Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4301

⸱

7 stycznia 2013

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Streszczenie

Rodzina izozymów kinazy białkowej C (PKC) bierze udział w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych. Nasze ostatnie dane wykazują, że PKC reguluje funkcje mitochondriów oraz stan energetyczny komórek. Liczne doniesienia dowiodły, że aktywacja PKC-α i PKC-ε poprawia funkcje mitochondriów w niedokrwionym sercu i pośredniczy w kardioprotekcji. Z kolei wykazaliśmy, że PKC-α i PKC-ε uczestniczą w indukowanej nefrotoksynami dysfunkcji mitochondriów i śmierci komórek nerkowych. Celem niniejszego badania było zatem opracowanie modelu in vitro komórek nerek zachowujących aktywne funkcje mitochondriów, w którym izozymy PKC mogłyby być selektywnie aktywowane lub hamowane w celu określenia ich roli w regulacji fosforylacji oksydacyjnej i przeżywalności komórek. Pierwotne hodowle komórek cewnych kanalików proksymalnych nerek (RPTC) hodowano w usprawnionych warunkach, co pozwoliło uzyskać oddychanie mitochondrialne i aktywność enzymów mitochondrialnych zbliżoną do tej obserwowanej w RPTC in vivo. Ponieważ tradycyjne techniki transfekcji (Lipofectamine, elektroporacja) są mało wydajne w hodowlach pierwotnych i wywierają niekorzystny wpływ na funkcje mitochondriów, mutanty cDNA PKC-ε dostarczano do RPTC za pomocą wektorów adenowirusowych. Podejście to pozwala na transfekcję ponad 90% hodowanych komórek RPTC.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody oceny roli PKC-ε w: 1. regulacji morfologii i funkcji mitochondriów związanych z syntezą ATP oraz 2. przeżywalności RPTC w hodowli pierwotnej. Aktywację PKC-ε osiąga się poprzez nadekspresję konstytutywnie aktywnego mutanta PKC-ε. Inhibicję PKC-ε uzyskuje się poprzez nadekspresję nieaktywnego mutanta PKC-ε. Funkcję mitochondriów ocenia się poprzez badanie oddychania, integralności łańcucha oddechowego, aktywności kompleksów oddechowych i F0F1-ATPase, szybkości produkcji ATP oraz zawartości ATP. Oddychanie ocenia się w RPTC przepuszczczonych za pomocą digitonininy jako stan 3 (maksymalne oddychanie w obecności nadmiaru substratów i ADP) oraz oddychanie rozprzęgane. Integralność łańcucha oddechowego ocenia się poprzez pomiar aktywności wszystkich czterech kompleksów łańcucha oddechowego w izolowanych mitochondriach. Zdolność do fosforylacji oksydacyjnej ocenia się poprzez pomiar potencjału błony mitochondrialnej, szybkości produkcji ATP oraz aktywności F0F1-ATPase. Stan energetyczny RPTC ocenia się poprzez oznaczenie wewnątrzkomórkowej zawartości ATP. Morfologię mitochondriów w żywych komórkach wizualizuje się przy użyciu MitoTracker Red 580, barwnika fluorescencyjnego specyficznie kumulującego się w mitochondriach, a żywe monowarstwy bada się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żywotność RPTC ocenia się za pomocą barwienia aneksyną V/jodkiem propidyny z następującą cytometrią przepływową w celu określenia poziomu apoptozy i onkozy.

Metody te umożliwiają selektywną aktywację lub inhibicję poszczególnych izoform PKC w celu oceny ich roli w funkcjach komórkowych w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, które można odtworzyć in vitro.

