Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Elizabeth Hussa; Heidi Goodrich-Blair

doi:10.3791/4295

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4295

⸱

11 grudnia 2012

Elizabeth Hussa¹ , Heidi Goodrich-Blair¹

¹Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj metoda wykorzystuje bezpośrednią iniekcję bakterii entomopatogennych do hemocelu larw owada Manduca sexta. M. sexta jest owadem dostępnym komercyjnie i dobrze przebadanym. W związku z tym metoda ta stanowi proste podejście do analizy interakcji gospodarz-bakteria z perspektywy jednego lub obu partnerów.

Streszczenie

Manduca sexta, znana powszechnie jako omacnica tytoniowa, jest uważana za istotnego szkodnika rolniczego, żerującego na roślinach psiankowatych, w tym na tytoniu i pomidorach. Podatność larw M. sexta na szereg entomopatogennych gatunków bakterii^1-5, a także bogactwo dostępnych informacji na temat układu odpornościowego tego owada^6-8 oraz oczekiwana sekwencja genomu⁹ sprawiają, że jest on dobrym organizmem modelowym do badania interakcji gospodarz-mikrob podczas patogenezy. Ponadto larwy M. sexta są stosunkowo duże, łatwe w manipulacji i utrzymaniu w warunkach laboratoryjnych w porównaniu z innymi podatnymi gatunkami owadów. Ich duży rozmiar ułatwia również efektywną ekstrakcję tkanek/hemolimfy w celu analizy odpowiedzi gospodarza na infekcję.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy opisuje bezpośrednie wstrzykiwanie bakterii do hemocelu (jamni krwi) larw M. sexta . Podejście to można wykorzystać do analizy i porównania charakterystyki wirulencji różnych gatunków, szczepów lub mutantów bakterii poprzez proste monitorowanie czasu do śmierci owada po iniekcji. Metoda ta została opracowana w celu zbadania patogenności gatunków Xenorhabdus oraz Photorhabdus , które zazwyczaj wiążą się z wektorami z rodzaju nicieni, aby uzyskać dostęp do organizmu owada. Nicienie entomopatogenne zazwyczaj infekują larwy poprzez naturalne otwory pokarmowe lub oddechowe, a następnie uwalniają symbiotyczne bakterie do hemolimfy (krwi) owada¹⁰. Opisana tutaj metoda iniekcji eliminuje konieczność stosowania wektora w postaci nicienia, oddzielając tym samym wpływ bakterii i nicieni na owada. Metoda ta pozwala na dokładne wyliczenie materiału zakaźnego (komórek lub białka) w inokulum, co nie jest możliwe przy zastosowaniu innych istniejących metod analizy entomopatogenezy, w tym metody nacinania¹¹ oraz testów toksyczności doustnej¹². Ponadto testy toksyczności doustnej odnoszą się do wirulencji wydzielanych toksyn wprowadzanych do układu pokarmowego larw, podczas gdy metoda bezpośredniej iniekcji pozwala ocenić wirulencję inokulum w postaci całych komórek.

Użyteczność metody bezpośredniej iniekcji, opisanej w niniejszym opracowaniu, polega na analizie patogenezy bakteryjnej poprzez monitorowanie śmiertelności owadów. Metodę tę można jednak łatwo rozszerzyć w celu badania wpływu infekcji na układ odpornościowy M. sexta. Owad reaguje na infekcję zarówno poprzez odpowiedzi humoralne, jak i komórkowe. Odpowiedź humoralna obejmuje rozpoznawanie wzorców związanych z bakteriami i następującą po nim produkcję różnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych⁷; ekspresję genów kodujących te peptydy można monitorować po bezpośredniej infekcji poprzez ekstrakcję RNA i ilościowy PCR¹³. Komórkowa odpowiedź na infekcję obejmuje tworzenie guzków, enkapsulację i fagocytozę czynników zakaźnych przez hemocyty⁶. Aby przeanalizować te odpowiedzi, zainfekowane owady można poddać sekcji i ocenić za pomocą mikroskopii^{13, 14}.

