Artykuł metodologiczny

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4298

⸱

19 października 2012

 ,  , 
1Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Symbiozy, czyli wspólne bytowanie dwóch lub więcej organizmów, są rozpowszechnione we wszystkich królestwach życia. Jako jedne z najpowszechniejszych organizmów na ziemi, nicienie i bakterie tworzą szeroki wachlarz powiązań symbiotycznych, które wahają się od korzystnych do patogennych 1-3. Takim powiązaniem jest wzajemnie korzystna relacja między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, która stała się systemem modelowym symbiozy 4. Nicienie Steinernema są entomopatogenne i wykorzystują swojego bakteryjnego symbionta do zabijania owadów 5. W celu transmisji między gospodarzami owadami, bakterie kolonizują jelita nicieni w stadium zakaźnego młodego osobnika 6-8. Niedawno wykazano, że kilka innych gatunków nicieni również wykorzystuje bakterie do zabijania owadów 9-13, a badania zaczęły obejmować analizę interakcji między nicieniami a bakteriami w tych systemach 9.

Opisujemy metodę wizualizacji symbionta bakteryjnego wewnątrz lub na powierzchni organizmu gospodarza — nicienia, wykorzystując przezroczystość optyczną nicieni w badaniach mikroskopowych. Bakterie są modyfikowane genetycznie w celu ekspresji białka fluorescencyjnego, co umożliwia ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dostępnych jest wiele plazmidów niosących geny kodujące białka fluorescujące przy różnych długościach fal (t.j. zielonych lub czerwonych), a konjugacja plazmidów z donorowego szczepu Escherichia coli do biorcy w postaci symbionta bakteryjnego jest skuteczna dla szerokiego zakresu bakterii. Opisane metody zostały opracowane w celu zbadania powiązań między Steinernema carpocapsae a Xenorhabdus nematophila 14. Podobne metody były stosowane do badania innych powiązań między nicieniami a bakteriami 9,15-18, w związku z czym podejście to ma zastosowanie ogólne.

Metoda ta pozwala na charakterystykę obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni na różnych etapach rozwoju, dostarczając informacji na temat natury tej asocjacji oraz procesu kolonizacji 14,16,19. Analiza mikroskopowa ujawnia zarówno częstotliwość kolonizacji w obrębie populacji, jak i lokalizację bakterii w tkankach gospodarza 14,16,19-21. Stanowi to przewagę nad innymi metodami monitorowania bakterii w populacjach nicieni, takimi jak sonikacja 22 lub rozcieranie 23, które mogą dostarczyć średnich poziomów kolonizacji, ale nie potrafią na przykład odróżnić populacji o wysokiej częstotliwości niskiego obciążenia symbiontami od populacji o niskiej częstotliwości wysokiego obciążenia symbiontami. Rozróżnianie częstotliwości i obciążenia bakterii kolonizujących może być szczególnie istotne podczas przesiewania lub charakterystyki mutantów bakteryjnych pod kątem fenotypów kolonizacji 21,24. Rzeczywiście, mikroskopia fluorescencyjna była wykorzystywana w wysokoprzepustowym przesiewaniu mutantów bakteryjnych w celu wykrycia wad kolonizacji 17,18 i jest mniej pracochłonna niż inne metody, w tym sonikacja 22,25-27 oraz indywidualna sekcja nicieni 28,29.

