Wizualizacja bakterii w nicieniach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

Aby zbadać wzajemność między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wśród nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować do innych systemów, polega na inżynierii bakterii w celu ekspresji białka zielonej fluorescencji i wizualizacji za pomocą bakterii z mikroskopii fluorescencyjnej w przezroczystym nicieniu.

Abstract

Symbiozy, czyli wspólne życie dwóch lub więcej organizmów, są szeroko rozpowszechnione we wszystkich królestwach życia. Jako dwa z najbardziej wszechobecnych organizmów na ziemi, nicienie i bakterie tworzą szeroką gamę symbiotycznych związków, które wahają się od korzystnych do patogennych ^1-3. Jednym z takich powiązań jest wzajemnie korzystny związek między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, który wyłonił się jako modelowy system symbiozy ⁴. Nicienie Steinernema są entomopatogeniczne, wykorzystują swój symbiont bakteryjny do zabijania owadów ⁵. W celu przeniesienia między żywicielami owadów bakterie kolonizują jelito zakaźnego młodzieńczego stadium ^6-8 nicienia. Ostatnio wykazano, że kilka innych gatunków nicieni wykorzystuje bakterie do zabijania owadów ^9-13 i rozpoczęto badania nad interakcjami między nicieniami a bakteriami w tych systemach ⁹.

Opisujemy metodę wizualizacji symbionta bakteryjnego wewnątrz lub na gospodarzu nicieni, wykorzystując przezroczystość optyczną nicieni oglądaną przez mikroskopię. Bakterie są zaprojektowane tak, aby wyrażały białko fluorescencyjne, co pozwala na ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dostępnych jest wiele plazmidów, które przenoszą geny kodujące białka, które fluoryzują na różnych długościach fal (tj. zielonym lub czerwonym), a koniugacja plazmidów ze szczepu Escherichia coli dawcy z symbiontem bakteryjnym biorcy jest skuteczna dla szerokiego zakresu bakterii. Opisane metody zostały opracowane w celu zbadania związku między Steinernema carpocapsae a Xenorhabdus nematophila ¹⁴. Podobne metody zastosowano do zbadania innych związków nicieni ^z bakteriami ^9,15-18i dlatego podejście to ma ogólne zastosowanie.

Metoda pozwala na scharakteryzowanie obecności i lokalizacji bakterii w obrębie nicieni na różnych etapach rozwoju, dostarczając wglądu w naturę związku i proces kolonizacji 14,16,19. Analiza mikroskopowa ujawnia zarówno częstość kolonizacji w populacji, jak i lokalizację bakterii w tkankach gospodarza 14,16,19-21. Jest to przewaga nad innymi metodami monitorowania bakterii w populacjach nicieni, takimi jak sonikacja ²²lub mielenie ²³, które mogą zapewnić średni poziom kolonizacji, ale mogą nie mogą na przykład dyskryminować populacji o wysokiej częstości niskich ładunków symbiontów od populacji o niskiej częstotliwości wysokich ładunków symbiontów. Rozróżnianie częstotliwości i obciążenia bakteriami kolonizującymi może być szczególnie ważne podczas badań przesiewowych lub charakteryzowania mutantów bakteryjnych pod kątem fenotypów kolonizacji ^21,24. Rzeczywiście, mikroskopia fluorescencyjna została wykorzystana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych mutantów bakteryjnych pod kątem wad kolonizacji ^17,18 i jest mniej pracochłonna niż inne metody, w tym sonikacja 22,25-27 i indywidualna sekcja nicieni ^28,29.

Protocol

1. Budowa fluorescencyjnego szczepu bakterii poprzez koniugację

1. Hoduj szczep biorcy (symbiont do zbadania) i szczep dawcy przez noc. Szczep dawcy, zwykle Escherichia coli, powinien być zdolny do oddawania DNA poprzez koniugację i powinien być przekształcany za pomocą plazmidu (Tabela 2), który zawiera gen kodujący białko fluorescencyjne. W zależności od plazmidu może być również wymagany szczep pomocniczy do koniugacji. Jeśli tak, to odmiana ta powinna być również uprawiana przez noc. Szczep dawcy i szczep pomocniczy powinny być hodowane z antybiotykami, aby wybrać do utrzymania plazmidu.
2. Subkultura dawcy, pomocnika i bi....

Discussion

Opisany tutaj protokół przedstawia metodę optycznego wykrywania bakterii w żywicielu nicieni (ryc. 1). Metoda ta wykorzystuje przezroczystość optyczną nicieni i zdolność do fluorescencyjnego znakowania bakterii, umożliwiając analizę in vivo bakterii w gospodarzu nicieni (ryc. 3). W szczególności podejście to identyfikuje lokalizację bakterii w obrębie gospodarza. Licząc populację nicieni i oceniając obecność bakterii, można określić częstość kolonizacji bakterii w całej populacj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar lipidowy (sterylny)			8 gramów bulionu odżywczego, 15 gramów agaru, 5 gramów ekstraktu drożdżowego, 890 ml wody, 10 ml 0,2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml roztworu syropu kukurydzianego*, 4 ml oleju kukurydzianego* Mieszaj pożywkę, wlewając talerze *dodaj sterylny składnik po autoklawowaniu
Roztwór syropu kukurydzianego (sterylny)			7 ml syropu kukurydzianego, 89 ml wody wymieszać i autoklawu
Roztwór			16,6 ml 12% podchlorynu sodu, 5 ml 5M KOH, 80 ml wody
Rosół lizogeniczny (sterylny)			5 gramów ekstraktu drożdżowego, 10 gramów tryptonu, 5 gramów soli, 1 l wody mieszanki i autoklawu
Microfuge	Fisher	13-100-675	Każda mikrofuga, która zawiera probówki do mikrofuge, będzie działać
Wirówka	Beckman	366802	Duża wirówka stołowa mieszcząca stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50
ml Sterylna szalka Petriego 60 mm X 15 mm
50 ml	Fisher	05-539-6
Probówki wirówkowe 15 ml	Fisher	05-531-6
Sterylna szalka Petriego 100 mm X 20 mm	Fisher	0875711Z	Głębsze niż standardowe szalki Petriego
Mikroskop 24-dołkowy	Greiner Bio-One	662000-06
			Mikroskop wymaga możliwości fluorescencyjnych kompatybilnych z Twoim fluoroforem
Paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710
PBS (sterylny)			8 g NaCL 0,2 g KCL 1,44 g Na2HPO4 0,24 g KH2PO4 1 l wody Dostosować do pH 7,4 i wody do 1 l i autoklaw
Probówki do mikrofug	Fisher	05-408-138	Probówki 2 ml lub 1,5 ml
Wytrząsarka			Każdy shaker, który powoduje delikatne poruszanie się cieczy, będzie działał
Kwas diminopimeliczny	Sigma	D-1377	W razie potrzeby uzupełnij pożywkę do stężenia lub 1 mM