Opisano projektowanie, wykonanie i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu. Urządzenie stanowi kosztowo efektywne i łatwe w użyciu rozwiązanie do chronicznych rejestracji pojedynczych jednostek u małych zwierząt w warunkach behawioralnych.
Artykuł metodologiczny
Projekt i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu do chronicznych rejestracji neuronalnych u małych zwierząt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Możliwość chronicznego rejestrowania aktywności populacji neuronów u zwierząt swobodnie zachowujących się okazała się nieocenionym narzędziem w analizie funkcji obwodów neuronalnych leżących u podstaw wielu naturalnych zachowań, w tym nawigacji1, podejmowania decyzji 2,3 oraz generowania złożonych sekwencji ruchowych4,5,6. Postępy w precyzyjnej obróbce materiałów umożliwiły wytwarzanie lekkich urządzeń odpowiednich do chronicznych pomiarów u małych zwierząt, takich jak myszy i ptaki śpiewające. Możliwość regulacji pozycji elektrody za pomocą niewielkich silników sterowanych zdalnie dodatkowo zwiększyła wydajność rejestracji w różnych kontekstach behawioralnych poprzez ograniczenie konieczności manipulowania zwierzętami.6,7
W niniejszej pracy opisujemy protokół budowy ultralekkiego zmotoryzowanego mikroprzesuwacza do długoterminowych rejestracji chronicznych u małych zwierząt. Nasza konstrukcja ewoluowała z wcześniej opublikowanej wersji7 i została dostosowana pod kątem łatwości użytkowania oraz kosztów, aby stać się bardziej praktyczną i dostępną dla szerokiego grona badaczy. Ta sprawdzona konstrukcja 8,9,10,11 umożliwia precyzyjne, zdalne pozycjonowanie elektrod w zakresie ok. 5 mm i po pełnym złożeniu waży mniej niż 750 mg. Przedstawiamy kompletny protokół budowy i montażu tych przesuwaczy, w tym rysunki 3D CAD dla wszystkich niestandardowych komponentów mikroprzesuwacza.
Protokół
1. Przegląd komponentów
- Kompletny mikronapęd składa się z kilku głównych elementów (Rysunek 1): podwozia, które służy jako nadbudowa napędu, silnika z drobnozwojnym wałem wyjściowym, gwintowanego wózka, który przenosi elektrody i zapewnia punkt połączenia elektrycznego, oraz złącza Omnetics (lub równoważnego).
- Podwozie, wózek elektrod oraz rurki wózka elektrod to niestandardowe komponenty zaprojektowane w oprogramowaniu 3D CAD (SolidWorks) i wykonane przez lokalny zakład obróbki precyzyjnej. Wszystkie pozostałe elementy są dostępne w sprzedaży.
- Podwozie i wózek są wykonane z lekkiego polieteroimidu (PEI), natomiast rurki wózka elektrod są docinane na tokarce ze stali nierdzewnej z rurek hipodermicznych (0.0293"OD x 0.00975"ID). Choć komponenty te mogą być wykonane z innych materiałów, ustaliliśmy, że PEI i stal nierdzewna zapewniają odpowiedni balans między obrabialnością, wytrzymałością a masą w naszej aplikacji.
- Do zmontowania napędu wymagany jest sterownik silnika zdolny do obsługi niskonapięciowego silnika krokowego DC. Stosujemy autorskie rozwiązanie oparte na trójfazowym układzie scalonym sterownika silnika (Faulhaber BLD05002 dostępny u producenta) w połączeniu z timerem IC, który generuje sygnał wejściowy kroków. Dostępne są również różnorodne gotowe rozwiązania (np. Faulhaber MCBL05002 lub Sutter Instruments MP-285).
2. Przygotowanie i montaż podwozia napędowego
- Za pomocą precyzyjnych obcinaczek do drutu przytnąć piny kontaktowe na spodzie złącza Omnetics (lub równoważnego) – do 1,5 mm dla tylnego rzędu i do 1 mm dla przedniego rzędu (Rysunek 2A). Aby zwiększyć wytrzymałość wiązania epoksydowego między chassis napędu a złączem, należy zmatowić skalpelem tylne powierzchnie obu komponentów.
