Danio pręgowany stanowi potężny model kręgowców, który był niewystarczająco wykorzystywany w badaniach metabolicznych. W niniejszej pracy opisujemy szybką metodę pomiaru profilu metabolicznego in vivo rozwijających się rybek danio, która umożliwia porównanie różnych parametrów funkcji mitochondriów między zarodkami manipulowanymi genetycznie lub farmakologicznie, zwiększając tym samym możliwości zastosowania tego organizmu.
Artykuł metodologiczny
Analiza profilu metabolicznego embrionów rybki danio-ostrogona
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rosnącym celem w dziedzinie metabolizmu jest określenie wpływu genetyki na różne aspekty funkcji mitochondriów. Zrozumienie tych zależności pomoże w poznaniu podstawowej etiologii szeregu chorób związanych z dysfunkcją mitochondriów, takich jak cukrzyca i otyłość. Niedawne postępy w instrumentacji umożliwiły monitorowanie odrębnych parametrów funkcji mitochondriów w liniach komórkowych lub eksplantach tkankowych. Przedstawiamy tutaj metodę szybkiej i czułej analizy parametrów funkcji mitochondriów in vivo podczas rozwoju embrionalnego danio pręgowanego z wykorzystaniem analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse bioscience XF 24. Protokół ten wykorzystuje mikropłytki Islet Capture, w których w każdej studzience umieszcza się jeden embrion, co pozwala na pomiar bioenergetyki, w tym: (i) oddychania podstawowego; (ii) podstawowego oddychania mitochondrialnego; (iii) oddychania mitochondrialnego wynikającego z obrotu ATP; (iv) mitochondrialnego oddychania rozsprzężonego lub przecieku protonów oraz (iv) oddychania maksymalnego. Stosując to podejście, parametry oddychania embrionalnego danio pręgowanego można porównywać między embrionami typu dzikiego a embrionami genetycznie zmodyfikowanymi (mutantami, z nadekspresją genu lub wyciszeniem genu) lub tymi poddanymi manipulacjom farmakologicznym. Przewiduje się, że upowszechnienie tego protokołu dostarczy badaczom nowych narzędzi do analizy podstaw genetycznych zaburzeń metabolicznych in vivo w tym istotnym kręgowym modelu zwierzęcym.
Protokół
Część 1: Obróbka chemiczna embrionów danio pręgowanego
- Zebra rybie embriony należy zebrać po zapłodnieniu. Inkubować je w temperaturze 28,5 °C w pożywce E3 w szalkach Petriego o wymiarach 100×15 mm. Uwaga: W przypadku hybrydyzacji in situ lub barwienia Oil-Red-O, w celu zahamowania powstawania pigmentu, dodaje się 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) do stężenia końcowego 0,2 mM,1 co nie jest jednak wymagane przy analizie Seahorse.
- W badaniach farmakologicznych, około 26 godzin po zapłodnieniu (hpf), do rozwijających się embrionów zebrafish należy dodać odpowiedni związek chemiczny w wymaganym stężeniu końcowym, stosując odpowiednią kontrolę z samym rozpuszczalnikiem. Uwaga: W przypadku inhibitorów farmakologicznych wrażliwych na światło, embriony mogą rozwijać się w ciemności przed przeprowadzeniem analizy.
Część 2: Profil metaboliczny żywych komórek z użyciem analizatora Seahorse XF 24
- Przed każdym pomiarem kartridż analizatora Seahorse XF 24, zawierający fluorofory O2 i H+, jest kalibrowany za pomocą zautomatyzowanego procesu realizowanego przez analizator.
- Przygotowanie 24-dołkowej płytki XF 24 do wysp. Stosowana jest następująca sekwencja eksperymentalna:
- Ponieważ zużycie tlenu jest wrażliwe na wahania temperatury, cztery dołki służą do kontroli możliwych wahań temperatury na całej płytce. Dołki te nie zawierają embrionów, lecz są wypełnione 700 μl pożywki E3 (Rysunek 2A).
- Pozostałe 20 dołków (patrz część 2.2) jest wypełnionych 700 μl pożywki E3 i jednym embrionem w każdym dołku (Rysunek 2B).
