Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Emma Monte; Haodong Chen; Maria Kolmakova; Michelle Parvatiyar; Thomas M. Vondriska; Sarah Franklin

doi:10.3791/4294

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4294

⸱

28 grudnia 2012

Emma Monte¹ , Haodong Chen¹ , Maria Kolmakova¹ , Michelle Parvatiyar¹ , Thomas M. Vondriska¹^,²^,³ , Sarah Franklin¹^,⁴

¹Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, ³Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁴Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Streszczenie

W jądrze komórkowym znajdują się proteomy, których funkcje są najściślej powiązane z regulacją genów. Jądra kardiomiocytów dorosłych ssaków są wyjątkowe ze względu na wysoki odsetek komórek dwuukładowych,¹ przeważająco heterochromatyczny stan DNA oraz niedzielący się charakter kardiomiocytów, co sprawia, że dojrzałe jądra znajdują się w permanentnym stanie interfazy.² Regulacja transkrypcyjna podczas rozwoju i w przebiegu chorób była w tym organie dobrze zbadana,^3-5 jednak pozostaje stosunkowo nieodkryta rola białek jądrowych odpowiedzialnych za pakowanie i ekspresję DNA oraz sposób, w jaki białka te kontrolują zmiany w programach transkrypcyjnych występujące podczas choroby.⁶ W krajach rozwiniętych choroby serca są główną przyczyną śmiertelności zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet.⁷ Zrozumienie, w jaki sposób białka jądrowe współpracują w celu regulowania progresji tych schorzeń, jest kluczowe dla rozwoju obecnych opcji terapeutycznych.

Spektrometria mas jest idealnym narzędziem do odpowiedzi na te pytania, ponieważ umożliwia bezstronną adnotację proteomu jądrowego oraz kwantyfikację względną zmian w obfitości tych białek w przebiegu choroby. Choć przeprowadzono kilka badań proteomicznych kompleksów białek jądrowych ssaków,^8-13 do niedawna¹⁴ istniało tylko jedno badanie analizujące proteom jądra komórek serca, które obejmowało ono całe jądro, zamiast badać proteom na poziomie podprzedziałów jądrowych.¹⁵ W dużej mierze ten brak prac wynika z trudności w izolacji jąder komórek serca. Jądra te znajdują się w obrębie sztywnego i gęstego aparatu aktynowo-miozynowego, z którym są połączone za pomocą licznych wypustek siateczki śródplazmatycznej, do tego stopnia, że skurcz miocytów zmienia ich ogólny kształt.¹⁶ Dodatkowo kardiomiocyty składają się w 40% objętościowo z mitochondriów,¹⁷ co wymaga wzbogacenia frakcji jąder w celu oddzielenia ich od pozostałych organelli. W niniejszej pracy opisujemy protokół wzbogacania jąder komórek serca i ich dalszego frakcjonowania na biologicznie istotne przedziały. Ponadto szczegółowo omawiamy metody bezetykietowej ilościowej analizy spektrometrycznej tych frakcji – techniki te nadają się do eksperymentów in vivo w różnych modelach zwierzęcych i układach organów, w których znakowanie metaboliczne nie jest możliwe.

Protokół

Przebieg eksperymentu składa się z siedmiu głównych etapów (Rysunek 1). Podczas wszelkich prac z próbkami, które będą analizowane za pomocą spektrometru mas, osoba przeprowadzająca badanie powinna nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz siatkę na włosy, dbając o uniknięcie zanieczyszczeń kurzem i złuszczonym naskórkiem (keratyną).

1. Homogenizacja serca i izolacja jąder

Serca myszy poddaje się homogenizacji, a następnie izoluje się osad nienaruszonych jąder komórkowych (Rycina 2).

Uśmiercić dorosłą mysz, wyciąć serce, wypłukać w lodowatym PBS i homogenizować na l....