Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4305

⸱

13 grudnia 2012

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Streszczenie

Niewiele naturalnie występujących plazmidów jest utrzymywanych w komórkach ssaków. Wśród nich znajdują się genomy gamma-herpeswirusów, w tym wirus Epsteina-Barr (EBV) oraz herpeswirus związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV), które wywołują liczne nowotwory u ludzi 1-3. Te dwa genomy replikują się w sposób licencjonowany, przy czym każdy z nich wykorzystuje pojedyncze białko wirusowe oraz komórkowy aparat replikacyjny, i są przekazywane komórkom potomnym podczas podziału komórki, pomimo braku tradycyjnych centromerów 4-8.

Przeprowadzono wiele badań w celu scharakteryzowania replikacji tych genomów plazmidowych przy użyciu takich metod jak Southern blotting oraz fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Metody te mają jednak swoje ograniczenia. Ilościowy PCR i Southern blotting dostarczają informacji o średniej liczbie plazmidów na komórkę w populacji komórek. FISH jest testem jednokomórkowym, który ujawnia zarówno średnią liczbę, jak i rozkład plazmidów na komórkę w populacji, lecz jest on statyczny, co uniemożliwia uzyskanie informacji o komórce macierzystej lub potomstwie badanej komórki.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wizualizacji plazmidów w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na wiązaniu białka represora laktozy z etykietą fluorescencyjną do wielu miejsc w badanym plazmidzie 9. DNA poddane analizie jest modyfikowane tak, aby zawierało około 250 tandemowych powtórzeń sekwencji operatora laktozy (LacO). LacO jest specyficznie wiązany przez białko represora laktozy (LacI), które może być połączone z białkiem fluorescencyjnym. Białko fuzyjne może być ekspresowane z zmodyfikowanego plazmidu lub wprowadzone za pomocą wektora retrowirusowego. W ten sposób cząsteczki DNA zostają oznakowane fluorescencyjnie, dzięki czemu stają się widoczne w mikroskopii fluorescencyjnej. Wiązanie białka fuzyjnego z DNA plazmidowym jest blokowane poprzez hodowlę komórek w obecności IPTG do momentu, aż plazmidy będą gotowe do obserwacji.

System ten pozwala na monitorowanie plazmidów w żywych komórkach przez kilka pokoleń, co ujawnia właściwości ich syntezy i rozdziału do komórek potomnych. Idealne komórki są przylegające, łatwo ulegają transfekcji i posiadają duże jądra. Technika ta została wykorzystana do ustalenia, że w komórkach HeLa 84% plazmidów pochodzących z EBV jest syntetyzowanych w każdym pokoleniu, a 88% nowo syntetyzowanych plazmidów jest wiernie rozdzielanych do komórek potomnych. Zaobserwowano, że pary tych plazmidów EBV są przywiązane do chromatyd siostrzanych lub z nimi związane po syntezie w fazie S, aż do momentu ich rozdzielenia podczas separacji chromatyd siostrzanych w anafazie10. Metoda ta jest obecnie wykorzystywana do badania replikacji genomów KSHV w komórkach HeLa i SLK. Komórki HeLa są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, a komórki SLK są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka. Chociaż komórki SLK pochodziły pierwotnie z zmiany wywołanej przez KSHV, ani linia HeLa, ani SLK nie posiadają naturalnie genomów KSHV11. Oprócz badania replikacji wirusowej, ta technika wizualizacji może być stosowana do badania wpływu dodania, usunięcia lub mutacji różnych elementów sekwencji DNA na syntezę, lokalizację i rozdział innych rekombinowanych plazmidowych DNA.