Protokół

1. Konstrukcja fluorescencyjnego szczepu bakteryjnego poprzez koniugację

  1. Hodować przez noc szczep biorcy (badany symbiont) oraz szczep donora. Szczep donora, zazwyczaj Escherichia coli, powinien być zdolny do przekazywania DNA poprzez konjugację i powinien zostać przekształcony plazmidem (Tabela 2) niosącym gen kodujący białko fluorescencyjne. W zależności od plazmidu może być wymagany również szczep pomocniczy do konjugacji. Jeśli tak, szczep ten również należy hodować przez noc. Szczep donora i szczep pomocniczy należy hodować z dodatkiem antybiotyków, aby zapewnić utrzymanie plazmidu.
  2. Przeszczepić szczepy donora, pomocniczego i biorcy do bogatej pożywki wzrostowej bez antybiotyków w stosunku kultury do pożywki 1:100.
  3. Hodować kultury w temperaturze odpowiedniej dla każdego szczepu, aż osiągną fazę średnio-logarytmiczną wzrostu (OD600~0,6). Dla Xenorhabdus i E. coli ten etap wzrostu jest osiągany około 3 do 4 h po przeszczepieniu. Może to być zmienne w zależności od użytego szczepu lub w niektórych przypadkach plazmidu.
  4. Wymieszać szczepy w probówce do mikrocentryfugi i wirować przez 2 min przy 17 900 x g (13 000 rpm w większości mikrocentryfug). Proporcja donora i biorcy dająca najlepsze wyniki będzie różnić się dla różnych kombinacji i może wymagać empirycznego ustalenia. Dla biorcy Xenorhabdus i donora E. coli stosujemy stosunek 3:1 lub 1:1. Jeśli wymagany jest szczep pomocniczy (np. E. coli), należy go dodać w takim samym stosunku jak donor.
  5. Zlać nadosad.
  6. Resuspendować osad komórkowy w 30 μl świeżej pożywki.
  7. Nanieść zawiesinę punktowo na płytkę z bogatą pożywką bez antybiotyków i pozwolić plamce wyschnąć.
  8. Inkubować płytkę w pozycji odwróconej przez noc, w temperaturze optymalnej dla bakterii biorcy i dopuszczalnej dla donora (oraz szczepu pomocniczego, jeśli dotyczy). Płytka powinna być inkubowana przez co najmniej 18 h.
  9. Zeskrobać naniesioną zawiesinę i wyizolować pojedyncze kolonie metodą smugową na selektywnej płytce z antybiotykiem. Antybiotyki powinny selekcjonować przeciwko donorowi i na rzecz biorcy zawierającego plazmid. Może być konieczne wykonanie jednego lub dwóch dodatkowych pasażów izolacyjnych w celu uzyskania czystej kultury.
  10. Upewnić się, że uzyskane kolonie są symbiontem biorcą, a nie szczepem donora, poprzez badanie obecności fenotypów specyficznych dla biorcy, takich jak morfologia kolonii, lub detekcję genów specyficznych dla biorcy za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Przesieć kolonie w celu sprawdzenia obecności plazmidu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy znanej sekwencji plazmidu oraz fluorescencji. Kolonie powinny fluoresceć pod odpowiednią długością fali odpowiadającą białku fluorescencyjnemu.

