Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4294

⸱

28 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Streszczenie

W jądrze komórkowym znajdują się proteomy, których funkcje są najściślej powiązane z regulacją genów. Jądra kardiomiocytów dorosłych ssaków są wyjątkowe ze względu na wysoki odsetek komórek dwuukładowych,1 przeważająco heterochromatyczny stan DNA oraz niedzielący się charakter kardiomiocytów, co sprawia, że dojrzałe jądra znajdują się w permanentnym stanie interfazy.2 Regulacja transkrypcyjna podczas rozwoju i w przebiegu chorób była w tym organie dobrze zbadana,3-5 jednak pozostaje stosunkowo nieodkryta rola białek jądrowych odpowiedzialnych za pakowanie i ekspresję DNA oraz sposób, w jaki białka te kontrolują zmiany w programach transkrypcyjnych występujące podczas choroby.6 W krajach rozwiniętych choroby serca są główną przyczyną śmiertelności zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet.7 Zrozumienie, w jaki sposób białka jądrowe współpracują w celu regulowania progresji tych schorzeń, jest kluczowe dla rozwoju obecnych opcji terapeutycznych.

Spektrometria mas jest idealnym narzędziem do odpowiedzi na te pytania, ponieważ umożliwia bezstronną adnotację proteomu jądrowego oraz kwantyfikację względną zmian w obfitości tych białek w przebiegu choroby. Choć przeprowadzono kilka badań proteomicznych kompleksów białek jądrowych ssaków,8-13 do niedawna14 istniało tylko jedno badanie analizujące proteom jądra komórek serca, które obejmowało ono całe jądro, zamiast badać proteom na poziomie podprzedziałów jądrowych.15 W dużej mierze ten brak prac wynika z trudności w izolacji jąder komórek serca. Jądra te znajdują się w obrębie sztywnego i gęstego aparatu aktynowo-miozynowego, z którym są połączone za pomocą licznych wypustek siateczki śródplazmatycznej, do tego stopnia, że skurcz miocytów zmienia ich ogólny kształt.16 Dodatkowo kardiomiocyty składają się w 40% objętościowo z mitochondriów,17 co wymaga wzbogacenia frakcji jąder w celu oddzielenia ich od pozostałych organelli. W niniejszej pracy opisujemy protokół wzbogacania jąder komórek serca i ich dalszego frakcjonowania na biologicznie istotne przedziały. Ponadto szczegółowo omawiamy metody bezetykietowej ilościowej analizy spektrometrycznej tych frakcji – techniki te nadają się do eksperymentów in vivo w różnych modelach zwierzęcych i układach organów, w których znakowanie metaboliczne nie jest możliwe.

Protokół

Przebieg eksperymentu składa się z siedmiu głównych etapów (Rysunek 1). Podczas wszelkich prac z próbkami, które będą analizowane za pomocą spektrometru mas, osoba przeprowadzająca badanie powinna nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz siatkę na włosy, dbając o uniknięcie zanieczyszczeń kurzem i złuszczonym naskórkiem (keratyną).

1. Homogenizacja serca i izolacja jąder

Serca myszy poddaje się homogenizacji, a następnie izoluje się osad nienaruszonych jąder komórkowych (Rycina 2).