Protokół

1. Sterylizacja i hodowla jaj owadów

Przygotować pożywkę, najpierw autoklawując 15 g dostarczonego agaru w 900-1000 ml H₂O. Bezpośrednio po autoklawowaniu wymieszać z 166 g pożywki z zarodkami pszenicy i dokładnie zmiksować w blenderze laboratoryjnym. Przelać do naczynia (lub naczyń) w celu schłodzenia, następnie przenieść pożywkę na folię aluminiową, szczelnie zawinąć i przechowywać w temperaturze 4 °C.
Po otrzymaniu jaj M. sexta, wysterylizować je za pomocą 250 ml 0,6% roztworu wybielacza przez 2-3 min w aparaturze składającej się ze szklanego uchwytu do filtrów i kolby próżniowej z papierem filtrującym o średnicy 90 mm, okresowo mieszając.
Włączyć pompę próżniową, aby odprowadzić roztwór wybielacza, a następnie przemyć jaja 3-4 razy, używając za każdym razem 250 ml sterylnej wody destylowanej H₂O.
Przenieść jaja na świeży papier filtrujący o średnicy 90 mm umieszczony w pokrywce szalki Petriego i pozostawić do wyschnięcia, aż przestaną się do siebie kleić (około 20-30 min).
Przenieść jaja na dno plastikowych pojemników z pożywką dla owadów, umieszczając około 40 jaj w każdym pojemniku (Rycina 1A). Jaja należy oddzielić od pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybiczemu wywołanemu przez wilgoć. Przechowywać jaja w temperaturze 26 °C przy fotoperiodzie 16 h światła : 8 h ciemności. Przed wykluciem jaja zmienią kolor na żółto-biały.
Po zakończeniu wykluwania ostrożnie przenieść około 25 larw do nowych pojemników z pożywką na dnie (Rycina 1B). Ważne jest, aby chwytać każdą larwę pęsetą za długi czarny róg, aby uniknąć ich uszkodzenia podczas wczesnych, delikatnych stadiów rozwojowych. Inkubować przez 2 dni w warunkach opisanych powyżej. Choć śmierć larw na tym etapie jest rzadka, mogą zaobserwować niektóre osobniki martwe lub, co bardziej prawdopodobne, zahamowane w rozwoju. Takie owady należy wykluczyć z dalszych badań i uśmiercić poprzez zamrożenie.
Aby uniknąć kanibalizmu, przenieść larwy do indywidualnych pojemników z niewielkimi porcjami pokarmu (Rycina 1C) i inkubować jak wyżej. Monitorować rozwój owadów, wymieniając pokarm i usuwając odchody z pojemników co drugi dzień, aż do trzeciego linienia larwalnego (zazwyczaj 6-9 dni po wykluciu). Jest to stadium 4^go stadium larwalnego, charakteryzujące się pojawieniem się czarnych, haczykowatych kroczków (crochets) na każdej nodze brzusznej oraz wyraźniejszymi pasami wzdłuż ciała owada (Rycina 1D). Larwy mogą znacznie różnić się rozmiarem, ale zazwyczaj ważą 0,15-0,4 g w momencie wejścia w 4^te stadium. Do iniekcji należy wybrać larwy o podobnej wielkości.

2. Przygotowanie bakterii do iniekcji

Hodować badane szczepy bakteryjne zgodnie ze standardowymi procedurami do fazy wzrostu, którą zamierza się poddać badaniu.
Zeskupić 500 μl każdego badanego szczepu bakteryjnego poprzez wirowanie przez 2 min w mikrowirówce przy 13,000 rpm w temperaturze pokojowej.
Resuspender komórki w 1 ml sterylnego 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie ponownie zeskupić zgodnie z powyższą procedurą.
Resuspender komórki w 0,5 ml sterylnego 1x PBS i zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny. W razie potrzeby rozcieńczyć wszystkie zawiesiny do tej samej wartości OD. Jeśli jest to preferowane, do resuspensji i rozcieńczania komórek zamiast 1x PBS można użyć sterylnych pożywek wzrostowych.

