaworów poprzez kliknięcie przycisku pod numerem zaworu. Jasnozielony kolor wskazuje przyłożenie ciśnienia i zamknięcie zaworu chipa (Rysunek 2B). Przed otwarciem regulatorów ciśnienia należy aktywować wszystkie trzy zawory wlotowe roztworów w interfejsie sterownika. Uwaga: Interfejs sterownika posiada pętlę sprzężenia zwrotnego, która umożliwia monitorowanie stanu systemu. Funkcję tę można aktywować, klikając przycisk „Readback” w interfejsie sterownika.
2. Otwórz regulator ciśnienia dla warstwy sterującej i ustaw go początkowo na 15 psi, następnie otwórz regulator dla warstwy przepływowej i ustaw go początkowo na 5 psi. W zależności od pożądanego natężenia przepływu, ciśnienia można później skorygować.
3. Otwórz zawór wlotowy dla wybranego medium wzrostowego, aby przepłukać komory medium.
4. Sprawdź ścieżki przepływu pod mikroskopem. Zazwyczaj w kanałach przepływowych uwięzione jest powietrze, które należy usunąć. Dodatkowo w kanałach warstwy sterującej wciąż znajduje się powietrze, które musi zostać wypchnięte i zastąpione wodą z złączy rurek (napełnianie ślepe). Oba zadania realizuje się poprzez kilkukrotne przepłukanie każdej z ośmiu komór (5 psi), aż całe powietrze zostanie wypchnięte z kanałów do PDMS („odgazowanie”). Uwaga: Interfejs sterownika można zaprogramować w celu automatyzacji eksperymentów. Takie rutyny mogą być również wykorzystane do odgazowania chipa.

7. Reprezentatywne wyniki

Głównym celem urządzenia RootChip jest połączenie platformy obrazowania i systemu perfuzji w jednym, wysoko zintegrowanym urządzeniu. Aby zademonstrować możliwość manipulacji mikrośrodowiskiem korzeni, przepłukaliśmy komory ciemnym barwnikiem spożywczym (rozcieńczenie 1:4 w pożywce hydroponicznej) i zmierzyliśmy wymianę płynu wewnątrz komór. Przy zalecanym ciśnieniu 5 psi odnotowaliśmy pełną wymianę w ciągu 10 sekund przy obliczonym natężeniu przepływu wynoszącym około 1,5 μl/min (Rysunek 3).

Obserwowaliśmy również wzrost korzeni siewek, które w tym przypadku były hodowane w ciemności z dodatkiem 10 mM glukozy jako zewnętrznego źródła energii (Rycina 4). W zależności od warunków wzrostu, takich jak światło i skład pożywki, rośliny mogą być obserwowane w urządzeniu RootChip przez okres do trzech dni.

Układ RootChip został wykorzystany do monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy i galaktozy w korzeniach wykazujących ekspresję genetycznie zakodowanych nanoczujników opartych na transferze energii rezonansowej Förestera (FRET)^5-7. Korzenie w chipie były perfundowane impulsami roztworu glukozy lub galaktozy (Rysunek 5). Monitorowano wewnątrzkomórkowe poziomy cukrów, które przedstawiono tutaj jako stosunek intensywności fluorescencji akceptora Citrine do intensywności donora ECFP. Wzrost tego stosunku wskazuje na akumulację cukru.

Rysunek 1. Zasada działania RootChip.

1. RootChip posiada osiem komór obserwacyjnych przeznaczonych do wzrostu i obrazowania korzeni. Nasiona najpierw kiełkują w plastikowych stożkach – wykonanych z końcówek pipet – które są wypełnione podłożem stałym. Wierzchołek korzenia rośnie przez podłoże i dociera do komory, w której ciągły przepływ podłoża ciekłego utrzymuje stałe warunki. Zawory mikromechaniczne (czerwone) kontrolują przepływ. Chip jest zamocowany na szklanej lamielce optycznej.
   Rysunek nie w skali. (Adaptowano za zgodą Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)
2. Schemat fiolki z roztworem z możliwością nadciśnienia z membraną (czerwoną).

Rycina 2. Podłączanie i montaż RootChip.

1. Widok z góry w pełni połączonego układu RootChip wraz z nośnikiem zamontowanym na mikroskopie odwróconym.
2. Schemat ilustrujący system zaworowy oraz interfejs sterownika. Przedstawiono przykład ustawienia zaworów w celu skierowania przepływu cieczy do pojedynczej komory. Podczas gdy zawory od 4 do 8 działają jako zawory pojedyncze, zawory od 0 do 3 działają w grupach. Dzięki temu systemowi do pojedynczej komory można uzyskać dostęp poprzez aktywację odpowiedniej kombinacji zaworów.

Rycina 3. Wymiana roztworów w komorach obserwacyjnych. Wizualizacja wymiany płynu w komorze obserwacyjnej przy użyciu roztworu barwnika. Obraz stanowi nałożenie obrazu w jasnym polu na fałszywie kolorowaną intensywność sygnału barwnika.

Rycina 4. Wzrost korzenia na chipie. Obserwacja pojedynczego rosnącego korzenia wykazującego ekspresję fluorescencyjnego nanoczujnika FRET dla glukozy/galaktozy w ciągu 20 h. Format czasu: hh:mm; pasek skali: 100 μm.

Rycina 5. Pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów cukrów przy użyciu nanoczujników FRET.