  1. Uśmiercić dorosłą mysz, wyciąć serce, wypłukać w lodowatym PBS i homogenizować na lodzie w szklanym homogenizatorze typu dounce (zalecamy Wheaton Tissue Grinder od Fisher, #08-414-13A, lecz inne metody mogą być równie skuteczne) zawierającym 2 ml buforu do lizy (roztwór hipotoniczny, który selektywnie lize błony komórkowe, oszczędzając organelle, w tym jądra komórkowe) (10 mM Tris pH 7.5, 15 mM NaCl i 0,15% v/v Nonidet P-40 [NP-40] w wodzie dejonizowanej oraz mieszanina inhibitorów proteaz i fosfataz: 10 mM maślanu sodu, 0,1 mM fenylometylosulfonylofluorurem [PMSF], 0,2 mM Na3VO4, 0,1 mM NaF oraz 1 pellet inhibitora proteaz Roche/10 ml - bufor do lizy może być przechowywany do jednego tygodnia w -20 °C). (Uwaga: Nie uważamy perfuzji serca PBS za konieczną, ponieważ nasze dane z spektrometrii mas oraz analiza GO wskazują, że białka pochodzą głównie z kardiomiocytów [p-value 3.8E-22], a nie z zanieczyszczeń krwią [p value 5.0E-2]).
  2. Przespisać lizat przez sito 100 μm i zebrać przelew do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml. Na tym etapie, o ile nie wskazano inaczej, próbkę należy trzymać na lodzie.
  3. Wirować przy 4 000 rpm przez 5 min w 4 °C.
  4. Usunąć nadfiltr. (Jest to cytosol, który należy przechowywać w -80 °C; zawiera on zlizowane mitochondria). Resuspendować osad w 200 μl buforu do lizy poprzez tryturację. (Jest to surowy osad jądrowy).
  5. Napełnić probówkę do wirowania 1,5 ml ilością 1 ml buforu sacharozowego (24% sacharozy masa/objętość, 10 mM Tris pH 7.5 i 15 mM NaCl w wodzie dejonizowanej z mieszaniną inhibitorów proteaz/fosfataz - bufor sacharozowy powinien być przygotowany na świeżo w dniu użycia). Ostrożnie nanieść resuspendowany osad na warstwę sacharozy i wirować przy 5 000 rpm przez 10 min w 4 °C.
  6. Usunąć cienką warstwę na wierzchu oraz poduszkę sacharozową (które zawierają fragmenty błon). Przepłukać pozostały osad 200 μl lodowatego PBS/EDTA (1x PBS z 1 mM EDTA). (Jest to osad jąder komórkowych, który można solubilizować lub utrwalać do analizy western blotting lub mikroskopii elektronowej [patrz kroki 4.1 i 4.2] w celu oceny stopnia wzbogacenia).

2. Frakcjonowanie nukleoplazmy i chromatyny ekstrahowanej detergentem

Osad surowych jąder jest rozdzielany na frakcję nukleoplazmy oraz frakcję chromatyny ekstrahowaną detergentem, zawierającą białka słabo związane z DNA.

  1. Osad z kroku 1.6 homogenizować w 200 μl buforu do ekstrakcji detergentem (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M mocznika, 1% NP-40 w wodzie dejonizowanej z dodatkiem mieszaniny inhibitorów proteaz i fosfataz – bufor do ekstrakcji detergentem można przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze -20 °C).
  2. Próbkę mieszać w wortexie 2 razy po 10 s. Inkubować na lodzie przez 10 min.
  3. Wirować przy 13 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  4. Zdjąć nadsącz (jest to nukleoplazma i należy ją przechowywać w temperaturze -80 °C). Osad przemyć lodowatym PBS/EDTA (jest to osad chromatyny).
  5. Osad homogenizować w 300 μl buforu Tris, SDS, EDTA (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS w wodzie dejonizowanej z dodatkiem mieszaniny inhibitorów proteaz i fosfataz – bufor Tris, SDS, EDTA może być przechowywany do jednego tygodnia w temperaturze -20 °C).
  6. Poddać sonikacji 3-6 razy po 10 s w celu rozbicia DNA. Pomiędzy sonikacjami przechowywać próbkę na lodzie.
  7. Wirować przy 13 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz (nadsącz stanowi frakcję białek chromatyny ekstrahowanych detergentem i należy go przechowywać w temperaturze -80 °C). Pozostały osad powinien być niewielki i można go odrzucić.
  8. W przypadku użycia izolowanych miocytów zamiast całego serca: Izolować miocyty komór nurtu brzusznego szczura noworodkowego z młodych szczurów jeden dzień po narodzinach poprzez trawienie enzymatyczne, a następnie hodować w pośrodku DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% insulinowo-transferyny-selenicznosodowej (ITS) oraz 1% penicyliny. Po 24 h przenieść do pożywki bezsurowiczej (identycznej jak powyżej, ale bez FBS). Komórki zebrać w buforze do lizy (wymienionym w punkcie 1.1) i rozpocząć frakcjonowanie jąder od kroku 1.3.

