Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Podsumowanie

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Streszczenie

Rdzeniowy motoneuron od dawna stanowi doskonały model do badania funkcji neuronalnych, ponieważ jest to neuron ośrodkowego układu nerwowego o unikalnych właściwościach: (1) posiada łatwo identyfikowalne cele (włókna mięśniowe), a co za tym idzie, ma bardzo dobrze znaną funkcję (kontrola skurczu mięśni); (2) jest zbieżnym celem wielu rdzeniowych i zstępujących sieci, stąd nazwa „final common pathway” (ostateczna wspólna droga); oraz (3) posiada duże soma, co umożliwia penetrację elektrodami wewnątrzkomórkowymi. Ponadto, podczas badań in vivo, możliwe jest jednoczesne rejestrowanie aktywności elektrycznej motoneuronów oraz siły generowanej przez ich mięśniowe cele. Wykonywanie rejestracji wewnątrzkomórkowej motoneuronów in vivo stawia zatem eksperymentatora w unikalnej pozycji, umożliwiając jednoczesne badanie wszystkich komponentów „jednostki motorycznej” (nazwa obejmująca motoneuron, jego akson oraz unerwiane przez niego włókna mięśniowe¹): sygnałów wejściowych docierających do motoneuronu, właściwości elektrofizjologicznych motoneuronu oraz wpływu tych właściwości na funkcję fizjologiczną motoneuronów, i.e. siłę generowaną przez jego jednostkę motoryczną. Podejście to jest jednak bardzo wymagające, ponieważ preparatu nie można sparaliżować, co zmniejsza stabilność mechaniczną niezbędną do rejestracji wewnątrzkomórkowej. W związku z tym tego typu eksperymenty przeprowadzano dotychczas jedynie u kotów i szczurów. Jednakże badanie rdzeniowych systemów motorycznych mogłoby poczynić ogromny postęp, gdyby możliwe było przeprowadzenie podobnych eksperymentów u myszy normalnych i modyfikowanych genetycznie.

Ze względów technicznych badanie sieci rdzeniowych u myszy ograniczało się głównie do preparatów neonatalnych in vitro, w których motoneurony i sieci rdzeniowe są niedojrzałe, motoneurony są oddzielone od swoich celów, a w przypadku badań na skrawkach, motoneurony są oddzielone od większości swoich wejść sygnałowych. Do niedawna tylko kilka grup zdołało przeprowadzić wewnątrzkomórkowe rejestracje motoneuronów in vivo^2-4 , w tym nasz zespół, który opublikował nową metodę przygotowania preparatu, pozwalającą na uzyskanie bardzo stabilnych rejestracji motoneuronów in vivo u dorosłych myszy^5,6. Rejestracje te były jednak przeprowadzane u zwierząt sparaliżowanych, i.e. bez możliwości pomiaru siły generowanej przez te motoneurony. W niniejszej pracy przedstawiamy rozszerzenie tej oryginalnej metody, dzięki której udało nam się uzyskać jednoczesne rejestracje właściwości elektrofizjologicznych motoneuronów oraz siły wytwarzanej przez ich jednostki motoryczne. Jest to istotne osiągnięcie, ponieważ pozwala nam identyfikować różne typy motoneuronów na podstawie ich profilu siły, co ujawnia ich funkcję. W połączeniu z modelami genetycznymi zaburzającymi segmentowe obwody rdzeniowe^7-9 lub odtwarzającymi ludzkie choroby^10,11, oczekujemy, że technika ta stanie się niezbędnym narzędziem do badania rdzeniowego układu ruchowego.

Protokół

1. Krok pierwszy

Medykacja przedznieczkowa: na 10-15 min przed indukcją znieczulenia wstrzyknąć podskórnie atropinę (0.20 mg/kg) oraz metylprednizolon (0.05 mg), aby odpowiednio zapobiec ślinotoku i obrzękom.