Protokół

1. Izolacja cewek bliższych nerek do hodowli pierwotnej

  1. Zanurz królika w narkozie, wyciąć obie nerki i umieścić je w czarodziejkach Petriego wypełnionych sterylnym buforem przygotowawczym (pożywka DMEM/F12) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Przerwać każdą nerkę 50 ml buforu przygotowawczego, a następnie 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4 (PBS) oraz roztworem PBS z tlenkiem żelaza (45 ml + 5 ml). Usunąć torebki nerkowe i przenieść nerki do buforu przygotowawczego zawierającego deferoksaminę.
  3. Pobrać korę każdej nerki.
  4. Zhomogenizować tkankę za pomocą homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml. Przelać homogenat przez dwa sterylne sita siatkowe (85 μm na dole i 235 μm na górze) umieszczone nad sterylnym zlewkiem o pojemności 1 L. Przepłukać sita buforem zawierającym deferoksaminę.
  5. Zebrać pozostałą na sicie 85 μm tkankę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej wypełnionej 35-40 ml buforu zawierającego deferoksaminę. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową.
  6. Umieścić silny magnes na zewnątrz probówki, aby usunąć kłębki nerkowe wypełnione żelazem, i pozwolić zawiesinie osiąść. Odessać żelazo z magnesu za pomocą pipety Pasteura. Powtórzyć ten proces.
  7. Przygotować 1 ml pożywki do trawienia zawierającej 2 400-2 500 jednostek kolagenazy I i 0,6 mg inhibitora trypsyny sojowej rozpuszczonych w buforze zawierającym deferoksaminę. Poddać pożywkę do trawienia sterylizacji przez filtrowanie.
  8. Dopełnić objętość zawiesiny komórkowej do 40 ml i dodać 1 ml pożywki do trawienia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 17 min, delikatnie mieszając zawiesinę, odwirować przy 50 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę i dodać świeży bufor z deferoksaminą.
  9. Kilka razy powtórzyć procedurę usuwania żelaza za pomocą magnesu, ponownie odwirować zawiesinę, odessać pożywkę i dodać 46 ml pożywki nie zawierającej glukozy.
  10. Delikatnie wymieszać i odmierzyć 500 μl zawiesiny do dwóch wcześniej zważonych probówek Eppendorf. Odwirować komórki przy 10 000 x g przez 1 min, odessać pożywkę i zważyć osad. Obliczyć całkowitą wydajność masy mokrej i białka.
  11. Wysiać komórki w sterylnych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 mm przy gęstości 1 mg białka/naczynie, używając pożywki DMEM/F12 bez glukozy. Hodować komórki w 2 ml pożywki DMEM/F12 bez glukozy, zawsze na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze w temperaturze 37 °C (95% powietrza/5% CO2).1,2

2. Hodowla komórek kanalików proksymalnych nerek

  1. Pożywka hodowlana stanowi mieszaninę DMEM i nutrient mix Ham's F-12 w stosunku 50:50, bez czerwieni fenolowej, pirogronianu i glukozy, uzupełnioną o 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES oraz 6 mM mleczanu (pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O). Bezpośrednio przed codzienną wymianą pożywki uzupełnia się ją o L-askorbinian-2-fosforan (50 μM), insulinę bydlęcą (10 nM), ludzką transferrynę (5 mg/ml), hydrokortyzon (50 nM) oraz selen (5 ng/ml).
  2. Odessać zużytą pożywkę z naczyń, stosując technikę sterylną. Do każdego naczynia dodać 2 ml podgrzanej, świeżej pożywki w warunkach sterylnych. Komórki kanalików proksymalnych nerek (RPTC) osiągają konfluencję w ciągu około 5-6 dni od posiewania.1,2

