Artykuł metodologiczny

Monitorowanie replikacji plazmidu w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/4305

⸱

13 grudnia 2012

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu znakowanego fluorescencyjnie białka represorowego lac z miejscami wiązania zmodyfikowanymi w DNA będącym przedmiotem zainteresowania. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych DNA w żywych komórkach w czasie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewiele naturalnie występujących plazmidów utrzymuje się w komórkach ssaków. Wśród nich znajdują się genomy gamma-herpeswirusów, w tym wirusa Epsteina-Barr (EBV) i herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV), które powodują wiele nowotworów złośliwych u ludzi 1-3. Te dwa genomy są replikowane w licencjonowany sposób, każdy przy użyciu pojedynczego białka wirusowego i maszynerii replikacji komórkowej, i są przekazywane do komórek potomnych podczas podziału komórki, pomimo braku tradycyjnych centromerów 4-8.

Wykonano wiele pracy, aby scharakteryzować replikacje tych genomów plazmidowych za pomocą metod takich jak Southern blotting i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Metody te są jednak ograniczone. Ilościowy PCR i Southern blot dostarczają informacji o średniej liczbie plazmidów na komórkę w populacji komórek. FISH to test jednokomórkowy, który ujawnia zarówno średnią liczbę, jak i rozmieszczenie plazmidów na komórkę w populacji komórek, ale jest statyczny, nie pozwala na uzyskanie informacji o rodzicu lub potomstwie badanej komórki.

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji plazmidów w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na wiązaniu znakowanego fluorescencyjnie białka represorowego laktozy z wieloma miejscami w plazmidzie będącym przedmiotem zainteresowania 9. Interesujące nas DNA zostało zaprojektowane tak, aby zawierało około 250 tandemowych powtórzeń sekwencji operatora laktozy (LacO). LacO jest specyficznie związany przez białko represorowe laktozy (LacI), które może być połączone z białkiem fluorescencyjnym. Białko fuzyjne może być eksprymowane ze zmodyfikowanego plazmidu lub wprowadzane przez wektor retrowirusowy. W ten sposób cząsteczki DNA są znakowane fluorescencyjnie i dlatego stają się widoczne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Białko fuzyjne jest blokowane przed wiązaniem plazmidowego DNA przez hodowlę komórek w obecności IPTG, dopóki plazmidy nie będą gotowe do oglądania.

Ten system pozwala na monitorowanie plazmidów w żywych komórkach przez kilka pokoleń, ujawniając właściwości ich syntezy i podziału na komórki potomne. Idealne komórki są przylegające, łatwo transfekowane i mają duże jądra. Technika ta została wykorzystana do określenia, że 84% plazmidów pochodzących z EBV jest syntetyzowanych w każdym pokoleniu, a 88% nowo zsyntetyzowanych plazmidów dzieli się wiernie na komórki potomne w komórkach HeLa. Zaobserwowano, że pary tych plazmidów EBV są przywiązane lub związane z chromatydami siostrzanymi po ich syntezie w fazie S, dopóki nie zaobserwowano, że rozdzielają się, gdy chromatydy siostrzane rozdzielają się w Anafazie10. Metoda ta jest obecnie wykorzystywana do badania replikacji genomów KSHV w komórkach HeLa i komórkach SLK. Komórki HeLa są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, a komórki SLK są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka. Chociaż komórki SLK pierwotnie pochodziły ze zmiany KSHV, ani linia komórkowa HeLa, ani SLK nie zawierają naturalnie genomów KSHV11. Oprócz badania replikacji wirusa, ta technika wizualizacji może być wykorzystana do zbadania wpływu dodawania, usuwania lub mutacji różnych elementów sekwencji DNA na syntezę, lokalizację i partycjonowanie innych rekombinowanych plazmidowych DNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inżynieria komórek z widocznymi plazmidami