2. Produkcja aksenicznych jaj nicieni

  1. Przez noc hodować 5 ml naturalnego bakteryjnego symbionta. Aby rozpocząć hodowlę, bakterie można zaszczepić do bulionu Lysogeny Broth (LB) lub innych pożywek bezpośrednio z zapasu zamrożonego lub z płytki z posiewem pasmowym.
  2. Rozprzestrzenić 600 μl kultury bakteryjnej na płytkach z agarem lipidowym (LA) o średnicy 10 mm 29. Od ośmiu do dziesięciu płytek pozwoli uzyskać wystarczającą liczbę nicieni dla większości gatunków.
  3. Inkubować w ciemności, bez dodatkowej wilgoci, w temperaturze 25 °C przez dwa dni.
  4. Do trawników bakteryjnych dodać 5000 zaraźliwych osobników młodzieńczych nicieni lub osobników w innych stadiach, w zależności od używanego gatunku nicienia, w 500 μl pożywki. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
  5. Sprawdzić płytki pod kątem obecności dorosłych nicieni i jaj. Na szkiełko przedmiotowe nanieść 20 μl wody. Za pomocą sterylnego patyczka zebrać niewielką ilość nicieni z trawnika bakteryjnego. Zanurzyć patyczek w wodzie i pozwolić nicieniom wypłynąć. Obserwować preparat pod niskim powiększeniem. Więcej informacji na temat wyglądu znajduje się w dyskusji oraz w Rysunku 2.
  6. Jeśli widoczne są jaja i samice, kontynuować procedurę; w przeciwnym razie inkubować płytki w temperaturze 25 °C i sprawdzać prawidłowy rozwój co 6-12 h. Gdy samice będą zawierać jaja, wlać kilka ml wody na powierzchnię płytek. Delikatnie zakręcić płytkami i przelać wodę do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Nicienie powinny oddzielić się od płytek i przestać być widoczne na ich powierzchni. Może być konieczne kilkukrotne płukanie.
  7. Pozostawić nicienie do osadzenia się na dnie probówki.
  8. Opłukać nicienie. Odpipetować nadmiar wody z góry probówki. Ponownie napełnić czystą wodą i pozwolić dorosłym nicieniom osadzić się na dnie. Odpipetować nadmiar wody.
  9. Napełnić probówki stożkowe roztworem do izolacji jaj. Po dodaniu roztworu do izolacji jaj czas wszystkich kolejnych kroków z tym roztworem musi być ściśle przestrzegany, aby uzyskać maksymalną wydajność jaj. Inkubować probówki, delikatnie wstrząsając przez dokładnie 10 min. Większość nicieni powinna ulec rozpuszczeniu do końca inkubacji.
  10. Natychmiast odwirować probówki stożkowe przy 1250 x g przez dokładnie 10 min (czas ten obejmuje rozpędzanie wirówki, ale nie obejmuje hamowania do 0 x g. Należy użyć hamulca).
  11. Natychmiast odlać supernatant.
  12. Natychmiast resuspender osad za pomocą pipety, dodając roztwór do izolacji jaj.
  13. Natychmiast napełnić probówkę stożkową roztworem do izolacji jaj i dobrze wymieszać, odwracając 3-5 razy. Następnie natychmiast wirować zgodnie z punktem 2.10.
  14. Natychmiast odlać supernatant.
  15. Resuspender osad w LB za pomocą pipety, przenosząc go do probówki stożkowej o pojemności 15 ml w celu usprawnienia osadzania podczas etapów płukania. LB jest standardem dla gatunków Steinernema. W zależności od nicienia i bakterii można stosować inne bufory (np. minimalne pożywki solne), pamiętając, że bufor nie może szkodzić ani nicieniowi, ani bakterii.
  16. Napełnić probówkę LB i wirować zgodnie z punktem 2.10.
  17. Odlać supernatant i resuspender w LB.
  18. Opłukać nicienie łącznie 3 razy, powtarzając kroki 2.14 i 2.15.
  19. Rozcieńczyć resuspenderowane jaja nicieni do odpowiedniej objętości. Powinno być co najmniej 10 jaj na mikrolitr. Jaja można przechowywać w 6-cm szalce Petriego w 5 ml LB przez co najmniej cztery dni, dodając antybiotyki hamujące wzrost kolonizujących bakterii i owijając płytkę parafilmem. Przed zaszczepieniem na trawniki bakteryjne jaja należy raz wypłukać w 15 ml LB (zgodnie z punktami 2.13 i 2.14). Należy pamiętać, że w tym czasie jaja będą wykluwać się, przez co mogą nie być zsynchronizowane pod względem rozwoju podczas testów kolonizacji.

3. Test współuprawy z bakteriami fluorescencyjnymi

  1. Hodować fluorescencyjne bakterie przez noc, stosując selekcję plazmidu, jeśli jest to konieczne.
  2. Rozprzyszczyć 600 μl hodowli bakteryjnej na płytkach z agarem lipidowym o średnicy 10 mm za pomocą sterylnego patyczka. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 dni.
  3. Nanieść od 500 do 5 000 aksenicznych jaj nicieni w łącznej objętości od 100 do 400 μl (optymalnie 2 000 nicieni w 200 μl) na każdą płytkę z agarem lipidowym.
  4. Inkubować w ciemności, bez dodatkowej wilgoci, w temperaturze 25 °C do czasu powstania IJs lub innych interesujących etapów rozwojowych. IJs będą widoczne jako puszysty biały pierścień na krawędzi płytki. Aby zbadać inne etapy cyklu życiowego, należy zapoznać się z Protokołem 4.
  5. Umieścić płytki w zmodyfikowanej pułapce White'a30. Zdjąć pokrywkę z płytki z agarem lipidowym i umieścić jej dno na spodzie pustej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm. Napełnić dużą szalkę Petriego wodą lub innym buforem odpowiednim dla danego gatunku nicieni, tak aby otoczył on małą płytkę. Poziom wody powinien wynosić około połowy wysokości małej płytki.
  6. Inkubować pułapkę wodną aż do momentu, gdy potomne IJs przedostaną się do buforu.
  7. Infekcyjne młodzieńce (IJs) nicieni można przechowywać w wodzie w kolbie do hodowli tkankowych.