Protokół

1. Inżynieria komórek z plazmidami widocznymi

  1. Należy zastosować standardowe techniki trawienia restrykcyjnego lub rekombinacji homologicznej, aby wprowadzić do wizualizowanego plazmidu fragment DNA zawierający około 250 kopii sekwencji operatora laktozy (LacO). Nasz plazmid był BACmid o wielkości około 170 kbp, zawierał cały genom wirusa herpes powiązanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i kodował oporność na hygromycynę 12.
  2. DNA plazmidu zawierającego LacO należy wprowadzić do komórek ssaków poprzez transfekcję przy użyciu Lipofectamine 2000. Transfekcję komórek HeLa i SLK w szalkach 60 mm przeprowadzono przez 4 hr, stosując 10 μg oczyszczonego DNA plazmidowego z 25 μl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM i 3,5 ml DMEM.
  3. Należy wymienić pożywkę hodowlaną na 5 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubować komórki przez 48 hr.
  4. Komórki należy wysiać przy niskiej gęstości w dużych szalkach i hodować w pożywce zawierającej antybiotyk selekcyjny dla wprowadzonego plazmidu; selekcję komórek przeprowadzano w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 300 μg/ml hygromycyny przez 3 tygodnie.
  5. Do przeniesienia kolonii opornych na hygromycynę do nowych szalek hodowlanych należy użyć kawałków sterylnego papieru filtracyjnego nasączonego trypsyną.
  6. Gdy transfekowane klony urosną i wypełnią szalkę, należy wyizolować DNA do trawienia restrykcyjnego i Southern blottingu, aby upewnić się, że polimer plazmidu LacO jest homogeniczny i ma oczekiwaną wielkość.
  7. Jeśli plazmid nie został zaprojektowany do ekspresji białka fuzyjnego LacI, należy zainfekować odpowiednie klony retrowirusem kodującym represor laktozy (LacI) połączony z czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak LacI-tdTomato. Użyliśmy tdTomato zamiast białek fluorescujących w kolorze zbliżonym do zielonego, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby przy wielokrotnych ekspozycjach przez dłuższy czas13.
  8. Po wprowadzeniu białka fuzyjnego LacI, komórki należy hodować w obecności 200 μg/ml izopropyl-b-D-tiogalaktosydu (IPTG), aby zablokować wiązanie białek fuzyjnych z DNA.
  9. Komórki należy hodować przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić ekspresję białka LacI-tdTomato.
  10. Należy przeprowadzić przesiew klonów (poprzez wypłukanie IPTG i obserwację komórek zgodnie z opisem poniżej), aby wyłonić te z optymalnym poziomem LacI-tdTomato, które wykazują wyraźne sygnały przy minimalnym poziomie tła niezwiązanego białka fuzyjnego.

2. Opracowanie systemu obrazowania

Nasz system obrazowania składa się z mikroskopu Zeiss Axiovert 200M wyposażonego w zmotoryzowany stolik oraz obiektyw olejowy Plan-Aochromat 63x/1.4. Światło wzbudzenia fluorescencji jest dostarczane przez „neutralną białą” diodę LED systemu Colibri. Emisję wykrywa kamera CascadeII:1024 EMCCD. Jest to chłodzona kamera z utońszoną tylną ścianką i rejestrem wzmocnienia do amplifikacji sygnałów; prąd ciemny wynosi 0,061 elektronów na piksel na sekundę, a wydajność kwantowa jest większa niż 0,90. System jest sterowany za pomocą oprogramowania Axiovision 4.8, w tym modułu SmartExperiments. Do detekcji tdTomato używamy zestawu filtrów Zeiss 75HE, dla którego 85% światła przechodzącego może wzbudzić fluorofor, a 95% światła emitowanego przechodzi przez filtr emisyjny.

  1. Zmontuj system obrazowania składający się z mikroskopu odwróconego i kamery EMCCD do czułego wykrywania sygnałów, źródła światła LED do specyficznego wzbudzania i szybkiego przysłaniania, zmotoryzowanego stolika i ramienia ostrzenia oraz oprogramowania sterującego do zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wieloma stosami z (z-stacks). System powinien spoczywać na stole pneumatycznym w celu izolacji od wibracji.
  2. Zmontuj inkubator nakładany na stolik, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5-10% CO2 w nawilżonej komorze. Odczekaj wystarczający czas, aż system osiągnie stabilną temperaturę, aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas eksperymentu.
  3. Zastosuj podgrzewaną obręcz dla obiektywu, aby zapobiec odprowadzaniu ciepła z próbki przez obiektyw.