- W każdym eksperymencie 10 embrionów jest traktowanych samym rozpuszczalnikiem (grupa kontrolna), a 10 inhibitorami chemicznymi (grupa badana). Embriony kontrolne i badane są rozmieszczane naprzemiennie (np. dołek A2: embrion kontrolny; dołek A3: embrion badany; dołek A4: embrion kontrolny; dołek A5: embrion badany itd.).
- Na górze każdego dołka umieszcza się siatkę do wychwytywania wysp, aby zapewnić, że preparat pozostanie w komorze pomiarowej przez cały czas trwania analizy (Rysunek 2B). Uwaga: embriony traktowane chemicznie pozostają w oryginalnym roztworze chemicznym przez całą procedurę; nie ma potrzeby wypłukiwania związku przed uruchomieniem programu analizatora Seahorse.
- Po zakończeniu przygotowań płytkę ładuje się do analizatora Seahorse i rozpoczyna analizę.
- Analiza próbek. Rutynowo wykonuje się dwa różne programy pomiarowe.
- Program oddychania bazowego/maksymalnego (czas trwania ok. 90 min). Zmiany w oddychaniu bazowym leżą u podstaw dysfunkcji metabolicznych, natomiast oddychanie maksymalne jest miarą całkowitej wydajności produkcji energii, a zmiany tego parametru wiążą się z szeregiem stanów patologicznych i fizjologicznych. Rezerwa wydolności oddechowej, czyli zdolność systemu do dalszego zwiększenia produkcji ATP, jest również obliczana w tym teście poprzez odjęcie oddychania bazowego od maksymalnego. W celu ustalenia oddychania bazowego wykonuje się trzy powtórzenia cyklu: mieszanie (2 min)/oczekiwanie (1 min)/pomiar (2 min). Na koniec trzeciego cyklu do każdego dołka dodaje się FCCP (mitochondrialny protonofor/odsprzęgacz) do stężenia końcowego 2,5 μM, co umożliwia pomiar oddychania maksymalnego. Następnie cykl pomiarowy jest powtarzany od 5 do 8 razy (Rysunek 3).
- Program obrotu ATP/przecieku protonów (czas trwania ok. 60 min). Oddychanie wynikające z obrotu ATP reprezentuje główną funkcję mitochondriów w postaci produkcji ATP, podczas gdy oddychanie wynikające z przecieku protonów, czyli oddychanie odsprzęgone, jest nierozerwalnie związane z innymi parametrami funkcji mitochondrialnych, w tym z oddychaniem bazowym i tworzeniem reaktywnych form tlenu. Oddychanie wynikające z obrotu ATP jest reprezentowane przez różnicę w oddychaniu po dodaniu 25 μM oligomycyny (inhibitora syntazy ATP) w porównaniu do oddychania bazowego. Oddychanie odsprzęgone, czyli oddychanie wynikające z przecieku protonów, określa się poprzez obliczenie różnicy między oddychaniem indukowanym oligomycyną a oddychaniem po dodaniu 25 μM rotenonu (inhibitora kompleksu I). Cykle pomiarowe są powtarzane 8 razy po dodaniu każdego inhibitora mitochondrialnego.
Po zakończeniu pomiarów oblicza się wartości średnie dla 10 embrionów kontrolnych oraz 10 embrionów poddanych działaniu substancji chemicznych.
Część 3: Barwienie Oil Red O
- Zarodki w 50 hpf są dechorionowane za pomocą precyzyjnej pęsety i utrwalane w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przeprowadza się barwienie Oil-Red-O zgodnie z wcześniejszym opisem2 (patrz Rysunek 4).
Wyniki
Naszym celem jest zrozumienie roli konkretnych genów w metabolizmie, w szczególności w tempie oddychania i metabolizmie lipidów. W związku z tym zarodki zebrafish typu dzikiego traktowaliśmy od 26 hpf specyficznym inhibitorem farmakologicznym enzymu kodowanego przez jeden z tych genów. W 50 hpf połowę zarodków traktowanych nośnikiem oraz inhibitorem przeanalizowano za pomocą analizatora Seahorse pod kątem funkcji mitochondriów, natomiast pozostałą połowę utrwalono w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie zabarwiono Oil-Red-O w celu wykazania odkładania się lipidów. Traktowanie specyficznym inhibitorem enzymu doprowadziło do ok. 2-krotnego wzrostu oddychania podstawowego (Rycyna 4A), co wiązało się ze zwiększonym odkładaniem lipidów, szczególnie w telencefalonie i pod pęcherzykiem słuchowym (Rycina 4B,C).
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie traktowania chemicznego zarodków ryb zebrafish. Tłem są zarodki ryb zebrafish typu dzikiego, zmodyfikowane genetycznie lub traktowane farmakologicznie.
Rysunek 2. Konfiguracja płytki XF24 z wyspami. (A) Cztery dołki zawierają wyłącznie pożywkę embrionalną jako kontrolę temperatury (oznaczone znakiem X), a pozostałe zawierają po jednym embrionie na dołek. (B) Powiększenie jednego dołka (C6) przedstawiające embrion typu dzikiego w 50 hpf traktowany nośnikiem (DMSO), przykryty sitkiem do wychwytywania wysp (głowica strzałki).
Rycina 3. Parametry oddychania dla embrionów zebrafish typu dzikiego w 50 hpf. (A) Dla każdego pomiaru przedstawiono średnią z 20 poszczególnych embrionów. Oddychanie podstawowe (średnia: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), oddychanie maksymalne (średnia: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), rezerwowa pojemność oddechowa (średnia: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Dla każdego pomiaru przedstawiono średnią z 20 poszczególnych wyników. Podstawowe oddychanie mitochondrialne; oddychanie mitochondrialne wynikające z obrotu ATP; mitochondrialne oddychanie rozprzężone i oddychanie pozamitochondrialne. Mt: mitochondrialne; SRC: rezerwowa pojemność oddechowa; SD: odchylenie standardowe, SEM: standardowy błąd średniej. Wyniki przedstawiono w pmol O2 zużytego/min/embrion. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki wpływu ekspozycji chemicznej na oddychanie podstawowe i odkładanie lipidów. (A,B) Zarodek w 50 hpf barwiony Oil-Red O w widoku bocznym. Zarodek inkubowany z selektywnym inhibitorem (B) wykazuje silniejsze barwienie Oil-Red O w telencefalonie (grot strzałki) oraz pod pęcherzykiem słuchowym (strzałka) w porównaniu do zarodka kontrolnego traktowanego nośnikiem. (C) Oddychanie podstawowe wykazuje ok. 2-krotny wzrost w zarodkach traktowanych chemicznie (n=10 zarodków na grupę). Wyniki przedstawiono w pmol O2/min/zarodek.
Dyskusja
Danio pręgowany jest ugruntowanym modelem genetycznym zarówno dla podejść genetyki forward (mutogeneza ENU), jak i reverse (Tilling, celowany knock-out za pomocą nukleaz z palcami cynkowymi, knockdown za pomocą morfolino)3,4, podczas gdy funkcję genów w embrionach danio pręgowanego można również łatwo blokować lub aktywować, stosując selektywne związki farmakologiczne specyficzne dla kodowanych produktów. Ze względu na rozwój zewnętrzny i niewielki rozmiar, embriony danio pręgowanego są szczególnie odpowiednie do analiz metabolicznych. Jednakże nie osiągnięto jeszcze wiarygodnego pomiaru profilu metabolicznego i funkcji mitochondriów in vivo w embrionach danio pręgowanego, a zgłoszono jedynie jeden wstępny opis5. Analiza Seahorse została pierwotnie zaprojektowana do metabolicznych badań opartych na komórkach i wykazano, że dostarcza dokładnych i wiarygodnych wyników6. Zastosowanie tej nowej metodologii w odniesieniu do embrionów danio pręgowanego jest istotne i prawdopodobnie zwiększy szersze wykorzystanie tego modelu w badaniach metabolicznych.
W niniejszym badaniu demonstrujemy pomiar szeregu parametrów oddychania w embrionach danio pręgowanego z wykorzystaniem analizatora Seahorse, w tym oddychania podstawowego, oddychania maksymalnego, rezerwowej wydolności oddechowej, obrotu ATP oraz wycieku protonów. Przedstawiamy również przykład tego, jak pomiary te mogą być korelowane z innymi parametrami fizjologicznymi, w tym przypadku z akumulacją lipidów, a także przykład zastosowania inhibitorów farmakologicznych w tym systemie assay. W połączeniu z wykorzystaniem embrionów modyfikowanych genetycznie, stanowi to potężną platformę eksperymentalną do zrozumienia czynników wpływających na metabolizm.
Istnieje szereg zastosowań dla tej nowej metodologii, ponieważ dysfunkcja mitochondriów jest zaangażowana w wiele ludzkich chorób, takich jak cukrzyca7, otyłość8, stwardnienie rozsiane9, choroba Parkinsona10, choroba Alzheimera11 oraz niektóre rodzaje nowotworów12. Co istotne, nasze badania są prowadzone in vivo, gdzie wszystkie wpływy środowiskowe – takie jak cytokiny, wzrost związany z rozwojem itd. – są aktywne, co zapewnia fizjologicznie istotny wgląd w profil metaboliczny i oddychanie in vivo. Ponieważ przesiewy chemiczne są rutynowo przeprowadzane na embrionach zebrafish typu dzikiego oraz mutantach (Rycina 1), nowe farmaceutyki wpływające na oddychanie, funkcję mitochondriów lub metabolizm można łatwo zidentyfikować za pomocą analizatora Seahorse. Wyniki uzyskane przy użyciu analizatora Seahorse mogą być stosowane w połączeniu z innymi testami w celu uzyskania dodatkowych informacji. Może to obejmować analizy fizjologiczne, takie jak barwienie Oil Red, lub analizy molekularne, takie jak hybrydyzacja in situ dla specyficznych markerów adipocytów, np. cebpα, Pparα, Pparγ, FAS itd.
Niniejsza metodologia posiada pewne ograniczenia. Chociaż nam oraz innym udało się wykorzystać oligomycynę do pomiaru produkcji ATP i wycieku protonów w młodych embrionach5 (patrz Rysunek 3), w embrionach starszych niż 60 hpf traktowanie oligomycyną jest nieefektywne. Przypuszczamy, że w starszych embrionach oligomycyna nie może dyfundować tak łatwo jak w młodszych, co uniemożliwia interpretację wyników. Ponieważ wyniki uzyskane z użyciem oligomycyny są niezbędne do określenia oddychania wynikającego z obrotu ATP oraz oddychania rozsprzężonego, obecnie badamy zastosowanie wyższych stężeń oligomycyny dla starszych embrionów. Niemniej jednak traktowanie antymycyną A pozostaje skuteczne przez dłuższy czas, a inne pomiary, takie jak oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne i rezerwa wydolności oddechowej, mogą być przeprowadzane w starszych embrionach danio pręgowanego, aż do 68 hpf (nie pokazano).
Kolejnym ograniczeniem w wykorzystaniu obecnej konfiguracji analizatora Seahorse jest ograniczona przestrzeń fizyczna w każdym dołku płytki do wychwytywania wysepek, przez co nadają się one wyłącznie do embrionów i młodych larw ryb zebrafish. W związku z tym przeprowadzenie badań metabolicznych nad otyłością wywołaną dietą u dorosłych ryb nie jest obecnie technicznie możliwe. Niniejsze badanie może jednak przyczynić się do opracowania płytek zaprojektowanych specjalnie dla ryb młodzieńczych lub dorosłych, co rozszerzyłoby zakres możliwych analiz.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować pracownikom Deakin University Zebrafish Facility za zapewnienie doskonałej i stałej opieki hodowlanej. YG jest wspierany przez Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship oraz Central Research Grant z Deakin University. SLM jest wspierany przez NHMRC Career Development Fellowship. ACW jest wspierany przez NHMRC Enabling Grant. Wszyscy autorzy otrzymują wsparcie z Molecular & Medical Research Strategic Research Centre na Deakin University.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Analizator przepływu zewnątrzkomórkowego XF 24 | Seahorse Bioscience | 100737-101 | format 24-dołkowy |
| Mikropłytka Islet Capture | Seahorse Bioscience | 101122-100 | format 24-dołkowy |
| Roztwór kalibracyjny XF | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Poziomka do testów XF | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (pożywka embrionalna) | Własna produkcja | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| Szalki Petriego 100×15 mm | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycyna | Sigma | 75351 | |
| Antymycyna A | Sigma | A8674 |
Bibliografia
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652(2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
Przedruki i uprawnienia