2. Krok drugi

Indukcja znieczulenia: wstrzyknąć wewnątrzbrzusznie pentobarbital sodowy (70 mg/kg) lub mieszaninę ketaminy z ksylazyną (odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg). Odczekać do momentu utraty odruchu z palca u nogi. Jeśli znieczulenie wydaje się zbyt płytkie, podać dodatkowo 1/4 dawki.

3. Krok trzeci

*Uwaga: ten zabieg chirurgiczny jest procedurą terminalną.

Po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, przenieś mysz w pozycji brzusznej na podwyższony, ciepły koc.

1. Przykryj pysk myszy maską podającą czysty O₂ z przepływem około 100 ml/min.
2. Za pomocą strzyżarki wygol region grzbietowy od karku do nasady ogona.
3. Wygol również prawą kończynę tylną.
4. Przyłóż mysz na plecy, uważając, aby maska tlenowa pozostała na swoim miejscu.

4. Krok czwarty

Unieruchom mysz, zaplatając szwy wokół kończyn i mocując je w czterech narożnikach powierzchni roboczej.

5. Krok piąty

Wprowadź sondę temperatury w celu monitorowania temperatury głębokiej myszy. Dostosuj moc mata grzewczego/lampy, aby utrzymać temperaturę głęboką w zakresie od 36 °C do 38 °C.

6. Tracheotomia i wentylacja mechaniczna

1. Za pomocą tępych nożyczek wykonać nacięcie nad tchawicą i odsunąć skórę na obie strony.
2. Za pomocą tępych pęset rozdzielić gruczoł ślinowy, aby odsłonić dwa cienkie mięśnie (mięśnie mostkowo-grysieniowe) pokrywające tchawicę.
3. Za pomocą tępych pęset rozdzielić oba mięśnie wzdłuż ich przyśrodkowego rozstępu, aby odsłonić tchawicę.
4. Za pomocą pęsety Dumont 7 wsunąć dwa odcinki jedwabnej nici chirurgicznej 4.0 pod tchawicę.
5. Wykonać poprzeczne nacięcie w tchawicy pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi, dbając o to, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie.
6. Wprowadzić rurkę intubacyjną do tchawicy, a następnie zabezpieczyć ją po obu stronach otworu wprowadzenia, zawiązując nad nią nici. Rurka intubacyjna jest podłączona do respiratora dla myszy (SAR-830/AP, CWE Inc.) oraz kapnografu (μcapstar, CWE Inc.). Respirator jest połączony za pomocą worka podatności ze źródłem czystego O₂. Dostosować parametry respiratora (częstość oddechów 100-150 bpm, objętość końcowowydechowa 170-310 μl) w taki sposób, aby mysz nie walczyła z wentylacją mechaniczną, a końcowowydechowe pCO₂ było stabilne w zakresie od 4 do 5%.

7. Zakładanie linii dożylnych

1. Stosując techniki tępego rozczepiania, odsłoń żyłę szyjną po jednej stronie szyi. Na tym poziomie żyła szyjna dzieli się na dwa główne pnie: przednią i tylną żyłę twarzową.
2. Wykonaj następujące kroki dwukrotnie, raz dla każdego z tych pni:
   1. Używając pincety Dumont 4 lub 5, ostrożnie oddziel żyłę od otaczającej ją tkanki łącznej.
   2. Używając pincety Dumont 7, wsuń dwa odcinki szwów jedwabnych 6.0 pod żyłę. Rozsuń je tak daleko, jak to możliwe wzdłuż żyły.
   3. Umieść mały klips naczyniowy po stronie proksymalnej żyły (bliżej serca) i podwiąż stronę dystalną żyły.
   4. Używając bardzo cienkich nożyczek irydowych, wykonaj niewielkie nacięcie poprzeczne w żyle, uważając, aby nie przeciąć jej całkowicie.
   5. Wprowadź wypełniony wcześniej cewnik 1Fr (premicath, Vygon) do otworu, aż do klipsa naczyniowego.
   6. Trzymając żyłę i cewnik razem pincetą Dumont 4, ostrożnie usuń klips naczyniowy, a następnie wsuń cewnik o kilka milimetrów głębiej do żyły.
   7. Zabezpiecz cewnik, wiążąc go oboma szwami po obu stronach miejsca wprowadzenia.
3. Jeden z cewników jest podłączony do strzykawki lub pompy strzykawkowej w celu wstrzykiwania uzupełniających dawek środków znieczulających w razie potrzeby (zazwyczaj co 10-30 min). Dawka IV to 6 mg/kg pentobarbitalu sodowego lub 1250+40 μg/kg/min ketaminy/ksylazyny¹². Drugi cewnik jest podłączony do pompy strzykawkowej do powolnej infuzji dożylnej (50 μl/hr) 4% roztworu glukozy zawierającego NaHCO₃ (1%) i plasmion (14%).