4. Zbieranie wczesnych stadiów rozwojowych do przesiewu

  1. Należy wykonać kroki od 3.1 do 3.4 w celu przygotowania testu.
  2. Inkubować płytki do momentu pojawienia się pożądanych stadiów rozwojowych. W celu określenia czasu trwania może być konieczna codzienna kontrola wizualna. Aby obejrzeć płytki, należy zastosować procedurę opisaną w Protokole 2.5. W przypadku jaj S. carpocapsae hodowanych z X. nematophila na płytkach LA, zapłodnione samice pojawią się w ciągu 4-5 dni, młodzieńce w ciągu 7 dni, a produkcja młodzieńców infekcyjnych rozpocznie się między 15 a 17 dniem.
  3. Po pojawieniu się pożądanych stadiów rozwojowych należy pobrać próbkę. Do dołka płytki 96-dołkowej należy wlać 200 μl PBS lub innego odpowiedniego buforu. Delikatnie zeskrobać część lawns bakteriów zawierającego nicienie. Ilość wielkości ziarnka grochu (~50 mg) zapewni co najmniej kilkaset nicieni po wyprodukowaniu potomstwa F1, jednak w przypadku wcześniejszych punktów czasowych może być wymagana większa ilość. Umieścić patyczek w dołku z buforem.
  4. Inkubować od 30 s do jednej minuty. Wyjąć patyczek i zeskrobać pozostałą pozostałość. Użyć patyczka do usunięcia agaru z dołka. Nicienie powinny być widoczne w buforze. Przenieść mieszaninę buforową do czystej probówki do wirówki.
  5. Potraktować nicienie lewamisolem lub innym środkiem paraliżującym. Rozpuścić kilka ziaren lewamisolu w 30 μl wody. Dodać 1-2 μl tej mieszaniny na każde 50 μl próbki. Po traktowaniu lewamisolem nicienie nie będą żywotne.
  6. Jeśli próbki mają być analizowane w późniejszym terminie, należy je utrwalić zgodnie z opisem w tym kroku. W przeciwnym razie przejść do kroku 4.6. Dodać 200 μl roztworu utrwalającego zawierającego bufor 1X i 4% paraformaldehydu. Delikatnie wymieszać; pipetowanie może spowodować lizę delikatnych stadiów rozwojowych. Przykryć folią i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy niskich obrotach przez co najmniej 18 hr.
  7. Umieścić probówki w statywie i pozwolić nicieniom opaść na dno probówki.
  8. Przepłukać nicienie, aby usunąć tło. Odpipetować nadmiar cieczy, dodać 200 - 500 μl buforu i delikatnie wymieszać. Powtórzyć czynność. W razie potrzeby można powtórzyć ten proces kilka razy, aby dokładniej usunąć tło.
  9. Pozostawić nicienie do opadnięcia na dno probówki i ponownie zawiesić w pożądanej objętości.
  10. Jeśli nicienie nie zostały utrwalone, należy je niezwłocznie przebadać. Utrwalone nicienie można przechowywać w lodówce do dwóch tygodni. Przechowywać w ciemności.