3. Infekcja adenowirusowa RPTC

  1. Infekcję adenowirusową przeprowadza się w konfluencyjnych, spoczynkowych kulturach RPTC po codziennej wymianie pożywki. Dominujący negatywny mutant PKC-ε (dnPKC-ε) został skonstruowany poprzez zastąpienie: 1) lizyny argininą w pozycji 436 miejsca wiązania ATP oraz 2) alaniny glutaminianem w pozycji 159 domeny pseudosubstratu. Mutacje te zniosły aktywność kinazową konstruktu, nie zmieniając aktywnej konformacji PKC-ε.3 PKC-ε uczyniono konstytutywnie aktywnym poprzez delecję reszt 154-163 jego inhibicyjnej domeny pseudosubstratu.4
  2. Do każdej płytki dodaj roztwór zapasowy adenowirusa niosącego cDNA caPKC-ε lub cDNA dnPKC-ε, aby uzyskać pożądaną wielokrotność infekcji (MOI), skutkującą znacznym wzrostem poziomu białka PKC-ε. Inkubuj RPTC z adenowirusem przez 24 hr. Wymień pożywkę i hoduj komórki przez kolejne 24 hr. Znacznie zwiększone poziomy fosforylowanego i całkowitego białka PKC-ε można uzyskać stosując 25-50 MOI wektora adenowirusowego kodującego caPKC-ε. Wyższa wartość MOI prowadzi do jeszcze większego wzrostu poziomu aktywnego PKC-ε, ale nie jest ona zalecana w przypadku RPTC ze względu na szybką śmierć i utratę komórek. Znacznie zwiększone poziomy nieaktywnego białka PKC-ε można uzyskać stosując 50-100 MOI w RPTC bez wywoływania działań niepożądanych.5
  3. Po 48 hr od infekcji odessij pożywkę, przemyj monowarstwy PBS i zbierz komórki do analizy immunoblottingowej w celu określenia poziomu białka PKC-ε.5

4. Pomiar oddychania RPTC

  1. Przygotować bufor do analizy w celu pomiaru oddychania w stanie 3 (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO4 oraz 2 mM EGTA, pH 7,4). W celu pomiaru oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem I, uzupełnić bufor o 5 mM glutaminianu, 5 mM malonianu i 0,1 mg/ml digitoniny. W celu pomiaru oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem II, uzupełnić bufor o 10 mM bursztynianu, 0,1 μM rotenonu i 0,1 mg/ml digitoniny. W celu pomiaru oddychania w stanie 3 sprzężonego z kompleksem IV, uzupełnić bufor o 1 mM askorbinianu, 1 mM N,N,N',N'-tetrametylu-p-fenylendiaminy (TMPD) i 0,1 mg/ml digitoniny. Umieścić roztwory w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Odssać medium z naczynia hodowlanego zawierającego monowarstwę RPTC, dodać 2 ml podgrzanego buforu do oddychania w stanie 3, delikatnie zebrać komórki z naczynia za pomocą gumowego skrobaka (rubber policeman) i przenieść zawiesinę do komory pomiaru zużycia tlenu wyposażonej w elektrodę typu Clarka.
  3. Zmierzyć oddychanie w stanie 2 (w obecności ADP). Inicjować oddychanie w stanie 3 poprzez dodanie ADP do stężenia końcowego 0,4 mM. Inicjować oddychanie w stanie 4 poprzez dodanie oligomycyny do stężenia końcowego 0,5 μg/ml. Oddychanie niesprzężone mierzy się poprzez dodanie 0,5 μM FCCP do komórek oddychających w stanie 3.6,7
  4. Zebrać zawiesinę komórkową z komory, wytrącić białka za pomocą kwasu nadchlorowego i odwirować osad. Określić stężenie białka w osadzie komórkowym.

5. Analiza potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm)

  1. Przygotować 0,5 mM roztwór JC-1 w sterylnym medium hodowlanym.
  2. Powoli dodać 20 μl roztworu JC-1 do każdej płytki, aby uzyskać stężenie końcowe 5 μM. Zakręcić płytką, aby dokładnie wymieszać barwnik. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora na 30 min.
  3. Umieścić płytki na lodzie, odessać medium i dwukrotnie przemyć monowarstwy lodowatym PBS. Odessać PBS, dodać 1 ml świeżego PBS, zeskrobać komórki z płytki i przenieść je do probówki Eppendorf. Rozbić monowarstwy do pojedynczych komórek poprzez wielokrotne pipetowanie.
  4. Odwirować zawiesinę przy 1 000 x g przez 2 min, odessać nadsącz, dodać 1 ml PBS do osadu i resuspender go, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. W razie potrzeby powtórzyć ten krok.
  5. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 2 min, odessać nadsącz, dodać 0,5 ml PBS i resuspender osad. Przeanalizować fluorescencję metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem wzbudzenia laserem argonowym o długości fali 488 nm. Odczytać emisję w dwóch oddzielnych kanałach: FL1 przy 525 nm oraz FL2 przy 590 nm. Potencjał błony mitochondrialnej wyraża się jako stosunek fluorescencji FL2/FL1.6