3. Frakcjonowanie poprzez ekstrakcję kwasową – wzbogacanie białek związanych z DNA

Oddzielne frakcjonowanie pozwala na wzbogacenie próbki w białka ściśle związane z DNA, w tym w histony.

  1. Powtórzyć kroki 1.1-2.4.
  2. Utrzeć osad chromatyny w 400 μl 0,4 N kwasu siarkowego. Wymieszać w wirówce typu vortex w celu usunięcia grudek.
  3. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min lub przez noc w rotatorze.
  4. Odwirować przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć szczątki jądrowe.
  5. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  6. Do supernatantu dodać kroplami 132 μl kwasu trichlorooctowego. Kilkakrotnie odwrócić probówkę. Inkubować na lodzie przez 30 min.
  7. Odwirować przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  8. Odlać supernatant. Delikatnie wypłukać osad lodowatym acetonem. (Jest to osad histonów).
  9. Odwirować przy 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  10. Powtórzyć płukanie, kroki 3.8-3.9.
  11. Osad wysuszyć na powietrzu.
  12. Resuspendować osad w 100 μl buforu Tris, SDS, EDTA. Ustawić pH na 8 poprzez dodanie 1 M Tris. (Należy użyć roztworu stokowego 1 M Tris bez regulacji pH).
  13. Sonicować w kąpieli wodnej przez 15 min. Aby zapobiec przegrzaniu, dodać lód do kąpieli wodnej. (Jest to frakcja ekstrahowana kwasem, którą należy przechowywać w temperaturze -80 °C).

4. Kontrola czystości

Analizy Western blot oraz mikroskopia elektronowa potwierdzają skuteczne wzbogacenie frakcji jąder komórkowych i usunięcie pozostałych organelli. Typowe wyniki dla wszystkich poniższych testów kontroli jakości znajdują się w naszej poprzedniej publikacji.18

  1. Przeprowadzić analizę Western blot. Membranę zawierającą każdą frakcję poddać inkubacji z przeciwciałami przeciwko histonie H2A lub nukleoporynie p62 (jako markerom jądrowym w celu weryfikacji wzbogacenia) oraz przeciwko transporterowi nukleotydów adeninowych, BiP i tubulinie (odpowiednio jako markerom mitochondrialnym, markerom retikulum endoplazmatycznego i markerom cytoszkieletu w celu weryfikacji czystości). Aby potwierdzić prawidłowe subfrakcjonowanie jąder, wykryć histonę H3 lub fibrylarinę (chromatyna ekstrahowana detergentem i kwasem oraz nienaruszone jądra) oraz SNRP70 lub E2F (nukleoplazma). Wykryć białko retinoblastoma lub czynnik indukowany hipoksją-1 (wzbogacone w chromatynie ekstrahowanej detergentem w stosunku do frakcji ekstrahowanej kwasem). W tym samym żelu można przeprowadzić analizę dodatkowych próbek kontrolnych lizatu komórek HeLa i lizatu całego serca: przygotować kontrolny lizat komórek HeLa, dodając bufor Tris, SDS, EDTA do naczynia hodowlanego i zbierając próbkę za pomocą skrobaka do komórek. Próbkę poddać sonikacji i wirowaniu zgodnie z krokami 2.6-2.7. Przygotować kontrolny lizat całego serca, homogenizując serce w 2 ml buforu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% triton X-100, 2.5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM glicerofosforanu w wodzie dejonizowanej z mieszaniną inhibitorów proteaz i fosfataz). Próbkę poddać sonikacji i wirowaniu zgodnie z krokami 2.6-2.7. Sposób przygotowania próbek białek do SDS-PAGE opisano w kroku 5.
  2. Mikroskopia elektronowa: Osad jąder z kroku 1.6 resuspenderować w buforze lizującym zawierającym 2% glutaraldehydu i utrwalić próbkę w temperaturze 4 °C. Próbki przemyć kwasem osmicznym, odwodnić i zalać żywicą epoksydową. Wyciąć plastry o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu Reichert Ultracut. Próbki zabarwić octanem uranylu, a następnie ołowiem i obrazować przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEOL 100CX. Ilościowo określić stopień wzbogacenia, mierząc powierzchnię nienaruszonych jąder w stosunku do całkowitej powierzchni obrazowanego materiału. Stwierdziliśmy, że 60-80% jąder pozostaje nienaruszonych.14