3. Wizualizacja znakowanego DNA

  1. Wysiej komórki w szalku z szklanym dnem o średnicy 35 mm przy gęstości poniżej 10% konfluencji, co pozwoli parom komórek na podział w kolonie od 8 do 16 komórek bez ich nakładania się. Należy to zrobić co najmniej 24-48 hr przed obrazowaniem, aby żywe komórki miały czas na podział.
  2. Od jednej do trzech hr przed rozpoczęciem obrazowania przepłucz szalkę 3 razy pożywką hodowlaną pozbawioną zarówno leków selekcyjnych, jak i IPTG. Procedura ta usuwa nieżywe komórki i umożliwia białkom fuzyjnym LacI wiązanie się z miejscami LacO w plazmidach.
  3. Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 25 mM HEPES.
  4. Zastąp górną część szalki hodowlanej folią CultFoil rozpiętą w pierścieniu montażowym do szalek 35 mm. Przykrycie to zapobiegnie odparowywaniu pożywki hodowlanej, co z czasem zwiększyłoby stężenie soli i doprowadziło do śmierci komórek.
  5. Użyj obrazowania z kontrastem interferencyjnym (DIC), aby obejrzeć komórki i wyznaczyć płaszczyznę ogniskowania górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia. W każdym polu przejdź do płaszczyzny ogniskowania znajdującej się mniej więcej 1/3 drogi od góry komórki. Zapisz współrzędne x, y, z na liście zapisanych pozycji stolika.
    Uwaga: Sygnały plazmidowe mogą nie być widoczne przez okulary, gdy komórki są oświetlane diodami LED o długości fali odpowiedniej dla białka fuzyjnego LacI. Słabe sygnały mogą być widoczne jedynie przy użyciu kamery EMCCD, która umożliwia całkowanie sygnału w czasie, a tym samym skutecznie wzmacnia słabe sygnały.
  6. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj stos obrazów z (z-stack), który ma zostać wykonany w każdej zapisanej pozycji stolika. Wybierz wielkość kroku z wynoszącą 0.35-0.50 μm, co pozwoli na przybliżenie próbkowania Nyquista w wymiarze z14. Uwzględnij „dodatkowe” przekroje powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki; przekroje te umożliwiają detekcję po ruchach komórek podczas cyklu komórkowego i są również wykorzystywane w przetwarzaniu post-akwizycyjnym (dekonwolucji) stosów obrazów. Takie podejście zaowocuje stosem 40-60 obrazów, w zależności od grubości komórek.
  7. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj eksperyment z szeregiem czasowym, aby zbierać obrazy w jasnym polu dla stosów z w odstępach 30 min (do śledzenia podziałów i migracji komórek w długim czasie) oraz obrazy fluorescencyjne w odstępach 10-60 min (do wizualizacji plazmidów wewnątrz komórek). Nie używaj obrazowania DIC podczas eksperymentu, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność w trakcie długich eksperymentów.
  8. Uruchom sterowany programowo eksperyment. Upewnij się, że system nie jest zakłócany (np. przez wstrząsy, ekspozycję na nadmierne światło w pomieszczeniu) podczas trwania eksperymentu.
  9. W razie potrzeby uzupełnij wodę w systemie nawilżania w trakcie eksperymentu.