3. Iniekcja larw w 4^tym stadium rozwojowym

Przygotować seryjne rozcieńczenia 10-krotne pierwszego szczepu bakterii w 6 dołkach płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej w sterylnym 1x PBS, używając nowej końcówki pipety do każdego rozcieńczenia (Rycina 2A). Końcowa objętość zawiesiny komórkowej w każdym dołku powinna przekraczać objętość wymaganą do iniekcji (10 μl na owada) plus 20 μl na wysianie inokulum (patrz kroki 3.2 i 3.7).
Nanieść po 10 μl dla 5 rozcieńczeń (od 10^-2 do 10^-6) wzdłuż górnej krawędzi szalki Petriego zawierającej odpowiednią pożywkę wzrostową. Przechylić szalkę tak, aby krople rozprzestrzeniły się w kierunku środka (Rycina 2B).
Usunąć pokarm i odchody owadów, a następnie umieścić owady w pojemnikach na lodzie na około 5 min.
Zsterylizować igłę strzykawki, płucząc ją 3 razy w każdej z 2 probówek z 70-100% etanolem, a następnie raz w probówce ze sterylną H₂O (Rycina 2C). Objętość cieczy musi być wystarczająca, aby całkowicie zanurzyć igłę.
Oznaczyć ilość komórek w rozcieńczonych zawiesinach pod mikroskopem przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). W zależności od pożądanego inokulum, pobrać 10 μl z odpowiedniego dołka płytki mikrotitracyjnej (Rycina 2D).
Przetrzeć powierzchnię owada 95% etanolem i wstrzyknąć 10 ml zawiesiny komórkowej do owada pod kątem (mniejszym niż 45°) za jedną z odnóży brzusznych. Należy uważać, aby nie przebić jelita i wstrzyknąć zawartość tuż pod warstwę epidermy (Rycina 2E). Chociaż pewna utrata hemolimfy (przezroczysty, zielono-niebieski płyn) jest normalna, pojawienie się materii cząsteczkowej i żółtego płynu w miejscu iniekcji świadczy o przebiciu jelita. W takim przypadku należy uśmiercić owada i pobrać nową larwę na jego zastąpienie.
Powtórzyć krok 3.6 dla każdego pozostałego owada w pierwszej grupie iniekcyjnej. Sterylizacja igły nie jest konieczna między owadami iniekowanymi tym samym rozcieńczeniem i szczepem bakterii, chyba że dojdzie do zanieczyszczenia. Alternatywnie, w celu uzyskania większej spójności objętości iniekcji między próbkami, można zastosować dozownik wielokrotny.
Po iniekcji każdego owada pierwszym szczepem bakterii powtórzyć krok 3.2, tym razem nanosząc zawiesiny komórkowe na środku szalki i pozwalając im spłynąć w dół (Rycina 2F). Inkubować szalki w odpowiedniej temperaturze i przeliczyć kolonie, aby określić liczbę komórek w inokulum. Ten drugi etap wysiewu służy do weryfikacji, czy próbki nie zostały zanieczyszczone podczas procesu iniekcji, co objawiłoby się rozbieżnością w liczbie kolonii między pierwszym a drugim wysiewem.
Powtórzyć kroki od 3.1 do 3.8 dla każdego szczepu bakterii w eksperymencie. Na koniec wstrzyknąć 3-5 owadom sterylną 1x PBS za pomocą sterylnej igły jako grupę kontrolną negatywną. Inkubować owady w temperaturze 26 °C z fotoperiodem 16 h światła : 8 h ciemności.
Monitorować przeżywalność owadów w czasie po iniekcji. Śmierć owada definiuje się jako brak ruchów dobrowolnych po stymulacji. Owady podczas infekcji przed śmiercią często wykazują utratę apetytu, biegunkę (wodniste, żółte odchody) i/lub utratę wody („pocenie się”); cechy te również mogą być warto odnotować.