Ważne uwagi dotyczące wzbogacania w stosunku do oczyszczania jąder komórkowych. Niniejszy protokół został opracowany w celu umożliwienia analiz proteomicznych chromatyny serca do badania globalnych procesów regulacji genów podczas choroby. Kluczowym elementem projektowania eksperymentów spektrometrii mas całego proteomu jest kwestia zakresu dynamicznego oraz możliwość identyfikacji i charakterystyki białek o niskiej zawartości. Oprócz głównego celu, jakim jest dostarczenie informacji na temat biologii jąder i specyfiki chromatyny, wzbogacanie proteomu jądrowego zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia tych białek o niskiej zawartości, podobnie jak dalsza subfrakcjonacja jąder. Jednakże, jak wspomniano, dojrzały kardiomiocyt posiada gęty komponent cytoszkieletu połączony z błoną jądrową. Uważamy, że nie udało nam się całkowicie oddzielić jąder od tych pozostałych składników komórkowych. Niemniej jednak, poprzez samo wzbogacenie frakcji jąder, uzyskaliśmy akceptowalny próg umożliwiający przeprowadzenie opisanych rodzajów analiz.

W szczególności wykorzystaliśmy EM do oceny czystości naszego osadu z surowymi jądrami komórkowymi i stwierdziliśmy, że 60-80% frakcji stanowią nienaruszone jądra, około 10% mitochondria, a reszta to zanieczyszczenia. Dodatkowo, z naszego poprzedniego badania nad populacją nienaruszonych jąder wiemy, że choć wiele miofilamentów nie ulega wzbogaceniu w tym protokole (w tym tubulina i aktyna, mierzone metodą Western), niektóre białka (calsarcin-1) są wzbogacone, co sugeruje rzeczywistą biologiczną obecność tych białek w jądrach komórek serca.19

Dodatkowo porównaliśmy białka zidentyfikowane w frakcji chromatyny ekstrahowanej kwasem z ich przewidywanymi funkcjami na podstawie ontologii genów. Ważne jest to, że analiza ontologii genów nie uwzględnia względnej liczności poszczególnych białek (w przeciwieństwie do naszych danych z Western blot), lecz traktuje wszystkie zidentyfikowane białka (wzbogacone lub nie) jako równoważne podczas określania wspólnych szlaków i przedziałów komórkowych. Analizę tych szlaków i przedziałów komórkowych można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach.18,20 Co najważniejsze, sukces wzbogacenia frakcji chromatyny ekstrahowanej kwasem pozwolił nam zidentyfikować obecność 54 wariantów histonów w dojrzałym miocycie mysim,18 z których wiele opierało się na jednym unikalnym peptydzie w celu identyfikacji, a zatem prawdopodobnie nie byłyby one wykrywalne bez tego protokołu wzbogacania, biorąc pod uwagę ogromną złożoność całkowitego proteomu kardiomiocytów. Z 1 048 białek zidentyfikowanych w jądrach komórek serca 56 z nich (5,3%) zostało przypisanych w analizie GO do nukleosomu (jednego z interesujących nas komponentów jądra). Inne badanie obejmujące całe serce zidentyfikowało 6 180 białek, z których tylko 11 białek (0,18%) zostało przypisanych do nukleosomu21. To dodatkowo ilustruje skuteczność naszego protokołu w znaczącym wzbogacaniu białek jądrowych.

5. Żel białkowy i enzymatyczne trawienie białek

Białka są rozdzielane za pomocą jednowymiarowej elektroforezy SDS-PAGE, a następnie trawione trypsyną w celu analizy spektrometrem mas.