6. Izolacja mitochondriów

  1. Przygotować bufory do izolacji: Bufor A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sacharoza, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Bufor B (bufor A zawierający inhibitory proteaz, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF) oraz Bufor C (10 mM HEPES, 395 mM sacharoza, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze 0 °C (na lodzie).
  2. Przemyć monowarstwy RPTC dwukrotnie lodowatym buforem PBS. Zeskrobać monowarstwy do probówek Eppendorf i odwirować przy 500 x g przez 5 min. Przemyć osad w 1 ml Buforu A.
  3. Resuspender osad w 1 ml Buforu B i przenieść zawiesinę do homogenizatora Dounce o pojemności 2 ml.
  4. Homogenizować komórki w homogenizatorze Dounce aż do momentu, gdy w badaniu mikroskopowym większość komórek w homogenacie zostanie rozbita.
  5. Odwirować homogenat przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz i odwirować go przy 15 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  6. Odlać nadsącz i resuspender osad zawierający surowe mitochondria w 1 ml Buforu C. Odwirować nadsącze przy 15 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powtórzyć przemywanie osadu jeszcze dwa razy.5
  7. W celu pomiaru aktywności kompleksów oddechowych resuspender osad mitochondrialny w 50-100 μl buforu do analizy i zamrozić w ciekłym azocie. Próbki rozmrażać powoli na lodzie.

7. Pomiar aktywności reduktazy NADH-ubichinonowej (kompleks I)

  1. Przygotować bufor do analizy: 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, pH 7.2. Dodać BSA wolną od kwasów tłuszczowych oraz NADH, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,25% i 0,25 mM. Dodać 2 μl roztworu antymycyny A (1 mg/ml) do stężenia końcowego 2 μg/ml.
  2. Próbki analizować w przezroczystej płytce 48-dołkowej. Uwzględnić próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 500 μl buforu do analizy z dodatkami i mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
  3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 10 μl 3,25 mM ubichinonu do każdego dołka. Rejestrować absorbancję (340 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdego dołka dodać 5 μl roztworu rotenonu (1 mg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu I obliczyć jako utlenianie NADH wrażliwe na rotenon.7

8. Pomiar aktywności oksydoreduktazy bursztynianowo-ubichinonowej (Kompleks II)

  1. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,25% BSA wolnej od kwasów tłuszczowych, 20 mM bursztynianu potasu, 0,25 mM 2,6-dichloroindofenolu, 2 μg/ml antymycyny A oraz 10 μg/ml rotenonu.
  2. Próbki analizować w dubletach w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdej studni dodać 500 μl buforu do analizy z dodatkami i mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 2 min.
  3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 10 μl 3,25 mM ubichinonu do każdej studni. Rejestrować absorbancję (595 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Aktywność Kompleksu II obliczyć na podstawie redukcji 2,6-dichloroindofenolu. 7

9. Pomiar aktywności ubichinolu-cytochromu c reduktazy (Kompleks III)

  1. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, 80 mM bursztynianu potasu, 10 μg/ml rotenonu oraz 0,24 mM cyjanku potasu.
  2. Próbki należy analizować w duplikatach w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę blank, zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdej studzienki dodać 291 μl buforu do analizy z dodatkami i mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
  3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie 3 μl utlenionego cytochromu c o stężeniu 6 mM do każdej studzienki. Rejestrować absorbancję (550 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdej studzienki dodać 5 μl roztworu antymycyny A (1 mg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu III obliczyć jako redukcję cytochromu c wrażliwą na antymycynę A.7

10. Pomiar aktywności oksydazy cytochromowej (kompleksu IV)

  1. Przygotować zredukowany cytochrom c, dodając askorbinian sodu do 9 mM roztworu cytochromu c, a następnie dializując roztwór przez noc w temperaturze 4 °C w 1 L buforu fosforanowego (10 mM KH2PO4, pH 7,2) zawierającego 5 mM MgCl2. Przygotować bufor do analizy zawierający 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych oraz antymycynę A (2 μg/ml).
  2. Próbki analizować w przezroczystej płytce 48-dołkowej, uwzględniając próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Do każdego dołka dodać 233 μl buforu do analizy z dodatkami oraz mitochondriami, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez 5 min.
  3. Reakcję rozpocząć poprzez dodanie zredukowanego cytochromu c (stężenie końcowe 90 μM). Rejestrować absorbancję (550 nm) przez 3 min w odstępach 20 s. Do każdego dołka dodać 2 μl roztworu KCN (8 μg/ml) i rejestrować absorbancję przez kolejne 2 min. Aktywność kompleksu IV obliczyć jako utlenianie cytochromu c wrażliwe na KCN.7