- Za pomocą skalpela wyciąć cztery odcinki rurki polimidowej (0,0113" ID x 0,0133" OD) o długości 15 mm do wykorzystania jako prowadnice przewodów. Ostrożnie zamocować chassis w małym imadle otwartą wnęką do dołu (Rysunek 2B). Użyć kleju cyjanoakrylowego, aby przytwierdzić rurki polimidowe do chassis. Powinny one przylegać do tylnej powierzchni chassis i być zorientowane równolegle do siebie, jak pokazano na Rysunku 2B.
- Po wyschnięciu przyciąć rurki polimidowe do długości około 6 mm i usunąć odpady. Pozostałe rurki powinny znajdować się około 3 mm od dolnej krawędzi chassis.
- Aby zapewnić odpowiedni prześwit podczas łączenia z headstage'em lub kablem, złącze powinno być zamontowane kilka milimetrów powyżej rurek polimidowych i być równoległe do powierzchni chassis (Rysunek 2B). Użyć żywicy epoksydowej (Torr Seal) do zbudowania małej podstawki pod złącze, umieścić je na górze krótszym rzędem pinów do góry i dodać więcej żywicy wokół złącza. Nie kontynuować prac do czasu całkowitego utwardzenia żywicy.
- Zdjąć chassis z imadła, przenieść na uchwyt umożliwiający połączenie z kontrolerem silnika (t.j. w naszym przypadku uchwyt ten jest po prostu sztywnym prętem z przymocowanym na jednym końcu pasującym złączem Omnetics) i zorientować tak, aby przednia powierzchnia napędu była skierowana do góry. Przeciągnąć przewody silnika przez otwór w chassis i wsunąć silnik w rowek w podstawie. Silnik i wał napędowy powinny być równoległe do chassis i ściśle przylegać do dołu i boku.
- Przykleić silnik do chassis za pomocą żywicy epoksydowej, uważając, aby nie zablokować ani wału napędowego, ani miejsca, w którym zostaną zainstalowane elektrody (patrz rozmieszczenie Torr Seal na Rysunku 4). Pozostawić żywicę do utwardzenia.
- Obrócić chassis tak, aby złącze było dostępne. Aby podeprzeć przewody silnika i zapobiec ich przypadkowemu przełamaniu, dodać małą kroplę szybko utwardzalnej żywicy epoksydowej na przewody w miejscu, w którym wychodzą z chassis. Przyciąć, zdjąć izolację i przylutować przewody do odpowiednich styków złącza (Rysunek 2A). Przetestować silnik, aby upewnić się, że wał obraca się płynnie w obu kierunkach.
3. Montaż przekaźnika elektrod
- Aby zminimalizować ryzyko wystąpienia artefaktów ruchowych w zapisach, niezbędne jest, aby prowadnica elektrod ściśle pasowała do obudowy. Sprawdź dopasowanie prowadnicy, nakręcając ją na wał silnika i przesuwając w górę i w dół na całej długości wału przy niskiej prędkości. Należy uważać, aby nie zablokować prowadnicy w napędzie, co mogłoby doprowadzić do przekroczenia momentu obrotowego silnika – na tym etapie bardzo łatwo jest trwale uszkodzić plastikową przekładnię. Jeśli wał silnika, który wcześniej się obracał, przestanie pracować, może to oznaczać uszkodzenie przekładni.
- Jeśli prowadnica nie przesuwa się płynnie wzdłuż wału, sprawdź powierzchnie obudowy oraz śrubę napędową pod kątem obecności zanieczyszczeń. Usuń je za pomocą precyzyjnej pęsety lub sprężonego powietrza, pokryj gwint niewielką ilością lekkiego oleju mineralnego i ponownie sprawdź dopasowanie prowadnicy.
- Jeśli prowadnica jest zbyt ciasna, użyj pęsety i drobnoziarnistego osełki, aby usunąć przeszkadzający materiał z boku prowadnicy. Należy dbać o równomierne usuwanie materiału.
- Jeśli prowadnica jest zbyt luźna, co powoduje jej przechylanie się i drgania podczas ruchu, przyklej do niej mały pasek folii przezroczystej, aby wypełnić lukę między prowadnicą a powierzchnią obudowy.
- Po prawidłowym dopasowaniu prowadnicy zdejmij ją z wału i wciśnij jedną z rurek ze stali nierdzewnej w każdy z czterech dużych otworów w prowadnicy. Każda z nich powinna być wycentrowana na prowadnicy, a końce wszystkich czterech rurek powinny być zlicowane (Rycina 3). Zabeziecz je niewielką kroplą kleju cyjanoakrylowego naniesioną u podstawy rurki. Należy zachować szczególną ostrożność, aby klej nie dostał się na krawędzie prowadnicy ani do wnętrza rurek.