  1. OdprgetSystemService próbki na lodzie i wyznaczyć stężenie białka dla każdej próbki, stosując test białkowy z kwasem bicinchoninowym (BCA).
  2. Rozcieńczyć próbki do znanego stężenia, używając buforu Laemmliego 5x, gotować przez 10 min i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu przeprowadzenia jednowymiarowej elektroforezy SDS-PAGE. Próbki przeznaczone do żeli dwuwymiarowych rozcieńczyć do znanego stężenia, używając buforu do ekstrakcji mocznikiem, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przeprowadzić elektroforezę na wybranym żelu, nakładając równą ilość białka do każdej studni. Białko można przenieść na membranę nitrocelulozową do zastosowania w technice Western blotting (podobnie jak w przypadku kontroli w kroku 4.1) lub wyciąć prążki w celu analizy spektrometrią masową; patrz kolejne kroki.
  4. Wyjąć żel z aparatury, używając wody dejonizowanej, i przenieść go do czystego pojemnika. Przykryć żel barwnikiem Oriole i owinąć pojemnik folią aluminiową, aby zablokować dostęp światła. Inkubować żel w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez co najmniej 90 min.
  5. Wykonać obrazowanie żelu zabarwionego barwnikiem Oriole (Rycina 3) przy użyciu światła UV i zaznaczyć na obrazie miejsca, w których prążki zostaną wycięte. W badaniach nad całkowitym proteomem każdą ścieżkę dzielimy na około 25 prążków o szerokości 2 mm.
  6. Położyć żel na czystej powierzchni. Używać wyłącznie materiałów, które były szczelnie zamknięte lub zostały spryskane etanolem, aby zapobiec kontaminacji keratyną. Wyciąć każdy prążek, a następnie podzielić go na 3 równe części. Wszystkie trzy części każdego prążka umieścić razem w osobnej, opisanej probówce 1,5 ml. Fragmenty żelu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  7. Przygotować plugi żelowe do trawienia enzymatycznego. Trawić fragmenty żelu trypsyną w temperaturze 37 °C przez noc. Szczegółowy protokół przygotowania próbek żelowych znajduje się w naszej poprzedniej publikacji.22 W przypadku prążków o niskiej masie cząsteczkowej można zastosować chymotrypsynę zamiast trypsyny, aby uniknąć rozległego cięcia ogonów histonowych przez trypsynę.

6. Spektrometria mas i analiza danych

Próbki są rozdzielane za pomocą LC i analizowane metodą MS/MS. Widma są przeszukiwane w bazie danych białek w celu identyfikacji białek.

  1. Przeanalizuj 10 μl każdej próbki za pomocą LC/MS/MS. Stosujemy nano-przepływowy system Eskigent LC z kolumną odwrotnej fazy 75 μm. Wykorzystaj program analizy LC zoptymalizowany dla szerokiego zakresu białek i peptydów. Zastosuj gradient liniowy od fazy ruchomej A (0,1% kwasu mrówkowego, 2% acetonitrylu [ACN] w wodzie) do fazy ruchomej B (0,1% kwasu mrówkowego, 20% wody w ACN): 60 min od 5% fazy B do 50% B, następnie 15 min od 50% B do 95% B i na koniec 10 min przy stałym stężeniu 95% B. Ustaw prędkość przepływu na 200 nl/min. Pozyskaj dane spektrometrii mas w trybie zależnym od danych (data-dependent). Używamy urządzenia Thermo Orbitrap, które fragmentuje 6 najliczniejszych jonów prekursorowych.
  2. Powtórz analizy dla co najmniej trzech powtórzeń biologicznych i dwóch technicznych. (Zalecane)
  3. Użyj oprogramowania (dostępne komercyjnie opcje to BioWorks i Xcalibur; dostępne publicznie to PROWL, X!Tandem, SpectraST), aby przeszukać widma w wybranej bazie danych Uniprot za pomocą algorytmu wyszukiwania (takiego jak SEQUEST lub MASCOT).
  4. Rozważ modyfikację parametrów wyszukiwania, aby uwzględnić karbamidometylowanie cysteiny oraz utlenianie metioniny – dwie częste modyfikacje powstające podczas przygotowania próbek.
  5. Oblicz wskaźnik wyników fałszywie dodatnich, stosując przeszukiwanie w odwróconej bazie danych.
  6. Przefiltruj identyfikacje białek, akceptując jedynie dopasowania spełniające określony próg pewności. Na początek zalecamy następujące parametry: Xcorr >3 (+2), >4 (+3), >5 (+4); deltaCN >0,1, consensus score ≥20, tolerancja masy 2 Da dla jonu prekursorowego, tolerancja masy 0,5 Da dla jonu produktowego, co najmniej 2 unikalne peptydy na białko i nie więcej niż 3 pominięte cięcia.