11. Pomiar aktywności F0F1-ATPase (syntazy ATP)

  1. Przygotować bufor do analizy F0F1-ATPase (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8,2). Osad mitochondrialny resuspender w buforze do analizy, zamrozić próbki mitochondrialne w ciekłym azocie, a następnie powoli rozmrozić próbki na lodzie.
  2. Próbki analizować w trzech powtórzeniach w przezroczystej płytce 48-dołkowej. Dla każdej grupy badawczej 2 dołki zostaną wykorzystane do pomiaru całkowitej aktywności ATPase (275 μl buforu do analizy, 5 μl zawiesiny mitochondrialnej i 5 μl 95% etanolu), a 1 dołek do pomiaru aktywności ATPase niewrażliwej na oligomycynę (275 μl buforu do analizy, 5 μl zawiesiny mitochondrialnej i 5 μl roztworu oligomycyny o stężeniu 1 mg/ml w 95% etanolu).
  3. Inkubować próbki w temperaturze 31 °C przez 10 min przy ciągłym wstrząsaniu. Dodać 16 μl roztworu ATP o stężeniu 100 mM (pH 7,0) i inkubować w temperaturze 31 °C przez 5 min przy ciągłym wstrząsaniu.
  4. Przenieść 200 μl mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 50 μl 3 M TCA. Inkubować próbki na lodzie przez 10 min, a następnie wirować przy 10 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Nadnadstawki i osady wykorzystać odpowiednio do oznaczenia zawartości fosforanów oraz białka.
  5. Oznaczyć zawartość fosforanów w nadnadstawkach za pomocą testu na fosforan nieorganiczny. Przygotować 100 ml odczynnika Sumnera, dodając 0,88 g FeSO4 do 10 ml 3,75 M H2SO4 i uzupełniając objętość do 90 ml wodą H2O. Do roztworu FeSO4 w H2SO4 dodać 10 ml roztworu molibdenianu amonu (0,66 g/10 ml H2O). Chronić przed światłem.
  6. Napełnić płytkę 96-dołkową, dodając 50 μl każdego standardu fosforanowego (0 – 1 000 μM KH2PO4) oraz 50 μl każdej nadnadstawki w dwóch powtórzeniach. Do każdego dołka dodać 250 μl odczynnika Sumnera i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 15 min przy ciągłym wstrząsaniu.
  7. Zmierzyć absorbancję przy 595 nm w temperaturze pokojowej. Aktywność F0F1-ATPase wyznacza się poprzez pomiar wrażliwego na oligomycynę uwalniania Pi z ATP zgodnie z opisaną wcześniej procedurą.7,8 Obliczyć całkowitą i niewrażliwą na oligomycynę aktywność F0F1-ATPase. Aby obliczyć aktywność ATPase wrażliwą na oligomycynę, od całkowitej aktywności ATPase odjąć aktywność niewrażliwą na oligomycynę. 8,9

12. Pomiar wewnątrzkomórkowej zawartości ATP

  1. Umieścić naczynia hodowlane zawierające monowarstwy RPTC na lodzie, odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć monowarstwy lodowatym buforem PBS. Dodać 1 ml PBS do każdej monowarstwy, zeskrobować każdą monowarstwę do buforu PBS i zebrać zawiesinę komórkową do probówek typu Eppendorf. Wirować probówki Eppendorf w mikrowirówce przez 5 sec.
  2. Wyznaczyć zawartość ATP w każdej próbce RPTC metodą lucyferazy, korzystając z zestawu ATP Bioluminescence Assay Kit HS II (Roche) oraz zgodnie z protokołem producenta. Wyznaczyć stężenie białka w każdej próbce i obliczyć stężenie ATP na mg białka.8

13. Wizualizacja morfologii mitochondriów

  1. Wymień pożywkę hodowlaną. Do każdej płytki dodaj 2 μl roztworu MitoTracker Red 580 o stężeniu 100 μM (stężenie końcowe 100 nM) i wstaw płytki z powrotem do inkubatora na 30 min.
  2. Obejrzyj żywe monowarstwy pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając obiektywu imersyjnego.5

14. Analiza żywotności komórek

  1. Na 24 h przed rozpoczęciem analizy przygotować 50 mM roztwór cisplatyny do traktowania komórek, które posłużą jako kontrola pozytywna dla apoptozy (komórki wykazujące dodatni wynik dla aneksyny V). Przygotować również 500 mM roztwór nadtlenku tert-butyloperoksydu do traktowania komórek, które posłużą jako kontrole pozytywne dla onkozy (komórki wykazujące dodatni wynik dla jodku propidyny).
  2. Potraktować 2 płytki 2 μl 50 mM cisplatyny oraz 2 płytki 2 μl 500 mM nadtlenku tert-butyloperoksydu. Wyznaczyć 1 płytkę jako kontrolę bez barwienia.
  3. Na 24 h po traktowaniu cisplatyną i TBHP przygotować bufor wiążący (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2) oraz roztwór jodku propidyny (PI) (50 μg/ml) w buforze wiążącym.
  4. Przepłukać monowarstwy raz buforem wiążącym. Dodać 1 ml schłodzonego bufora i 50 μl roztworu PI do każdej płytki, z wyjątkiem kontroli bez barwienia oraz komórek wykazujących dodatni wynik dla aneksyny V. Przykryć płytki i inkubować w lodzie przez 15 min przy delikatnym wytrząsaniu orbitalnym.
  5. Przepłukać monowarstwy buforem wiążącym (10 min) i dodać 1 ml buforu wiążącego oraz 2 μl roztworu Annexin V-FITC do każdej płytki, z wyjątkiem kontroli bez barwienia oraz komórek wykazujących dodatni wynik dla PI. Przykryć płytki i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min przy delikatnym wytrząsaniu orbitalnym.
  6. Odssać bufor i przepłukać monowarstwy 1 ml schłodzonego buforu wiążącego w lodzie przez 10 min przy delikatnym wytrząsaniu orbitalnym. Powtórzyć etap płukania.
  7. Odssać bufor wiążący i dodać 500 μl buforu wiążącego do każdej płytki. Delikatnie zebrać komórki za pomocą gumowego skrobaka (tzw. rubber policeman) i przenieść je do probówek do cytometrii przepływowej. Rozproszyć komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie próbek w górę i w dół. Rozbić wszelkie skupiska komórek.
  8. Niezwłocznie zmierzyć fluorescencję PI i annexin V-FITC metodą cytometrii przepływowej, stosując wzbudzenie przy 488 nm oraz emisję przy odpowiednio 590 i 530 nm dla PI i FITC. Policzyć 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.
  9. Na wykresach kropkowych cytometrii przepływowej nanieść fluorescencję FITC na oś X, a fluorescencję PI na oś Y. Komórki wykazujące dodatni wynik dla Annexin V i ujemny dla PI uznaje się za apoptotyczne. Komórki wykazujące dodatni wynik dla PI i ujemny dla Annexin V uznaje się za onkotyczne.10,11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 pokazuje, że adenowirusowa dostawa cDNA kodującego mutanty konstytutywnie aktywne (caPKC-ε) i nieaktywne (dnPKC-ε) PKC-ε prowadzi do znaczącego wzrostu poziomu białka PKC-ε w RPTC oraz w mitochondriach. Komórki zainfekowane cDNA zawierającym wektor caPKC-ε wykazywały nadekspresję fosforylowanej (aktywnej) formy PKC-ε, natomiast komórki zainfekowane cDNA kodującym dnPKC-ε wykazywały nadekspresję nieaktywnej (niefosforylowanej) PKC-ε (Rycina 1). Obecność aktywnej PKC-ε zmniejszała...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tutaj podejście pozwala na nadekspresję poszczególnych izozymów PKC w hodowli pierwotnej komórek cewek bliższych nerek. Metoda ta posiada kilka istotnych zalet: 1. Pozwala na badanie mechanizmów regulacyjnych w homogennej populacji komórek (komórek cewek bliższych nerek), które są głównym celem dla różnych czynników uszkadzających (niedokrwienia, hipoksji, stresu oksydacyjnego), leków oraz substancji nefrotoksycznych w obrębie nerki. 