5. Przesiewowe badanie nicieni pod kątem asocjacji bakteryjnej za pomocą mikroskopii

  1. Wybierz kilka nicieni do obserwacji pod mikroskopem, pobierając niewielką próbkę mieszaniny.
  2. Aby upewnić się, że nicienie pozostaną nieruchome podczas fotografowania, potraktuj je środkiem paraliżującym zgodnie z opisem w Protokole 4.5. Jeśli nie wykonujesz zdjęć lub nicienie zostały już utrwalone, ten krok można pominąć.
  3. Nanieś 20-30 μl nicieni w wodzie na szkiełko przedmiotowe i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Wykonaj obserwację całych nicieni za pomocą mikroskopii światła, aby upewnić się, że znajdują się one w polu widzenia.
  5. Obserwuj nicienie, korzystając z ustawień fluorescencyjnych mikroskopu odpowiadających fluorescencji bakterii.
  6. W celu identyfikacji lokalizacji bakterii wykonaj zdjęcia nicienia w ustawieniach fluorescencyjnych oraz w mikroskopii światła, a następnie nałóż obrazy na siebie. Zdjęcia muszą obejmować to samo pole widzenia. Może być konieczne przetestowanie kilku powiększeń i różnych ujęć nicienia, aby zlokalizować bakterie.
  7. Rozprzestrzenienie kolonizacji nicieni można ilościowo określić poprzez zliczenie populacji nicieni, ocenę obecności lub braku bakterii i obliczenie procenta osobników skolonizowanych. Zalecamy liczenie do momentu, aż w każdej kategorii (z kolonizacją lub bez) zostanie zliczonych co najmniej 30 nicieni, aby uzyskać wiarygodną wartość.
  8. W przypadku, gdy skolonizowane są tylko nieliczne nicienie w populacji, konieczne może być przeliczenie kilku tysięcy osobników przed zaobserwowaniem 30 skolonizowanych. W celu przeprowadzenia liczenia wysokoprzepustowego wykonaj następujące kroki.
  9. Zamiast liczyć nicienie pojedynczo, podziel populację na alikwoty w płytce wielodołkowej (np. płytce 24-dołkowej). Po tym, jak nicienie opadną na dno naczynia, każde dołeczki można przeskanować pod mikroskopem i ocenić liczbę skolonizowanych nicieni.
  10. Całkowitą liczbę nicieni w populacji można określić poprzez seryjne rozcieńczenia nicieni w dołeczce. Na przykład do dołeczki można dodać 1 ml zawiesiny nicieni, dobrze wymieszać, mieszając końcówką pipety, a następnie pobrać 3 μl i przeliczyć w celu kwantyfikacji całkowitej populacji w dołeczce.
  11. Procent skolonizowanych nicieni można obliczyć, dzieląc liczbę osobników skolonizowanych przez całkowitą liczbę nicieni w dołeczce.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykładowe obrazy mikroskopowe nicieni Steinernema powiązanych z bakteriami Xenorhabdus przedstawiono na Rysunku 3. W celu utworzenia obrazu złożonego widocznego na Rysunku 3A, obraz w kontraście fazowym nałożono na obraz fluorescencyjny. Strzałka na Rysunku 3A wskazuje bakterie obecne wewnątrz zakaźnego stadium młodzieńczego nicienia (pasek skali = 100 μm). Rysunek 3B został sporządzony w podobny sposób i przedstawia młodego nicienia z bakteriami znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym (zielone pręciki) zlokalizowanymi w całym świetle jelita nicienia (pasek skali = 20 μm). Policzono populację nicieni z dwóch pośrodków i oceniono stopień ich kolonizacji przez bakteryjnego symbionta (Tabela 1). Dla uzyskania wiarygodnych statystyk najlepiej policzyć co najmniej 100 nicieni na próbkę, tak aby co najmniej 30 z nich znalazło się w każdej kategorii. Jak wynika z Tabeli 1, nicienie te są kolonizowane na poziomie około 14,6% przy hodowli na agarze lipidowym i 68,6% przy hodowli na agarze wątrobowo-nerkowym. Wykazano, że inne gatunki nicieni i bakterii wykazują różne poziomy kolonizacji. Na przykład X. nematophila kolonizuje 99% zakaźnych stadiów młodzieńczych S. carpocapsae (Martens 2003), a P. luminescens kolonizuje 26% zakaźnych stadiów młodzieńczych H. bacteriophora (Ciche 2003).

Schemat interakcji bakteria-nicień; układ eksperymentalny; obserwowany wpływ bakterii na nicienia.
Rysunek 1. Schematyczna aktualizacja metody. A. Bakteria została zmodyfikowana genetycznie w celu ekspresji białka fluorescencyjnego. B. Jaja nicieni są izolowane z dorosłych osobników w celu uzyskania nicieni sterylnych. C. Sterylne nicienie są współhodowane z fluorescencyjnymi bakteriami. D. Powstałe stadia życiowe są badane pod mikroskopem w celu oceny obecności bakterii wewnątrz nicienia.