  1. Zastosuj standardowe techniki trawienia restrykcyjnego lub rekombinacji homologicznej, aby wprowadzić fragment DNA zawierający około 250 kopii sekwencji operatora laktozy (LacO) do plazmidu, który ma być wizualizowany. Nasz plazmid był BACmid o wielkości około 170 kbp i zawierał cały genom wirusa opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i kodowaną oporność na higromycynę 12.
  2. Wprowadzić plazmidowe DNA zawierające LacO do komórek ssaków przez transfekcję z Lipofectamine 2000. Transfekowaliśmy komórki HeLa i SLK w szalkach 60 mm przez 4 godziny z 10 μg oczyszczonego plazmidowego DNA z 25 μl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM i 3,5 ml DMEM.
  3. Zmienić pożywkę hodowlaną na 5 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubować komórki przez 48 godzin.
  4. Płytki komórek o niskiej gęstości w dużych naczyniach i hodowle komórek w pożywce zawierającej selekcję antybiotyków dla wprowadzonego plazmidu; wybraliśmy komórki w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą z 300 μg / ml higromycyny przez 3 tygodnie.
  5. Użyj kawałków sterylnej, nasączonej trypsyną bibuły filtracyjnej, aby przenieść kolonie odporne na higromycynę do nowych naczyń hodowlanych.
  6. Kiedy transfekowane klony wyrosną, aby wypełnić naczynie, wyizoluj DNA do trawienia restrykcyjnego i Southern blot, aby upewnić się, że polimer plazmidu LacO jest jednorodny i ma oczekiwany rozmiar.
  7. Jeśli plazmid nie został zmodyfikowany do ekspresji fuzji LacI, należy zainfekować odpowiednie klony retrowirusem kodującym represor laktozy (LacI) połączony z białkiem czerwonej fluorescencji, takim jak LacI-tdTomato. Używamy tdTomato zamiast białek, które fluoryzują bliżej zieleni, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby w wyniku wielokrotnej ekspozycji przez długi czas13.
  8. Po wprowadzeniu białka fuzyjnego LacI należy wyhodować komórki w obecności 200 μg/ml izopropylo-b-D-tiogalaktozydu (IPTG), aby zablokować białka fuzyjne przed wiązaniem DNA.
  9. Hoduj komórki przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić ekspresję białka LacI-tdTomato.
  10. Klony przesiewowe (poprzez wypłukanie IPTG i oglądanie komórek, jak opisano poniżej) pod kątem tych z optymalnymi poziomami LacI-tdTomato, które ujawniają wyraźne sygnały z minimalnymi poziomami tła niezwiązanego białka fuzyjnego.

2. Rozwój systemu obrazowania

Nasz system obrazowania składa się z Zeiss Axiovert 200M wyposażonego w zmotoryzowany stolik i obiektyw olejowy Plan-Aochromat 63x/1.4. Światło wzbudzenia fluorescencji zapewnia dioda LED o barwie "neutralnej białej" systemu Colibri. Emisja jest wykrywana przez kamerę CascadeII:1024 EMCCD. Jest to chłodzona, rozcieńczona od tyłu kamera z rejestrem wzmocnienia do wzmacniania sygnałów; Ciemny prąd wynosi 0,061 elektronów na piksel na sekundę, a wydajność kwantowa jest większa niż 0,90. Sterowanie systemem odbywa się za pomocą oprogramowania Axiovision 4.8, w tym modułu SmartExperiments. Do detekcji tdTomato używamy zestawu filtrów Zeiss 75HE, dla którego 85% przepuszczanego światła może wzbudzić fluor, a 95% emitowanego światła przejdzie przez filtr emisyjny.