2. Funkcje mitochondriów w tej in vitro model RPTC hodowanych w k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant z National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2R01DK59558 (dla G.N.). UAMS Translational Research Institute, wspierany przez grant UL1 RR029884 z National Institutes of Health National Center for Research Resources, zapewnił częściowe finansowanie dla Flow Cytometry Core w UAMS. Dziękujemy dr Peipei Ping (University of California at Los Angeles; Los Angeles, CA) za udostępnienie aliquoty adenowirusa niosącego cDNA kodujące dominujący negatywny (nieaktywny) mutant PKC-ε oraz dr Allenowi Samarelowi (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) za udostępnienie aliquoty wektora adenowirusowego kodującego konstytutywnie aktywny mutant PKC-ε. Dziękujemy również dr Peterowi Parkerowi i dr Peterowi Sugdenowi (Imperial College London, Londyn, UK) za udostępnienie cDNA kodującego konstytutywnie aktywną PKC-ε.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrzaThermo Electron CorporationFORMA 1104
Homogenizator tkanek Dounce 2 ml i 15 mlWHEATON989-24607, 357544
Sito nylonowe 85 i 235 mikronówSmall PartsCMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
Sterylna probówka wirówkowa 50 mlBIOLOGIXBCT-P 50BS
Mikroprobówka 1,5 mlSarstedt72.690.001
Sterylne szalki hodowlane 35 x 10 mmCorning430165
Wirówka JouanJouanJouan CR3 11175704 Rotory: Jouan T40
Regulowana mikrowirówkaSIGMAModel 1 - 15
Monitor biologicznego zużycia tlenuYSI IncorporatedYSI Model 5300A
Jednokomorowy mikro system pomiaru tlenuYSI Incorporated5356S
Sonda tlenowaYSI Incorporated5331A
Łaźnia cyrkulacyjnaYSI Incorporated5310
Zestaw membran standardowych i KClYSI Incorporated5775
Mieszadło magnetyczneYSI Incorporated5222
Rejestrator płaskiKipp ZonenBD 11E
Przezroczyste płytki 48- i 96-dołkoweCostar3548, 3679
Thermomixer REppendorf5355 21919
Wstrząsarka orbitalna MAXQ 2000Thermo ScientificSHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (czytnik absorbancji/fluorescencji/luminescencji)TecanF129005
Inkubator automatyczny do CO2 z płaszczem wodnym US AutoflowNUAIRENU 4850
Polistyrenowe probówki hodowlane 12x75 mm do cytometrii przepływowejFisher Brand14-961-20
Axioskop
Obiektyw immersyjny wodny 63x / 0,90W		Carl Zeiss114846
ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12Cellgro99 - 830 - PB
DMEM / F12 HamSigmaD 2906 - 1L
Mezylan deferoksaminyHospiraD110
Kolagenaza typu IWorthington4196
Inhibitor trypsynySigmaT 6522 - 500mg
jodek 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylkarbocyjaniny (JC-1)InvitrogenT3168
Mitotracker RedInvitrogenM22425
Zestaw do bioluminescencyjnego oznaczania ATP HS IIRoche11 699 709 001
Roztwór Aneksyny V - FITCBioVision1001 - 200
Cytometr przepływowyBD BiosciencesBD FACSCalibur

Bibliografia

  1. Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
  2. Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
  3. Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
  4. Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
  5. Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
  6. Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
  7. Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
  8. Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
  9. Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
  10. Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
  11. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kinaza białkowa C epsilonfunkcja mitochondriówkomórki cewkowe proksymalne nerektransfekcja wektorem adenowirusowymoddychanie mitochondrialnetempo produkcji ATPpotencjał błony mitochondrialnejcytometria przepływowaMitoTracker Red 580Annexin V i jodek propidyny
Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.