1. Ilość sensora jest przedstawiona jako intensywność cytrynowa w obrębie wierzchołka korzenia (po lewej). Odpowiedź wewnątrzkomórkowego nanosensora FRET na aplikację roztworu glukozy lub galaktozy przedstawiono w formie obrazów ratiometrycznych. (Zaadaptowano za zgodą Grossmann et al., 2011 Plant Cell). Pasek skali: 100 μm.
2. Zapis zmian stosunku FRET w odpowiedzi na trzy powtórzone impulsy prostokątne glukozy (zielony) i galaktozy (czerwony).

Dyskusja

Głównymi zaletami RootChip w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli są małoinwazyjne przygotowanie do mikroskopii, możliwość odwracalnej i wielokrotnej zmiany środowiska korzenia oraz zdolność do ciągłej obserwacji tkanki kompetentnej rozwojowo i fizjologicznie zdrowej przez okres kilku dni. Wcześniej siewki hodowano pionowo na pożywkach żelowych i przenoszono do systemu perfuzyjnego bezpośrednio przed eksperymentem, co pozwalało na pomiar tylko pojedynczych korzeni w jednym czasie⁸. Narzędzia mikrofluidyczne były stosowane dla Arabidopsis, lecz na niskim poziomie integracji⁹ lub bez kontroli perfuzji¹⁰. RootChip łączy wysoki poziom integracji z możliwością automatyzacji eksperymentów dzięki precyzyjnemu sterowaniu przepływem. Kolejną zaletą tej platformy, charakterystyczną dla wszystkich urządzeń mikrofluidycznych¹¹, jest fakt, że do dostarczenia korzeniowi niezbędnych składników odżywczych wymagane są jedynie minimalne ilości cieczy, nawet w przypadku eksperymentów trwających kilka dni. RootChip jest obecnie zaprojektowany jako urządzenie jednorazowe, jednak ze względu na niskie koszty produkcji chipów, niewielkie ilości zużywanych odczynników sprawiają, że urządzenie to pozostaje bardzo ekonomiczne.

Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy podjąć, aby zagwarantować zdrowie siewek:

Objętość w plastikowych stożkach wynosi zaledwie 3-4 μl, co sprawia, że ciecz zacznie wysychać po wystawieniu na działanie powietrza. Dlatego kluczowe jest, aby szybko przenieść stożki na chip i utrzymywać wysoką wilgotność aż do momentu, gdy korzenie dotrą do komór obserwacyjnych, które zapewnią im odpowiednią ilość wody. Kroki od 4.2 do 4.5 należy wykonać szybko i bez przerwy, aby zapobiec wysychaniu siewek.

Kroki 3.5 - 3.8 opisują inkubację chipa w mediach płynnych, podczas której korzenie wrastają do komór obserwacyjnych. Krok ten można pominąć, montując chipa w nośniku natychmiast i rozpoczynając stałą perfuzję pożywką wzrostową. Zalecamy jednak namaczanie w pożywce wzrostowej przez noc, ponieważ niesie to ze sobą pewne korzyści: 1) tworzy to wilgotne środowisko, dzięki czemu siewki rzadziej ulegają wysuszeniu podczas wrastania do komory obserwacyjnej; 2) chip jest nasączony cieczą, dzięki czemu odpowietrzanie (krok 6.4) przebiegnie szybciej.

Ważne jest stosowanie mediów o niskim stężeniu substancji rozpuszczonych. Bardziej skoncentrowane roztwory mogą ulec wytrąceniu i zapchać kanały, szczególnie jeśli chip jest używany przez kilka dni.

Po podłączeniu urządzenia do linii ciśnienia powietrza przepływ medium jest kontrolowany poprzez zmianę ciśnienia hydraulicznego w zaworach. Aby zagwarantować prawidłowe zamknięcie zaworów mikromechanicznych, należy wybrać ciśnienie sterujące około trzy razy wyższe niż ciśnienie przepływu. Ciśnienie przepływu nie powinno przekraczać 15 psi, ponieważ ciecz zostanie wypchnięta z wlotów korzeniowych. Wyższe ciśnienia mogą również spowodować delaminację chipa, co uczyni go niezdatnym do użytku.

Ograniczeniem RootChip jest fakt, że PDMS jest porowaty i hydrofobowy. Chociaż materiał ten jest praktycznie obojętny w stosunku do roztworów wodnych, może absorbować związki organiczne¹². Może to utrudniać szybką wymianę roztworów, ponieważ związki organiczne mogą wyciekać z materiału nawet po zatrzymaniu ich podawania przez wlot. Ze względu na porowatość, stosowanie rozpuszczalników organicznych może powodować pęcznienie PDMS¹².

Kontynuujemy optymalizację RootChip i rozszerzamy zakres jego zastosowań, na przykład w odniesieniu do korzeni roślin uprawnych. Wierzymy, że dzięki usprawnieniu dostępu do korzenia w celu przeprowadzania zabiegów i obserwacji, narzędzia mikrofluidyczne, takie jak RootChip, otworzą nowe perspektywy w badaniach nad systemami korzeniowymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Uchwyt chipa, oprogramowanie i inne informacje.	Carnegie Institution - DPB	Pliki CAD i CNC do produkcji uchwytów, oprogramowanie sterownika oraz dalsze informacje są dostępne do pobrania ze strony internetowej http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Uchwyty można również zamówić za pośrednictwem tej strony.
RootChip	Stanford Foundry	Projekty masek i protokoły wykonania są dostępne na zapytanie. Gotowe do użycia układy RootChip można zamówić ze strony http://www.stanford.edu/group/foundry/
Sterownik chipa	Własnej konstrukcji	Zautomatyzowany system sterowania zaworami został pierwotnie opracowany przez Rafaela Gómez-Sjöberga z Lawrence Berkeley National Lab. Szczegółową instrukcję budowy własnego sterownika zaworów siłownikowych można znaleźć pod adresem https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers