Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Podsumowanie

Opisano wpływ aktywacji izoform kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondriów związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych kulturach komórkowych oraz wykorzystuje szereg testów do określenia funkcji mitochondriów i statusu energetycznego komórki.

Streszczenie

Rodzina izoenzym kinazy białkowej C (PKC) bierze udział w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych. Nasze ostatnie dane wykazują, że PKC reguluje funkcję mitochondriów oraz stan energetyczny komórek. Wiele doniesień wskazało, że aktywacja PKC-α i PKC-ε poprawia funkcję mitochondriów w niedokrwionym sercu i pośredniczy w kardioprotekcji. Z kolei my wykazaliśmy, że PKC-α i PKC-ε biorą udział w indukowanej nefrotoksynami dysfunkcji mitochondriów i śmierci komórek w komórkach nerkowych. Celem niniejszego badania było zatem opracowanie modelu in vitro komórek nerkowych zachowujących aktywne funkcje mitochondrialne, w którym izoformy PKC mogłyby być selektywnie aktywowane lub hamowane w celu określenia ich roli w regulacji fosforylacji oksydacyjnej i przeżywalności komórek. Pierwotne hodowle komórek cewek bliższych nerek (RPTC) hodowano w usprawnionych warunkach, co pozwoliło uzyskać respirację mitochondrialną i aktywność enzymów mitochondrialnych zbliżoną do tej obserwowanej w RPTC in vivo. Ponieważ tradycyjne techniki transfekcji (Lipofectamine, elektroporacja) są mało wydajne w hodowlach pierwotnych i wywierają niekorzystny wpływ na funkcję mitochondriów, mutanty cDNA PKC-ε wprowadzano do RPTC za pomocą wektorów adenowirusowych. Podejście to pozwala na transfekcję ponad 90% hodowanych RPTC.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody oceny roli PKC-ε w: 1. regulacji morfologii i funkcji mitochondriów związanych z syntezą ATP oraz 2. przeżywalności RPTC w hodowli pierwotnej. Aktywację PKC-ε osiąga się poprzez nadekspresję konstytutywnie aktywnego mutanta PKC-ε. Inhibicję PKC-ε uzyskuje się poprzez nadekspresję nieaktywnego mutanta PKC-ε. Funkcję mitochondriów ocenia się poprzez badanie oddychania, integralności łańcucha oddechowego, aktywności kompleksów oddechowych i F₀F₁-ATPase, szybkości produkcji ATP oraz zawartości ATP. Oddychanie ocenia się w RPTC permeabilizowanych digitoniną jako stan 3 (maksymalne oddychanie w obecności nadmiaru substratów i ADP) oraz oddychanie rozprzężone. Integralność łańcucha oddechowego ocenia się poprzez pomiar aktywności wszystkich czterech kompleksów łańcucha oddechowego w izolowanych mitochondriach. Wydajność fosforylacji oksydacyjnej ocenia się poprzez pomiar potencjału błony mitochondrialnej, szybkości produkcji ATP oraz aktywności F₀F₁-ATPase. Stan energetyczny RPTC ocenia się poprzez oznaczenie wewnątrzkomórkowej zawartości ATP. Morfologię mitochondriów w żywych komórkach wizualizuje się przy użyciu MitoTracker Red 580, barwnika fluorescencyjnego specyficznie gromadzącego się w mitochondriach, a żywe monowarstwy bada się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żywotność RPTC ocenia się za pomocą barwienia anneksyną V/jodkiem propidium, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia poziomu apoptozy i onkozy.

Metody te umożliwiają selektywną aktywację/inhibicję poszczególnych izoform PKC w celu oceny ich roli w funkcjach komórkowych w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, które można odtworzyć in vitro.

Protokół

1. Izolacja kanalików proksymalnych nerek do hodowli pierwotnej

1. Zanurzyć królika w narkozie, wyciąć obie nerki i umieścić je w szalce Petri wypełnionej sterylnym buforem przygotowawczym (pożywka DMEM/F12) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Przepłukać każdą nerkę 50 ml buforu przygotowawczego, następnie 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo o pH 7,4 (PBS) oraz roztworem PBS z tlenkiem żelaza (45 ml + 5 ml). Usunąć torebki nerek i przenieść je do buforu przygotowawczego zawierającego deferoksaminę.
3. Pobrać korę z każdej nerki.
4. Zhomogenizować tkankę za pomocą homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml. Wylać homogenat przez dwa sterylne sita mesh (85 μm na dole i 235 μm na górze) umieszczone nad sterylnym zlewkiem o pojemności 1 L. Przepłukać sita buforem zawierającym deferoksaminę.
5. Zebrać tkankę pozostałą na sicie 85 μm do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej wypełnionej 35-40 ml buforu zawierającego deferoksaminę. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową.
6. Umieścić silny magnes na zewnątrz probówki, aby usunąć kłębuszki wypełnione żelazem, i pozostawić zawiesinę do osadzenia. Odessać żelazo z magnesu za pomocą pipety Pasteura. Powtórzyć ten proces.
7. Przygotować 1 ml pożywki do trawienia zawierającej 2 400-2 500 jednostek kolagenazy I oraz 0,6 mg inhibitora trypsyny sojowej rozpuszczonych w buforze zawierającym deferoksaminę. Poddać pożywkę do trawienia sterylizacji przez filtrację.
8. Dopełnić objętość zawiesiny komórkowej do 40 ml i dodać 1 ml pożywki do trawienia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 17 min, delikatnie mieszając zawiesinę, odwirować przy 50 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę i dodać świeży bufor z deferoksaminą.
9. Kilkakrotnie powtórzyć procedurę usuwania żelaza za pomocą magnesu, ponownie odwirować zawiesinę, odessać pożywkę i dodać 46 ml pożywki bez glukozy.
10. Delikatnie wymieszać i odmierzyć 500 μl zawiesiny do dwóch wcześniej zważonych probówek Eppendorf. Odwirować komórki przy 10 000 x g przez 1 min, odessać pożywkę i zważyć osad. Obliczyć całkowitą wydajność masy mokrej i białka.
11. Wysiać komórki w sterylnych szalkach hodowlanych 35 mm z gęstością 1 mg białka/szalka, używając pożywki DMEM/F12 bez glukozy. Hodować komórki w 2 ml pożywki DMEM/F12 bez glukozy, zawsze na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze w temperaturze 37 °C (95% powietrza/5% CO₂).^1,2

2. Hodowla komórek kanalików proksymalnych nerek

1. Pożywka hodowlana stanowi mieszaninę w stosunku 50:50 DMEM oraz pożywki Ham's F-12 bez czerwieni fenolowej, pirogronianu i glukozy, uzupełnioną o 15 mM NaHCO₃, 15 mM HEPES oraz 6 mM mleczanu (pH 7.4, 295 mosmol/kgH₂O). Bezpośrednio przed codzienną wymianą pożywek uzupełnia się je o L-askorbinian-2-fosforan (50 μM), insulinę wołową (10 nM), ludzką transferrynę (5 mg/ml), hydrokortyzon (50 nM) oraz selen (5 ng/ml).
2. Za pomocą techniki sterylnej odessać starą pożywkę z naczyń. Do każdego naczynia dodać 2 ml ciepłej, świeżej pożywki, stosując technikę sterylną. Komórki kanalików proksymalnych nerek (RPTC) osiągają konfluencję w ciągu około 5-6 dni po wysianiu.^1,2

3. Infekcja adenowirusowa komórek RPTC

1. Infekcję adenowirusową przeprowadza się w konfluencyjnych, spoczynkowych kulturach RPTC po codziennej wymianie pożywki. Dominujący negatywny mutant PKC-ε (dnPKC-ε) został skonstruowany poprzez zastąpienie: 1) lizyny argininą w pozycji 436 miejsca wiązania ATP oraz 2) alaniny glutaminianem w pozycji 159 domeny pseudosubstratu. Mutacje te zniosły aktywność kinazy konstruktu bez zmiany aktywnej konformacji PKC-ε.³ PKC-ε uczyniono konstytutywnie aktywną poprzez delecję reszt 154-163 jej inhibicyjnej domeny pseudosubstratu.⁴
2. Do każdej szalki dodać roztwór stokowy adenowirusa niosącego cDNA caPKC-ε lub cDNA dnPKC-ε, aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI), skutkującą znacznym wzrostem poziomów białka PKC-ε. Inkubować RPTC z adenowirusem przez 24 hr. Wymienić pożywkę i hodować komórki przez kolejne 24 hr. Znacząco zwiększone poziomy ufosforylowanego i całkowitego białka PKC-ε można uzyskać, stosując MOI od 25-50 wektora adenowirusowego kodującego caPKC-ε. Wyższe MOI prowadzi do jeszcze większych wzrostów poziomów aktywnego PKC-ε, jednak nie jest to zalecane w przypadku RPTC ze względu na szybką śmierć i ubytek komórek. Znacząco zwiększone poziomy nieaktywnego białka PKC-ε można uzyskać w RPTC, stosując MOI 50-100 bez wywoływania działań niepożądanych.⁵
3. Po 48 hr od infekcji odessać pożywkę, przemyć monowarstwy PBS i zebrać komórki do analizy immunoblottingiem w celu określenia poziomów białka PKC-ε.⁵

4. Pomiar oddychania RPTC

1. Przygotować bufor do pomiaru oddychania w stanie 3 (120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO₄ oraz 2 mM EGTA, pH 7,4). W przypadku pomiaru oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem I, uzupełnić bufor o 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu i 0,1 mg/ml digitoniny. Dla oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem II, uzupełnić bufor o 10 mM bursztynianu, 0,1 μM rotenonu i 0,1 mg/ml digitoniny. Dla oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem IV, uzupełnić bufor o 1 mM askorbinianu, 1 mM N,N,N',N'-tetrametylop-fenylenodiaminę (TMPD) oraz 0,1 mg/ml digitoniny. Umieścić roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Odssać pożywkę z naczynia hodowlanego zawierającego monowarstwę RPTC, dodać 2 ml ogrzanego buforu do oddychania w stanie 3, delikatnie zebrać komórki z naczynia za pomocą gumowego skrobaka i przenieść zawiesinę do komory pomiaru zużycia tlenu wyposażonej w elektrodę typu Clarka.
3. Zmierzyć oddychanie w stanie 2 (wobec braku ADP). Inicjować oddychanie w stanie 3 poprzez dodanie ADP do stężenia końcowego 0,4 mM. Inicjować oddychanie w stanie 4 poprzez dodanie oligomycyny do stężenia końcowego 0,5 μg/ml. Oddychanie niesprzężone mierzy się poprzez dodanie 0,5 μM FCCP do komórek oddychających w stanie 3.^6,7
4. Zebrać zawiesinę komórkową z komory, wytrącić białko za pomocą kwasu nadchlorowego i odwirować osad. Określić stężenie białka w osadzie komórkowym.

5. Analiza potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm)

1. Przygotować 0,5 mM roztwór JC-1 w sterylnym medium hodowlanym.
2. Do każdej szalki powoli dodać 20 μl roztworu JC-1, aby uzyskać stężenie końcowe 5 μM. Delikatnie zakręcić szalką, aby dokładnie wymieszać barwnik. Inkubować szalki przez 30 min.
3. Umieścić szalki na lodzie, odessać medium i dwukrotnie przemyć monowarstwy lodowatym PBS. Odessać PBS, dodać 1 ml świeżego PBS, zeskrobać komórki z szalki i przenieść je do probówki typu Eppendorf. Rozbić monowarstwy do pojedynczych komórek poprzez pipetowanie w górę i w dół.
4. Odwirować zawiesinę z prędkością 1 000 x g przez 2 min, odessać nadsącz, dodać 1 ml PBS do osadu i resuspender go w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. W razie potrzeby powtórzyć ten krok.
5. Odwirować komórki z prędkością 1 000 x g przez 2 min, odessać nadsącz, dodać 0,5 ml PBS i resuspender osad. Przeanalizować fluorescencję metodą cytometrii przepływowej, stosując wzbudzenie laserem argonowym o długości fali 488 nm. Odczytać emisję w dwóch osobnych kanałach: FL1 przy 525 nm oraz FL2 przy 590 nm. Potencjał błony mitochondrialnej wyraża się jako stosunek fluorescencji FL2/FL1.⁶

6. Izolacja mitochondriów

1. Przygotować bufory do izolacji: Bufor A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sacharoza, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Bufor B (bufor A zawierający inhibitory proteaz, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF) oraz Bufor C (10 mM HEPES, 395 mM sacharoza, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Wszystkie etapy należy przeprowadzać w warunkach chłodzenia na lodzie.
2. Monowarstwy RPTC przemyć dwukrotnie lodowatym buforem PBS. Monowarstwy zebrać skrobakiem do probówek typu Eppendorf i wirować przy 500 x g przez 5 min. Osad przemyć 1 ml Buforu A.
3. Osad ponownie zawiesić w 1 ml Buforu B, a następnie przenieść zawiesinę do homogenizatora Dounce o pojemności 2 ml.
4. Homogenizować komórki w homogenizatorze Dounce do momentu, aż kontrola mikroskopowa wykaże rozpad większości komórek w homogenacie.
5. Homogenat odwirować przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz i wirować go przy 15 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
6. Nadsącz odrzucić, a osad zawierający mitochondria surowe ponownie zawiesić w 1 ml Buforu C. Nadsączy wirować przy 15 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Procedurę przemywania osadu powtórzyć jeszcze dwa razy.⁵
7. W celu pomiaru aktywności kompleksów oddechowych, osad mitochondrialny ponownie zawiesić w 50-100 μl buforu do analizy i zamrozić w ciekłym azocie. Próbki rozmrażać powoli na lodzie.

7. Pomiar aktywności dehydrogenazy NADH-ubichinonowej (kompleks I)

1. Przygotować bufor do analizy: 10 mM KH₂PO₄, 5 mM MgCl₂, pH 7.2. Dodać BSA wolną od kwasów tłuszczowych oraz NADH, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,25% i 0,25 mM. Dodać 2 μl roztworu antymycyny A (1 mg/ml) do stężenia końcowego 2 μg/ml.
2. Próbki analizować w przezroczystej płytce 48-dołkowej. Uwzględnić próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 500 μl buforu do analizy z dodatkami oraz mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 10 μl ubichinonu o stężeniu 3,25 mM do każdego dołka. Rejestrować absorbancję (340 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdego dołka dodać 5 μl roztworu rotenonu (1 mg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu I obliczyć jako utlenianie NADH wrażliwe na rotenon.⁷

8. Pomiar aktywności bursztynian-ubichinon reduktazy (kompleks II)

1. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,25% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, 20 mM bursztynianu potasu, 0,25 mM 2,6-dichlorindofenolu, 2 μg/ml antymycyny A oraz 10 μg/ml rotenonu.
2. Próbki analizować w duplikacie w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 500 μl buforu do analizy z dodatkami i mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 2 min.
3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 10 μl 3,25 mM ubichinonu do każdego dołka. Rejestrować absorbancję (595 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Aktywność Kompleksu II obliczyć na podstawie redukcji 2,6-dichlorindofenolu. ⁷

9. Pomiar aktywności ubichinol-cytochrom c reduktazy (kompleks III)

1. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, 80 mM bursztynianu potasu, 10 μg/ml rotenonu oraz 0,24 mM cyjanku potasu.
2. Próbki należy analizować w dubletach w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 291 μl buforu do analizy z dodatkami i mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 3 μl 6 mM utlenionego cytochromu c do każdego dołka. Pomiar absorbancji (550 nm) prowadzić przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdego dołka dodać 5 μl roztworu antymycyny A (1 mg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu III obliczyć jako redukcję cytochromu c wrażliwą na antymycynę A.⁷

10. Pomiar aktywności cytochromowej oksydazy (Kompleks IV)

1. Przygotować zredukowany cytochrom c poprzez dodanie askorbinianu sodu do 9 mM roztworu cytochromu c i dializę roztworu przez noc w temperaturze 4 °C w 1 L buforu fosforanowego (10 mM KH₂PO₄, pH 7.2) zawierającego 5 mM MgCl₂. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych oraz antymycynę A (2 μg/ml).
2. Próbki należy analizować w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 233 μl buforu do analizy z dodatkami oraz mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie zredukowanego cytochromu c (stężenie końcowe 90 μM). Rejestrować absorbancję (550 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdego dołka dodać 2 μl roztworu KCN (8 μg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu IV obliczyć jako utlenianie cytochromu c wrażliwe na KCN.⁷

11. Pomiar aktywności F₀F₁-ATP-azy (syntazy ATP)

1. Przygotować bufor do analizy F₀F₁-ATPazy (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl₂ , pH 8.2). Osad mitochondrialny zawiesić ponownie w buforze do analizy, zamrozić próbki mitochondrialne w ciekłym azocie, a następnie powoli rozmrozić próbki na lodzie.
2. Próbki analizować w trzech powtórzeniach w przezroczystej płytce 48-dołkowej. Dla każdej grupy badawczej 2 dołki zostaną wykorzystane do pomiaru całkowitej aktywności ATPazy (275 μl buforu do analizy, 5 μl zawiesiny mitochondrialnej oraz 5 μl 95% etanolu), a 1 dołek do pomiaru aktywności ATPazy niepodatnej na oligomycynę (275 μl buforu do analizy, 5 μl zawiesiny mitochondrialnej oraz 5 μl roztworu oligomycyny o stężeniu 1 mg/ml w 95% etanolu).
3. Inkubować próbki w temperaturze 31 °C przez 10 min przy stałym wytrząsaniu. Dodać 16 μl 100 mM roztworu ATP (pH 7.0) i inkubować w 31 °C przez 5 min przy stałym wytrząsaniu.
4. Przenieść 200 μl mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 50 μl 3 M TCA. Inkubować próbki na lodzie przez 10 min, a następnie wirować przy 10,000 x g przez 5 min w 4 °C. Nadnadlewa i osady wykorzystać odpowiednio do oznaczenia zawartości fosforanów i białka.
5. Oznaczyć zawartość fosforanów w nadnadlewach za pomocą testu na fosforan nieorganiczny. Przygotować 100 ml odczynnika Sumnera, dodając 0.88 g FeSO₄ do 10 ml 3.75 M H₂SO₄ i dopełniając objętość do 90 ml wodą H₂O. Do roztworu FeSO₄ w H₂SO₄ dodać 10 ml roztworu molibdanu amonu (0.66 g/10 ml H₂O). Przechowywać w ciemności.
6. Do płytki 96-dołkowej nanieść po 50 μl każdego standardu fosforanów (0 - 1,000 μM KH₂PO₄) oraz 50 μl każdego nadnadlewu w dwóch powtórzeniach. Do każdego dołka dodać 250 μl odczynnika Sumnera i inkubować płytkę w 30 °C przez 15 min przy stałym wytrząsaniu.
7. Zmierzyć absorbancję przy 595 nm w temperaturze pokojowej. Aktywność F₀F₁-ATPazy określa się poprzez pomiar uwalniania P_i z ATP podatnego na działanie oligomycyny, zgodnie z naszym wcześniejszym opisem.^7,8 Obliczyć całkowitą i niepodatną na oligomycynę aktywność F₀F₁-ATPazy. Aby obliczyć aktywność ATPazy podatną na oligomycynę, od całkowitej aktywności ATPazy odjąć aktywność niepodatną na oligomycynę. ^8,9

12. Pomiar wewnątrzkomórkowej zawartości ATP

1. Naczynia hodowlane zawierające monowarstwy RPTC umieścić na lodzie, odessać medium i dwukrotnie przemyć monowarstwy lodowatym buforem PBS. Do każdej monowarstwy dodać 1 ml PBS, zeskrobać każdą monowarstwę do PBS i zebrać zawiesinę komórkową do probówki Eppendorf. Probówki Eppendorf wirować w mikrowirówce przez 5 sec.
2. Zawartość ATP w każdej próbce RPTC oznaczyć metodą lucyferazy, korzystając z zestawu ATP Bioluminescence Assay Kit HS II (Roche) zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce i obliczyć stężenie ATP na mg białka.⁸

13. Wizualizacja morfologii mitochondriów

1. Wymień pożywkę hodowlaną. Do każdej płytki dodaj 2 μl roztworu MitoTracker Red 580 o stężeniu 100 μM (stężenie końcowe 100 nM) i przełóż płytki z powrotem do inkubatora na 30 min.
2. Zbadaj żywe monowarstwy pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając obiektywu imersyjnego z wodą.⁵

14. Analiza żywotności komórek

1. Na 24 h przed rozpoczęciem analizy przygotować 50 mM roztwór cisplatyny do traktowania komórek, które będą służyć jako kontrola pozytywna dla apoptozy (komórki dodatnie dla aneksyny V). Przygotować również 500 mM roztwór nadtlenku tert-butyloperoksydu do traktowania komórek, które będą służyć jako kontrole pozytywne dla onkozy (komórki dodatnie dla jodku propidyny).
2. Potraktować 2 płytki 2 μl 50 mM cisplatyny oraz 2 płytki 2 μl 500 mM nadtlenku tert-butyloperoksydu. Jedną płytkę przeznaczyć na kontrolę bez barwienia.
3. Na 24 h po traktowaniu cisplatyną i TBHP przygotować bufor wiążący (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂) oraz roztwór jodku propidyny (PI) (50 μg/ml) w buforze wiążącym.
4. Przemyć monowarstwy raz buforem wiążącym. Do każdej płytki, z wyjątkiem kontroli bez barwienia oraz komórek dodatnich dla aneksyny V, dodać 1 ml schłodzonego do temperatury lodu buforu i 50 μl roztworu PI. Przykryć płytki i inkubować na lodzie przez 15 min przy łagodnym wytrząsaniu orbitalnym.
5. Przemyć monowarstwy buforem wiążącym (10 min), a następnie do każdej płytki, z wyjątkiem kontroli bez barwienia oraz komórek dodatnich dla PI, dodać 1 ml buforu wiążącego i 2 μl roztworu Annexin V-FITC. Przykryć płytki i inkubować w RT przez 10 min przy łagodnym wytrząsaniu orbitalnym.
6. Odssać bufor i przemyć monowarstwy 1 ml schłodzonego do temperatury lodu buforu wiążącego na lodzie przez 10 min przy łagodnym wytrząsaniu orbitalnym. Powtórzyć etap płukania.
7. Odssać bufor wiążący i dodać 500 μl buforu wiążącego do każdej płytki. Delikatnie zebrać komórki za pomocą gumowego skrobaka (policemana) i przenieść je do probówek do cytometrii przepływowej. Rozproszyć komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie próbek w górę i w dół. Rozbić wszelkie skupiska komórek.
8. Natychmiast zmierzyć fluorescencję PI i annexin V-FITC metodą cytometrii przepływowej, stosując wzbudzenie przy 488 nm i emisję przy odpowiednio 590 i 530 nm dla PI i FITC. Policzyć 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.
9. Na wykresach kropkowych z cytometrii przepływowej nanieść fluorescencję FITC na oś X, a fluorescencję PI na oś Y. Komórki dodatnie dla Annexin V i ujemne dla PI uznaje się za apoptotyczne. Komórki dodatnie dla PI i ujemne dla Annexin V uznaje się za onkotyczne.^10,11

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje, że adenowirusowa dostawa cDNA kodującego mutanty konstytutywnie aktywne (caPKC-ε) i nieaktywne (dnPKC-ε) białka PKC-ε prowadzi do znaczącego wzrostu poziomów białka PKC-ε w RPTC oraz w mitochondriach. Komórki zainfekowane cDNA zawierającym wektor caPKC-ε wykazywały nadekspresję fosforylowanej (aktywnej) formy PKC-ε, podczas gdy komórki zainfekowane cDNA kodującym dnPKC-ε wykazywały nadekspresję nieaktywnego (niefosforylowanego) białka PKC-ε (Rysunek 1). Obecność aktyw...

Dyskusja

Przedstawione tutaj podejście umożliwia nadekspresję poszczególnych izoenzymów PKC w pierwotnej hodowli komórek cewek bliższych nerek. Metoda ta posiada kilka istotnych zalet: 1. Pozwala na badanie mechanizmów regulacyjnych w homogennej populacji komórek (komórkach cewek bliższych nerek), które stanowią główny cel różnych czynników uszkadzających (niedokrwienia, hipoksji, stresu oksydacyjnego), leków oraz substancji nefrotoksycznych w obrębie nerki. 2. Funkcje mitochondrialne w tym modelu in vitro RPTC hodowanyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
Homogenizator tkanek Dounce 2 ml i 15 ml	WHEATON	989-24607, 357544
Sito nylonowe 85 i 235 mikronów	Small Parts	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
Sterylna probówka wirówkowa 50 ml	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
Mikroprobówka 1,5 ml	Sarstedt	72.690.001
Sterylne szalki hodowlane 35 x 10 mm	Corning	430165
Wirówka Jouan	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotory: Jouan T40
Regulowana mikrowirówka	SIGMA	Model 1 - 15
Monitor biologicznego zużycia tlenu	YSI Incorporated	YSI Model 5300A
Jednokomorowy mikro system pomiaru tlenu	YSI Incorporated	5356S
Sonda tlenowa	YSI Incorporated	5331A
Łaźnia cyrkulacyjna	YSI Incorporated	5310
Zestaw membran standardowych i KCl	YSI Incorporated	5775
Mieszadło magnetyczne	YSI Incorporated	5222
Rejestrator płaski	Kipp Zonen	BD 11E
Przezroczyste płytki 48- i 96-dołkowe	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Eppendorf	5355 21919
Wstrząsarka orbitalna MAXQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (czytnik absorbancji/fluorescencji/luminescencji)	Tecan	F129005
Inkubator automatyczny do CO2 z płaszczem wodnym US Autoflow	NUAIRE	NU 4850
Polistyrenowe probówki hodowlane 12x75 mm do cytometrii przepływowej	Fisher Brand	14-961-20
Axioskop Obiektyw immersyjny wodny 63x / 0,90W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99 - 830 - PB
DMEM / F12 Ham	Sigma	D 2906 - 1L
Mezylan deferoksaminy	Hospira	D110
Kolagenaza typu I	Worthington	4196
Inhibitor trypsyny	Sigma	T 6522 - 500mg
jodek 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylkarbocyjaniny (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Red	Invitrogen	M22425
Zestaw do bioluminescencyjnego oznaczania ATP HS II	Roche	11 699 709 001
Roztwór Aneksyny V - FITC	BioVision	1001 - 200
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	BD FACSCalibur