8. Zamknięcie skóry szyi za pomocą igły i nici oraz powrót myszy do pozycji brzusznej

9. Disekcja mięśni i nerwów kończyny tylnej

1. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie od górnej części uda do ścięgna Achillesa. Oddziel skórę od leżących poniżej mięśni, dbając o to, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. W razie potrzeby zastosuj kauteryzację.
2. Zidentyfikuj przednią krawędź mięśnia dwugłowego uda (Biceps Femoris), która przejawia się jako biała linia biegnąca wzdłuż uda. Za pomocą nożyczek ostrożnie rozetnij wzdłuż tej linii od kolana aż do kości biodrowej. Rozdziel mięśnie. Nerw kulszowy jest teraz widoczny pod mięśniem dwugłowym uda.
3. Ostrożnie wypreparuj mięsień dwugłowy uda. W razie potrzeby zastosuj kauteryzację lub podwiąż naczynia, aby zapobiec krwawieniu. Mięsień dwugłowy uda można całkowicie usunąć lub po prostu odsunąć, aby odsłonić nerw kulszowy i mięśnie trójgłowe łydki (Triceps Surae).
4. Wypreparuj nerw łydkowy (Sural nerve).
5. Używając jedwabnej nici 8/0, podwiąż dystalną część wspólnego nerwu strzałkowego i przetnij go dystalnie od węzła. Wypreparuj nerw ku górze, jak najbliżej biodra.
6. Zidentyfikuj nerw piszczelowy, znajdujący się pomiędzy wspólnym nerwem strzałkowym a nerwem łydkowym. Spośród różnych gałęzi nerwu piszczelowego wyodrębnij gałęzie unerwiające mięśnie trójgłowe łydki od gałęzi biegnących głębiej (dalej określanych jako nerw piszczelowy).
7. Używając jedwabnej nici 8/0, zwiąż wszystkie gałęzie nerwu piszczelowego, pozostawiając nienaruszone gałęzie unerwiające mięśnie trójgłowe łydki. Przetnij nerw piszczelowy dystalnie od węzła i wypreparuj nerw tak wysoko, jak to możliwe.
8. Przykryj całą kończynę tylną gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu podczas wykonywania następnego kroku.