7. Kwantyfikacja bez użycia znaczników

Wyznacz względną zawartość białek, stosując ilościowe oznaczanie bez użycia znaczników (Rysunek 4).

  1. Liczba programów komputerowych, dostępnych publicznie lub komercyjnie do bezetykietowego oznaczania ilościowego danych ze spektrometrii mas, obejmuje m.in. Census (grupa prof. Yatesa),23 Elucidator (Microsoft),24 SIEVE (Thermo Scientific),25 Scaffold (Proteome Software).26 Programy te mają na celu skorelowanie sygnału spektrometrycznego nienaruszonych peptydów lub liczby zdarzeń sekwencjonowania peptydów z względnymi ilościami białek pomiędzy dwoma lub więcej stanami.
  2. Mimo że każdy program wykorzystuje podobny schemat analizy, niektóre z nich są ograniczone do określonych typów analizy, które można przeprowadzić na danych. Początkowo dane z różnych pomiarów są wyrównywane, intensywność sygnału jest normalizowana, a piki peptydowe są wybierane do analizy.
  3. Dwiema najczęstszymi metodami są oznaczanie ilościowe oparte na zliczaniu widm (spectral counting) lub na polu powierzchni piku LC-MS. Oblicza się stosunki obfitości, aby określić zmiany w obfitości peptydów pomiędzy różnymi grupami.
  4. Programy te mogą być integrowane z algorytmami przeszukiwania proteomicznego (Mascot, Sequest, X!Tandem) w celu skorelowania informacji ilościowych z identyfikacją białek.
  5. Aby zapewnić dokładność i odtwarzalność danych, kluczowe jest uwzględnienie zarówno powtórzeń biologicznych (różne próbki eksperymentalne), jak i technicznych (wielokrotne analizowanie tej samej próbki na spektrometrze mas) w danych spektrometrycznych.
  6. Zmienność obfitości peptydów w obrębie i pomiędzy warunkami eksperymentalnymi można ocenić za pomocą analizy ANOVA i przedstawić za pomocą PCA (Rysunek 5).

Ważne uwagi dotyczące kwantyfikacji bez użycia znaczników. Podczas przeprowadzania kwantyfikacji bez użycia znaczników należy zwrócić szczególną uwagę na zapewnienie spójnego przygotowania próbek, czasu trawienia oraz warunków LC-MS/MS, ponieważ każda próbka musi być przetwarzana i analizowana osobno. W przeciwieństwie do metod znakowania metabolicznego, porównania w eksperymentach bezużycia znaczników wykonuje się na podstawie danych z odrębnych pomiarów spektrometrycznych (ponieważ brak znakowania wyklucza możliwość ich wspólnego analizowania), co wymaga wysokiej powtarzalności we wszystkich aspektach analizy próbek (tzn. w etapach przygotowania próbek, LC oraz MS) oraz zastosowania spektrometrów mas o wysokiej dokładności pomiaru.