  1. Zmontuj system obrazowania z odwróconym mikroskopem i kamerą EMCCD do czułego wykrywania sygnałów, źródłem światła LED do określonego wzbudzenia i szybkiego zamykania, zmotoryzowanym stolikiem i ramieniem ostrości oraz oprogramowaniem sterującym do automatycznego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wieloma stosami z. System powinien znajdować się na stole powietrznym, aby był odizolowany od wibracji.
  2. Zamontuj inkubator typu stage-top, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 °C, 5-10% CO2 w wilgotnej komorze. Daj wystarczająco dużo czasu, aby system osiągnął stabilną temperaturę, aby zminimalizować artefakty ruchu podczas eksperymentu.
  3. Użyj podgrzewanego kołnierza do obiektywu, aby zapobiec odprowadzaniu ciepła z sample przez obiektyw
    4. .

3. Wizualizacja znakowanego DNA

  1. Umieść komórki w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm o gęstości mniejszej niż 10% konfluencji, co pozwoli parom komórek podzielić się na kolonie po 8-16 komórek bez nakładania się na siebie. Zrób to co najmniej 24-48 godzin przed obrazowaniem, aby żywe komórki miały czas na podział.
  2. Na jedną do trzech godzin przed rozpoczęciem obrazowania należy przepłukać płytkę 3 razy pożywką hodowlaną, która nie zawiera zarówno selektywnych leków, jak i IPTG. Ta procedura wypłukuje niezdolne do życia komórki i pozwala białkom fuzyjnym LacI wiązać miejsca LacO w plazmidach.
  3. Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml DMEM 10% płodową surowicą bydlęcą i 25 mM HEPES.
  4. Zastąp górną część naczynia hodowlanego folią CultFoil rozciągniętą w pierścieniu montażowym dla naczynia 35 mm. Ta osłona zahamuje parowanie pożywki hodowlanej, co z czasem zwiększy stężenie soli i zabije komórki.
  5. Użyj obrazowania z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC), aby wyświetlić komórki i określić płaszczyznę ogniskową górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia. W każdym polu przejdź do płaszczyzny ogniskowej znajdującej się około 1/3 drogi w dół od góry komórki. Zapisz współrzędne x, y, z na liście zapisanych pozycji etapów.
    Uwaga: Sygnały plazmidowe mogą nie być widoczne przez okulary, gdy komórki są oświetlone diodami LED o długości fali odpowiedniej dla białka fuzyjnego LacI. Słabe sygnały mogą być widoczne tylko przy użyciu kamery EMCCD, która umożliwia integrację sygnału w czasie, a tym samym skutecznie wzmacnia słabe sygnały.
  6. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj stos obrazów, które mają być wykonywane w każdej zapisanej pozycji stolika. Wybierz rozmiar kroku z 0,35-0,50 μm, co pozwoli Ci w przybliżeniu określić próbkowanie Nyquista w wymiarze z14. Uwzględnij "dodatkowe" plasterki powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki; Warstwy te umożliwiają detekcję podążającą za ruchami komórek podczas cyklu komórkowego, a także są wykorzystywane w przetwarzaniu po akwizycji (dekonwolucji) stosów obrazów. To włączenie spowoduje powstanie stosu 40-60 obrazów, w zależności od grubości komórek.
  7. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj eksperyment szeregów czasowych, aby zebrać obraz jasnego pola stosów z w odstępach 30-minutowych (do śledzenia podziałów i migracji komórek w długim czasie) oraz obrazów fluorescencyjnych w odstępach 10-60 minut (do wizualizacji plazmidów w komórkach). Nie należy używać obrazowania DIC podczas eksperymentu, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność w trakcie długich eksperymentów.
  8. Rozpocznij eksperyment sterowany programowo. Upewnij się, że system nie jest zakłócony (uderzony, wystawiony na nadmierne światło w pomieszczeniu itp.) podczas eksperymentu.
  9. W razie potrzeby uzupełnij wodę w systemie nawilżania podczas eksperymentu.