10. Laminektomia

1. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie wzdłuż kręgosłupa. Oddziel skórę od leżących pod nią mięśni.
2. Wykonaj dwa nacięcia po każdej stronie kręgów, aby oddzielić mięśnie podskórne. Następnie przetnij każde ścięgno mięśni przyczepionych do bocznych części kręgów po obu stronach.
3. Za pomocą tępych pęset i cienkiej kiretażki usuń pozostałe fragmenty mięśni z grzbietowej strony kręgów w obrębie wyrostków kolczystych, aby wyraźnie zidentyfikować każdy pojedynczy kręg.
4. Zidentyfikuj kręgi T13 i L1. T13 jest ostatnim kręgiem, do którego przytwierdzone są żebra. Kolumna kręgowa zostanie unieruchomiona za pomocą zacisków do kręgów Cunningham Spinal Cord (Stoelting Co.). Umieść zaciski kręgowe po obu stronach T13 i L1. Należy uważać, aby nie ucisnąć rdzenia kręgowego, ale nadać lekkie napięcie w osi podłużnej. Sprawdź, czy kolumna kręgowa jest dobrze zabezpieczona, delikatnie naciskając pęsetą.
5. Za pomocą cienkich kleszczyków kostnych (rongeurs) usuń wyrostki kolczyste, a następnie łuki kręgów nad T13 i L1, odsłaniając tym samym rdzeń kręgowy.
6. Przykryj odsłonięty rdzeń kręgowy małymi kawałkami waty lub gąbką nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu.
7. Umieść specjalnie wykonaną plastikową wannę na grzbiecie, otaczając rdzeń kręgowy. Przymocuj wannę za pomocą nici jedwabnej 4/0. Upewnij się, że wanna jest wodoszczelna, uszczelniając ją uszczelniaczem Kwik-Cast (WPI).
8. Po wyschnięciu preparatu Kwik-Cast usuń watę przykrywającą rdzeń kręgowy i napełnij wannę olejem mineralnym.
9. Za pomocą pęsety Dumont 5 i bardzo cienkich nożyczek irydowych delikatnie pociągnij oponę twardą otaczającą rdzeń kręgowy i otwórz ją tak szeroko, jak to możliwe, w obu kierunkach. Odchyl oponę twardą na każdą stronę rdzenia kręgowego.
10. Obniż podniesioną platformę, na której leży mysz, tak aby pozostała zawieszona na zaciskach kręgowych.
11. Użyj kolejnego zacisku kręgowego, aby zapiąć wyrostek kolczysty w okolicy krzyżowej w celu podparcia tylnej części ciała zwierzęcia.
12. Trzeci zacisk służy do unieruchomienia prawej kończyny tylnej i kostki, zgiętych pod kątem 90° w stawie kolanowym.

11. Disekcja ścięgna Achillesa

1. Przy kończynie zgiętej pod kątem 90° w stawie kolanowym i skokowym, należy usunąć gazę zakrywającą obszar kończyny tylnej i wypreparować ścięgno Achillesa z otaczających tkanek. Należy również w możliwie największym stopniu wypreparować mięsień trójgłowy łydki (Triceps Surae) z okolicznych tkanek.
2. Przeciąć ścięgno mięśnia płaszczkowatego (Plantaris) blisko kości piętowej, a następnie przeciąć je ponownie, aby całkowicie usunąć ścięgno.
3. Za pomocą igły przeprowadzić jedwabną nić 6/0 przez ścięgno Achillesa i zawiązać potrójny węzeł wokół ścięgna.
4. Umieścić przetwornik siły blisko węzła, odciąć dystalną część ścięgna i przymocować ją do przetwornika siły za pomocą jedwabnej nici.
5. Wprowadzić dwa odcinki drutu ze stali nierdzewnej pod powięź mięśni trójgłowych łydki. Druty te są podłączone do pozakomórkowego wzmacniacza AC do rejestracji EMG.
6. Umieścić nerw strzałkowy wspólny oraz nerw piszczelowy na dwóch bipolarnych elektrodach hakowych.
7. Umieścić nerw mięśnia trójgłowego łydki na katodzie elektrody hakowej, tak aby anoda dotykała pobliskiego mięśnia.
8. Podłączyć wszystkie elektrody stymulujące do jednostki izolacyjnej.
9. Umieścić elektrodę kulistą na grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego, podłączoną do pozakomórkowego wzmacniacza AC w celu rejestracji potencjałów z grzbietu rdzenia. Elektrodę referencyjną Ag/AgCl umieścić w kontakcie z mięśniem grzbietu.

