$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Niewiele naturalnie występujących plazmidów utrzymuje się w komórkach ssaków. Wśród nich znajdują się genomy gamma-herpeswirusów, w tym wirusa Epsteina-Barr (EBV) i herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV), które powodują wiele nowotworów złośliwych u ludzi 1-3. Te dwa genomy są replikowane w licencjonowany sposób, każdy przy użyciu pojedynczego białka wirusowego i maszynerii replikacji komórkowej, i są przekazywane do komórek potomnych podczas podziału komórki, pomimo braku tradycyjnych centromerów 4-8.
Wykonano wiele pracy, aby scharakteryzować replikacje tych genomów plazmidowych za pomocą metod takich jak Southern blotting i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Metody te są jednak ograniczone. Ilościowy PCR i Southern blot dostarczają informacji o średniej liczbie plazmidów na komórkę w populacji komórek. FISH to test jednokomórkowy, który ujawnia zarówno średnią liczbę, jak i rozmieszczenie plazmidów na komórkę w populacji komórek, ale jest statyczny, nie pozwala na uzyskanie informacji o rodzicu lub potomstwie badanej komórki.
Tutaj opisujemy metodę wizualizacji plazmidów w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na wiązaniu znakowanego fluorescencyjnie białka represorowego laktozy z wieloma miejscami w plazmidzie będącym przedmiotem zainteresowania 9. Interesujące nas DNA zostało zaprojektowane tak, aby zawierało około 250 tandemowych powtórzeń sekwencji operatora laktozy (LacO). LacO jest specyficznie związany przez białko represorowe laktozy (LacI), które może być połączone z białkiem fluorescencyjnym. Białko fuzyjne może być eksprymowane ze zmodyfikowanego plazmidu lub wprowadzane przez wektor retrowirusowy. W ten sposób cząsteczki DNA są znakowane fluorescencyjnie i dlatego stają się widoczne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Białko fuzyjne jest blokowane przed wiązaniem plazmidowego DNA przez hodowlę komórek w obecności IPTG, dopóki plazmidy nie będą gotowe do oglądania.
Ten system pozwala na monitorowanie plazmidów w żywych komórkach przez kilka pokoleń, ujawniając właściwości ich syntezy i podziału na komórki potomne. Idealne komórki są przylegające, łatwo transfekowane i mają duże jądra. Technika ta została wykorzystana do określenia, że 84% plazmidów pochodzących z EBV jest syntetyzowanych w każdym pokoleniu, a 88% nowo zsyntetyzowanych plazmidów dzieli się wiernie na komórki potomne w komórkach HeLa. Zaobserwowano, że pary tych plazmidów EBV są przywiązane lub związane z chromatydami siostrzanymi po ich syntezie w fazie S, dopóki nie zaobserwowano, że rozdzielają się, gdy chromatydy siostrzane rozdzielają się w Anafazie10. Metoda ta jest obecnie wykorzystywana do badania replikacji genomów KSHV w komórkach HeLa i komórkach SLK. Komórki HeLa są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, a komórki SLK są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka. Chociaż komórki SLK pierwotnie pochodziły ze zmiany KSHV, ani linia komórkowa HeLa, ani SLK nie zawierają naturalnie genomów KSHV11. Oprócz badania replikacji wirusa, ta technika wizualizacji może być wykorzystana do zbadania wpływu dodawania, usuwania lub mutacji różnych elementów sekwencji DNA na syntezę, lokalizację i partycjonowanie innych rekombinowanych plazmidowych DNA.