Schemat anatomii nicieni; zaznaczona wulwa, jaja; mikroskopia struktur komórkowych; badanie rozrodczości.
Rysunek 2. Przedstawienie dorosłych samic zawierających jaja. A. Schemat przedstawia ogólny wygląd samic Steinernema . Wstawka: obraz DIC ciężarnej samicy S. feltiae . Czarna strzałka wskazuje wulwę. Białe strzałki wskazują widoczne jaja. Obraz wykonano przy powiększeniu 20X, a pasek skali odpowiada 100 μm. B. Obraz DIC rozwiniętego, ale niewyklutego jaja nicienia S. feltiae . Obraz wykonano przy powiększeniu 40X, a pasek skali odpowiada 50 μm. C. Obraz DIC jaj wyizolowanych z nicieni S. feltiae przy powiększeniu 10X. Pasek skali odpowiada 100 μm.

Mikroskopia C. elegans pokazująca fluorescencję aktywności neuronalnej, schemat funkcji układu nerwowego.
Rysunek 3.Przykładowe obrazy mikroskopowe asocjacji nicieni z bakteriami. A. S. puntauvense asocjowały się ze swoim bakteryjnym symbiontem, X. bovienii, wykazującym ekspresję GFP. Obraz jest kompozytem powstałym z nałożenia obrazu w kontraście fazowym na obraz fluorescencyjny z tego samego pola widzenia. Strzałka wskazuje fluorescencyjnego symbionta bakteryjnego wewnątrz gospodarza nicieniowego. Pasek skali reprezentuje 100 μm. B. Ten obraz przedstawia młodego nicienia S. carpocapsae z X. nematophila wykazującą ekspresję GFP, zlokalizowaną w jelicie nicienia. Obraz ten został stworzony poprzez nałożenie obrazu fluorescencyjnego na obraz z różnicowego kontrastu interferencyjnego. Pasek skali reprezentuje 20 μm.

SzczepLiczba nicieni z bakteriamiCałkowita liczba policzonych nicieniProcent skolonizowanych nicieni
S. puntauvense Lipid Agar3020514.60%
S. puntauvense Liver Kidney Agar7210568.60%

Tabela 1. Przykładowa punktacja populacji nicieni pod kątem obecności bakterii. W tym eksperymencie akseniczne nicienie S. puntauvense hodowano z ich GFP-ekspresyjnym symbiontem na różnych pożywkach (agarze lipidowym i agarze wątrobowo-nerkowym 32) w celu zbadania wad kolonizacji. W każdej próbce policzono i oceniono pod kątem obecności bakterii łącznie co najmniej sto nicieni. Dla zapewnienia mocy statystycznej należy policzyć trzy powtórzenia eksperymentalne, w których do każdej kategorii wpadnie co najmniej 30 nicieni.