4. Przetwarzanie obrazów po akwizycji

  1. Przejrzyj obrazy dla każdego stosu z (z-stack) oraz punktu czasowego. Wytnij zbędne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputerowego w następnym kroku.
  2. Użyj algorytmu dekonwolucji, aby przypisać intensywność sygnału z powrotem do piksela pochodzenia w każdym stosie z15. Choć dekonwolucja może opierać się na teoretycznej funkcji rozproszenia punktu (PSF) dla danego systemu obrazowania, zaleca się pomiar funkcji rozproszenia punktu dla konkretnego systemu poprzez obrazowanie fluorescencyjnych mikrosfer i wykorzystanie tego pomiaru w algorytmie dekonwolucji. Zmierzyliśmy funkcję rozproszenia punktu naszego systemu obrazowania i zastosowaliśmy ograniczony iteracyjny algorytm maksymalnej wiarygodności w oprogramowaniu AxioVision (opis oprogramowania AxioVision, Zeiss).
  3. Przeanalizuj obrazy, aby śledzić zmiany intensywności i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz podział plazmidów do komórek potomnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Maksymalne projekcje intensywności stosów z (z-stacks) uzyskane w reprezentatywnym eksperymencie przedstawiono na Rysunku 3. Typowe sygnały plazmidów występują w 3-8 warstwach stosu z, w zależności od tego, czy reprezentują one pojedyncze plazmidy, czy ich skupiska. W przypadku plazmidów pochodzących z EBV i KSHV sygnały przemieszczają się powoli w obrębie komórki, aż do momentu wejścia komórki w fazę mitozy. Same komórki migrują w trakcie trwania eksperymentu. Podczas mitozy stają się one również sferyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do śledzenia plazmidów w żywych komórkach ssaków w czasie obejmującym wiele pokoleń. Poprzez ograniczenie ekspozycji na światło wzbudzenia, wykorzystaliśmy te techniki do śledzenia komórek od nowo podzielonych par aż po kolonie liczące 16-32 komórki, co reprezentuje co najmniej 72 hr i 3 podziały komórkowe. Eksperymenty te dostarczają informacji, których nie można uzyskać za pomocą analiz statycznych, takich jak ilościowy PCR, Southern blotting oraz FISH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH oraz ACS, w tym T32CA009135, CA133027, CA070723 oraz CA022443. Bill Sugden jest profesorem badawczym American Cancer Society.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGIBCO11965
OptiMEMGIBCO31985
Płodowa surowica bydlęcaHycloneSH30910.03
PenicylinaSigmaP3032
Siarczan streptomycynySigmaS9137
HygromycynaCalbiochem400050400 μg/ml dla SLK; 300 μg/ml dla HeLa
Izopropyl-b-D-tiogalaktozyd (IPTG)Roche10 724 815 001Stężenie końcowe 200 μg/ml
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
HEPESGIBCO15630
Szalki z dnem szklanymMatTekP35G-1.5-10-C
CultFoilPecon000000-1116-08
Axiovert 200MZeiss
ColibriZeiss423052-9500-000
Neutralna biała dioda LEDZeiss423052-9120-000
Kostka filtrująca 75 HEZeiss489075-0000-000
Obiektyw Plan-Apochromat 63x/1.4Zeiss440762-9904-000
Kamera EMCCD CascadeII:1024PhotometricsB10C892007
Tempcontrol miniZeiss/Pecon000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 digitalZeiss/Pecon000000-1052-320
Sterownik CTI Controller 3700 digitalZeiss/Pecon411856-9903
Grzałka obiektywuZeiss/Pecon440760-0000-000
Wkładka grzewcza stolika PZeiss/Pecon411861-9901-000
Inkubator nadstolikowy SZeiss/Pecon411860-9902-000
System nawilżającyZeiss/Pecon000000-1116-065

Bibliografia

  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  3. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  4. Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
  5. Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
  6. Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
  7. Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
  8. Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
  9. Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
  10. Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
  11. Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
  12. Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  14. Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
  15. Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie żywych komórekoperator laktozyfuzja białka fluorescencyjnegopartycjonowanie genomu wirusowegośledzenie podziałów komórkowychznakowanie fluorescencyjneobrazowanie poklatkowekomórki HeLa
Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.