Aby uwzględnić niewielkie różnice w przygotowaniu i analizie próbek, do każdej próbki można dodać znany standard, który pomoże w normalizacji danych. Ponadto większość programów komputerowych umożliwia normalizację intensywności sygnału (np. poprzez korektę względem szumu tła lub znanego, obfitego anality) po akwizycji danych, co pozwala na skorygowanie różnic w wtrysku, jonizacji i fragmentacji. W większości wyżej wspomnianych programów istnieją algorytmy dopasowania, które pomagają korygować różnice w profilach elucji peptydów. Stosowanie replikatów biologicznych i technicznych jest niezbędne w tego typu badaniach, ponieważ pozwala na przeprowadzenie analiz statystycznych potwierdzających powtarzalność i spójność wszelkich obserwowanych zmian w obfitości białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4 podkreśla użyteczność tej formy kwantyfikacji względnej. Na lewym panelu przedstawiono poszczególne monizotopowe piki peptydowe (nałożone z różnych myszy), które zostały przypisane do białka HMGB1 (zidentyfikowanego poprzez przeszukiwanie bazy danych). Każdy pik, będący w istocie chromatogramem jonów wyekstrahowanych dla danego peptydu, pochodzi z innej myszy. Grupy reprezentują trzy różne stany fizjologiczne: podstawowy, przerost serca oraz niewydolność serca, przy trzech powtórzeniach biologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniej opisano dwie główne metody izolacji jąder komórkowych:27 pierwszą jest technika Behrensa, polegająca na homogenizacji liofilizowanej tkanki w rozpuszczalniku nie wodnym, a drugą, której modyfikację stosujemy w niniejszej pracy, jest homogenizacja tkanki w wodnym roztworze sacharozy/soli, a następnie centryfugacja różnicowa lub w gradiencie gęstości.

Subfrakcjonowanie jąder komórkowych poprzez ekstrakcję kwasową z próbek tkanek jest istotnym narzędziem badania chromatyny, s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Laboratorium Vondriski jest wspierane przez granty z National Heart, Lung and Blood Institute NIH oraz Laubisch Endowment na UCLA. EM jest laureatem stypendium Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship in Physiology na UCLA; HC jest laureatem stypendium American Heart Association Pre-doctoral Fellowship; MP jest laureatem stypendium NIH Ruth Kirschstein Post-doctoral Fellowship; a SF jest laureatem nagrody NIH K99 Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka Dulbecco Modified Eagle MediumInvitrogen11965
Pelet proteazyRoche04 693 159 001
Sito 100 μmBD Falcon352360
Ultramikrotom UltracutReichert
transmisyjny mikroskop elektronowy 100CX
JEOL USA, Inc.
OrioleBioRad161-0496
Przeciwciało przeciwko histonie H2ASanta Cruzsc-8648
Przeciwciało przeciwko nukleoporynie p62BD Biosciences610498
Przeciwciało przeciwko transporterowi nukleotydów adeninowychSanta Cruzsc-9299
Przeciwciało przeciwko BiPSanta Cruzsc-1050
Przeciwciało przeciwko tubulinieSigmaT1568
Przeciwciało przeciwko histonie H3Abcamab1791
Przeciwciało przeciwko fibrylarynieCell SignalingC12C3
Przeciwciało przeciwko SNRP70Abcamab51266
Przeciwciało przeciwko E2F-1Thermo FisherMS-879
Przeciwciało przeciwko białku retinoblastomaBD Biosciences554136
Przeciwciało przeciwko czynnikowi indukowanemu hipoksją 1 (HIF-1)Novus BiologicalsNB100-469
Test białka BCAThermo Scientific23227
Kolumna do chromatografii w fazie odwróconejNew ObjectivePFC7515-B14-10
Przeglądarka BioWorksThermo Scientific

Bibliografia

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
  3. Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
  4. Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
  5. Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
  6. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
  7. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
  8. Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
  9. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  10. Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
  11. Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
  12. Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
  13. Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
  14. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  15. Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  16. Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
  17. Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
  18. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
  19. Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
  20. Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
  21. Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
  22. Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).
  23. Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
  24. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
  25. Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
  26. Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
  27. Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
  28. Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
  29. Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).
  30. Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
  31. Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
  32. Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
  33. Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
  34. Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
  35. Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
  36. Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
  37. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
  38. Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
  39. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza proteomu chromatynywzbogacanie frakcji j drowej sercasubfrakcjonowanie j drowebezetykietowa spektrometria masekstrakcja histon wproteomika ilo ciowapor wnanie stan w chorobowychprofilowanie proteomu j drowegobia ka wi ce chromatynj dra kom rek serca myszy
Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.