Tabela z danymi o plazmidach, szczegółowo opisująca fluorofory, kasety antybiotykowe, miejsca insercji i uwagi dotyczące replikacji.
Tabela 2. Plazmidy zawierające białka fluorescencyjne. Przedstawiono listę potencjalnych plazmidów do insercji białka fluorescencyjnego do bakteryjnego symbionta, wyszczególnioną według nazw plazmidów. Pozostałe informacje obejmują kodowane białko fluorescencyjne, kasetę antybiotykową używaną do utrzymania plazmidu, dodatkowe instrukcje dotyczące zastosowania oraz źródło plazmidu. Stężenie podane w nawiasach to stężenie antybiotyku stosowanego dla X. nematophila. Każdy z tych plazmidów został z powodzeniem zastosowany w bakteriach z rodzaju Xenorhabdus lub Photorhabdus. Dodatkowe informacje można uzyskać z przytoczonych cytowań. W zależności od badanej bakterii niektóre plazmidy mogą nie działać ze względu na rodzaj białka fluorescencyjnego, selekcję antybiotykową, miejsce insercji lub pochodzenie replikacji. Wymienione powyżej plazmidy posiadają różne cechy, które mogą umożliwić ich zastosowanie w interesującej nas bakterii. Na przykład mini-Tn7-KSGFP wstawia się w miejsce attTn7 chromosomu, podczas gdy pECM20 wstawia się do chromosomu X. nematophila poprzez rekombinację homologiczną. Z kolei plazmidy pPROBE są utrzymywane pozachromosomalnie; każdy plazmid pPROBE ma ten sam szkielet i fluorofor, ale różnią się markerami selekcyjnymi lub pochodzeniem replikacji, co umożliwia ich zastosowanie w różnych tła taksonomicznych lub mutacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół przedstawia metodę optycznej detekcji bakterii wewnątrz gospodarza z grupy nicieni (Rysunek 1). Metoda ta wykorzystuje przejrzystość optyczną nicieni oraz możliwość fluorescencyjnego znakowania bakterii, co umożliwia analizę bakterii in vivo wewnątrz gospodarza (Rysunek 3). W szczególności podejście to pozwala zidentyfikować lokalizację bakterii w organizmie gospodarza. Poprzez przeliczenie populacji nicieni i ocenę obecności bakterii można określić często...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Eugenio Vivasowi, Kurtowi Heungensowi, Ericowi Martensowi, Charlesowi Cowlesowi, Darby Sugar, Ericowi Stabbowi oraz Toddowi Ciche za ich wkład w opracowanie niniejszego protokołu oraz wykorzystanych narzędzi. KEM i JMC otrzymali wsparcie w ramach National Research Service Award T32 (AI55397 „Microbes in Health and Disease”) przyznanego przez Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH). JMC otrzymał wsparcie w ramach Graduate Research Fellowship przyznanego przez Narodową Fundację Naukową (NSF). Praca ta została sfinansowana z grantów Narodowej Fundacji Naukowej (IOS-0920631 oraz IOS-0950873).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar lipidowy
(sterylne)		8 g pożywki Nutrient Broth, 15 g agaru, 5 g ekstraktu drożdżowego, 890 ml wody, 10 ml MgCl2 o stężeniu 0,2 g/ml2. 6H20, 96 ml roztworu syropu kukurydzianego*, 4 ml oleju kukurydzianego*
Mieszać pożywkę podczas wylewania szalek
*dodać sterylny składnik po autoklawowaniu
Roztwór syropu kukurydzianego
(jałowe)		7 ml syropu kukurydzianego, 89 ml wody
wymieszać i wysterylizować w autoklawie
Roztwór do jaj16,6 ml 12% podchlorynu sodu, 5 ml 5M KOH, 80 ml wody
pożywka LB (Lysogeny Broth)
(sterylne)		5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptony, 5 g soli, 1 l wody
wymieszać i wysterylizować w autoklawie
Wirówka laboratoryjnaFisher13-100-675Można użyć dowolnej mikrowirówki przystosowanej do obsługi probówek do mikrowirówek.
WirowanieBeckman366802Duża wirówka nakładkowa mieszcząca probówki stożkowe o pojemności 15 ml i 50 ml
Sterylna płytka Petri 60 mm x 15 mmFisher0875713
probówki wirówkowe 50 mlFisher05-539-6
probówki wirówkowe 15 mlFisher05-531-6
Sterylna szalka Petri 100 mm x 20 mmFisher0875711ZGłębsze niż standardowe szalki Petriego
płytka 24-dołkowaGreiner Bio-One662000-06
MikroskopMikroskop musi posiadać funkcje fluorescencyjne kompatybilne z używanym fluoroforem
ParaformaldehydElectron Microscopy Sciences15710
PBS
(sterylne)		8 g NaCl
0,2 g KCl
1,44 g Na2HPO (wysokie powiększenie)4
0,24 g KH2Wprowadzenie4
1 l wody

Dostosować pH do wartości 7,4, uzupełnić wodą do objętości 1 l i wysterylizować w autoklawie
Probówki do mikrocentryfugiFisher05-408-138probówki o pojemności 2 ml lub 1,5 ml
Inkubator wytrząsowyZastosować można dowolny inkubator wytrząsowy, który zapewni łagodne mieszanie cieczy.
Kwas diaminopimelinowySigmaD-1377W razie potrzeby uzupełnić pożywkę do stężenia 1 mM

Bibliografia

  1. Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
  2. Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
  3. Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
  4. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
  5. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
  6. Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
  7. Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
  8. Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
  9. Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
  10. Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
  11. Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
  12. Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
  13. Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
  14. Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
  15. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  16. Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
  17. Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45(2010).
  18. Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
  19. Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
  20. Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
  21. Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
  22. Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
  23. Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
  24. Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
  25. Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
  26. Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
  27. Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
  28. Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
  29. Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
  30. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
  31. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  32. Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
  33. Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
  34. Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
  35. Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
  36. Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
  37. Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

symbiont bakteryjnyorganizm gospodarz nicieniowyXenorhabdus nematophilaSteinernema carpocapsaemetoda konjugacjiizolacja jajcz stotliwo kolonizacjimikroskopia wietlnaznakowanie GFP

Powiązane artykuły