4. Przetwarzanie obrazów po akwizycji

  1. Przejrzyj obrazy dla każdego stosu z i punktu czasowego. W następnym kroku wytnij wszystkie niepotrzebne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputera.
  2. Użyj algorytmu dekonwolucji, aby ponownie przypisać intensywność sygnału do piksela początkowego w każdym stosie z15. Chociaż ta dekonwolucja może być oparta na teoretycznej funkcji rozproszenia punktów dla twojego systemu obrazowania, lepiej jest zmierzyć funkcję rozproszenia punktowego twojego konkretnego systemu poprzez obrazowanie mikrosfer fluorescencyjnych i użyć tego pomiaru w algorytmie dekonwolucji. Zmierzyliśmy funkcję rozrzutu punktowego naszego systemu obrazowania i zastosowaliśmy ograniczony iteracyjny algorytm maksymalnego prawdopodobieństwa w oprogramowaniu AxioVision (opis oprogramowania AxioVision, Zeiss).
  3. Zbadaj obrazy, aby śledzić intensywność, zmiany i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz partycjonowanie plazmidów do komórek potomnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maksymalne projekcje intensywności stosów z uzyskane w reprezentatywnym eksperymencie są pokazane na rysunku 3. Typowe sygnały plazmidowe są obecne w 3-8 wycinkach stosu z, w zależności od tego, czy reprezentują one pojedynczy, czy skupiska plazmidów. W przypadku plazmidów pochodzących z EBV i KSHV sygnały poruszają się powoli w komórce, aż komórka osiągnie mitozę. Same komórki migrują w trakcie eksperymentu. Stają się również kuliste i odrywają się od naczynia podczas mitozy. Cykl komórkowy dla zdrowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do śledzenia plazmidów w żywych komórkach ssaków w czasie obejmującym wiele pokoleń. Ograniczając ekspozycję na światło wzbudzające, wykorzystaliśmy te techniki do śledzenia komórek z nowo podzielonych par przez kolonie 16-32 komórek, reprezentujące co najmniej 72 godziny i 3 podziały komórkowe. Eksperymenty te dostarczają informacji, których nie można uzyskać za pomocą testów statycznych, takich jak ilościowy PCR, Southern blotting i FISH.

Niezbędne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów z NIH i ACS, w tym T32CA009135, CA133027, CA070723 i CA022443. Bill Sugden jest profesorem Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGIBCO11965
OptiMEMGIBCO31985
Surowica bydlęcapłodu HyclonSH30910.03
PenicylinaSigmaP3032
Siarczan streptomycynySigmaS9137
HygromycynaCalbiochem400050400 μ g/ml dla SLK; 300 μ g/ml dla HeLa
Isopropylo-b-D-tiogalaktozyd (IPTG)Roche10 724 815 001Stężenie końcowe 200 μ g/ml
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
HEPESGIBCO15630
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-10-C
CultFoilPecon000000-1116-08
Axiovert 200MZeiss
ColibriZeiss423052-9500-000
Neutralna biała dioda LEDZeiss423052-9120-000
Kostka filtra 75 HEZeiss489075-0000-000
Plan-Apochromat 63x/1.4 ObiektywZeiss440762-9904-000
CascadeII:1024 Kamera EMCCDFotometriaB10C892007
Tempcontrol miniZeiss/Pecon000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 cyfrowyZeiss/Pecon000000-1052-320
Sterownik CTI 3700 cyfrowyZeiss/Pecon411856-9903
Grzejnik obiektywowyZeiss/Pecon440760-0000-000
Wkład grzewczy sceniczny PZeiss/Pecon411861-9901-000
Inkubator Stage SZeiss/Pecon411860-9902-000
Nawilżacz powietrza SystemZeiss/Pecon000000-1116-065

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  3. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  4. Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
  5. Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
  6. Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
  7. Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
  8. Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
  9. Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
  10. Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
  11. Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
  12. Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  14. Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
  15. Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Plasmid ReplicationFluorescence MicroscopyLive Cell ImagingLactose OperatorFluorescent Protein FusionViral Genome PartitioningCell Division TrackingFluorescent TaggingTime Lapse ImagingHeLa Cells

Powiązane artykuły