12. Krok dwunasty

Stymuluj nerw mięśnia trójgłowego łydki za pomocą prostokątnego impulsu o czasie trwania 50 μsec i rosnącej intensywności przy niskiej częstotliwości (<1 Hz), aż do zaobserwowania maksymalnej amplitudy skurczu pojedynczego. Powoli przemieszczaj przetwornik siły, aby rozciągnąć mięsień, monitorując jednocześnie amplitudę odpowiedzi skurczowej, dopóki amplituda skurczu nie osiągnie wartości maksymalnej.

13. Wewnątrzkomórkowe rejestracje z motoneuronów

Od tego momentu stosuje się standardowe techniki elektrofizjologiczne w celu przygotowania elektrody wewnątrzkomórkowej, penetracji neuronu w rdzeniu kręgowym oraz zidentyfikowania go jako motoneuron.

1. Wytnij szklaną mikropipetę do końcówki o średnicy ~1 μm za pomocą wyciągarki do pipet (P-97 Micropipette Puller, Sutter Instruments). Napełnij elektrodę roztworem KCl 3M (oporność elektrody 10-20 MΩ).
2. Za pomocą mikropozycjonera wprowadź mikropipetę, podłączoną do wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (Axoclamp 2B, Axon Instruments), do rdzenia kręgowego. Monitoruj lokalne potencjały polowe wywołane stymulacją każdego nerwu, aby zlokalizować pulę motoneuronów mięśnia Triceps Surae.
3. Ostrożnie zbliż się do prawdopodobnych motoneuronów, monitorując oporność mikroelektrody. Podczas nacisku na błonę oporność wzrasta. Penetrację można czasem ułatwić, korzystając z funkcji „buzz” wzmacniacza wewnątrzkomórkowego.

14. Procedura eutanazji

Po zakończeniu eksperymentu zwierzę zostaje uśmiercone poprzez podanie przedawkowanej dawki pentobarbitalu (210 mg/kg IV), a następnie poddane dekapitacji.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia sposób identyfikacji motoneuronu z grupy Triceps Surae po penetracji. Przy niskiej intensywności stymulacji można zaobserwować jedynie monosynaptyczny EPSP (Rysunek 1A). Przy wyższej intensywności EPSP może być na tyle duży, aby wywołać potencjał czynnościowy „ortodromowy” (Rysunek 1B). Przy jeszcze wyższej intensywności stymulacji pojawia się antidromowy potencjał czynnościowy typu wszystko albo nic, o krótszym czasie utajenia niż w przypadku monos...

Dyskusja

Opisane tutaj przygotowanie jest pierwszą metodą, która pozwala u dorosłej myszy na jednoczesne wewnątrzkomórkowe rejestrowanie aktywności lędźwiowego motoneuronu oraz pomiar siły generowanej przez włókna mięśniowe unerwione przez jego akson.

Ze względu na niewielkie rozmiary zwierzęcia, nabycie umiejętności chirurgicznych wymaganych do tego przygotowania może być trudne. Jednak po opanowaniu tych umiejętności cały zabieg można przeprowadzić w ciągu trzech godzin, a zwierzęta mogą przeżyć do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan atropiny	Aguettant
Metylprednizolon	Pfizer	Solu-Medrol
Pentobarbital sodowy	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamina
Ksylazyna
Glukoza
Ekspander osocza	Roger Bellon	Plasmagel
Nożyczki tępe	FST	14079-10
Nożyczki precyzyjne tępe	FST	15025-10
Nożyczki sprężynowe Vannasa	FST	15002-08
Pęseta precyzyjna ząbkowana	FST	11370-32
Pęseta precyzyjna ząbkowana	FST	11370-31
Adapter rdzeniowy Cunninghama	Stoelting Co.
Uszczelniacz Kwik-Cast	WPI	#KWIK-CAST
Respirator	CWE Inc	SAR-830/AP
Kapnograf	CWE Inc	μcapstar
Koc grzewczy	Harvard Apparatus	507221F
Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Wytwornica pipet	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G