- Nakręć gotową prowadnicę elektrod z powrotem na wał napędowy i przesuń ją całkowicie do podstawy gwintu.
4. Instalacja rurki prowadzącej i elektrody
- Odetnij cztery odcinki rurki poliimidowej o długości 25 mm (średnica wewnętrzna 0,0045" x średnica zewnętrzna 0,006"), które posłużą jako prowadnice elektrod. Dodatkowo odetnij cztery elektrody w odcinkach po 40 mm, aby służyły jako elektrody atrapy, które utrzymają rurki prowadzące w odpowiedniej pozycji podczas montażu. (Należy pamiętać, że elektrody atrapy służą wyłącznie do montażu i nie będą używane do rejestracji, dlatego można wykorzystać te same elementy do każdego montażu). Nasuń każdy odcinek rurki na elektrodę atrapę w taki sposób, aby elektroda wystawała ok. 10 mm poza koniec rurki.
- Rozmieść rurki poliimidowe w obudowie, jak pokazano na Rysunku 4A. W rezultacie końce prowadnic elektrod będą ze sobą zrównane i wyrównane do podstawy wału silnika, rozszerzając się w stronę suwaka elektrod, podczas gdy przeciwległe końce będą zbiegać się u dołu napędu. Wymieszaj niewielką ilość żywicy Kwik-Cast i nałóż ją około 2 mm poniżej górnego końca prowadnic elektrod. Pozostaw do wyschnięcia.
- Usuń elektrody atrapy i ponownie ustaw wolne końce prowadnic elektrod tak, aby tworzyły ciasny pęk u dołu napędu. Pomocne może być użycie cienkiego drutu do tymczasowego utrzymania ich w miejscu (Rysunek 4B). Utrwal nową pozycję kolejną porcją żywicy Kwik-Cast. Pozostaw do wyschnięcia.
- Za pomocą ostrego skalpela przytnij rurki prowadzące elektrody w miejscach, w których wystają poza dół mikronapędu. Po implantacji rurki te będą prowadzić elektrody od dołu napędu (opartego o czaszkę) do powierzchni mózgu. Zatem długość, na jaką należy przyciąć rurki, zależy od anatomii miejsca implantacji (Rysunek 5). W przypadku ptaków śpiewających jest to około 1,5 mm.
- Aby połączyć elektrodę ze złączem, odetnij odcinek izolowanego drutu platynowego (średnica 0,003") o długości 30 mm i zdejmij 1 mm izolacji z jednego końca. Przylutuj go do jednego z pinów sygnałowych we złączu. Zegnij drut pod złączem i przełóż go przez jedną z rurek prowadzących druty. Naciągnij drut i owiń go wokół szczeliny prowadzącej w górnej części obudowy.
- Za pomocą nożyczek lub precyzyjnych obcinaczek do drutu utnij elektrodę na długość ok. 25 mm. Należy uważać, aby nie wygiąć elektrody ani nie uszkodzić jej końcówki; w takim przypadku elektroda nie może zostać użyta. Przy suwaku elektrod znajdującym się w górnej części wału, wprowadź elektrodę do rurki poliimidowej i przeciągnij ją w górę przez rurkę ze stali nierdzewnej w suwaku. Ustaw ją tak, aby końcówka elektrody była zrównana z dolnym końcem rurki poliimidowej. Przytnij elektrodę 1 mm powyżej rurki suwaka.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety zdejmij izolację z ostatnich 2 mm elektrody oraz z ostatnich 2 mm drutu platynowego. Ponownie ustaw elektrodę w rurce suwaka, wprowadź do rurki drut platynowy i połącz oba elementy, wsuwając do rurki krótki, 1 mm odcinek drutu wolframowego (średnica 0,008"). Połączenie powinno być ciasne, aby zapewnić zarówno mechaniczne, jak i elektryczne połączenie między elektrodą a drutem (Rysunek 3).
- Przesuń suwak w górę i w dół wzdłuż wału napędowego, aby upewnić się, że ruch odbywa się płynnie.
- Powtarzaj kroki 4.5-4.8, aż wszystkie elektrody zostaną zainstalowane.
- Odetnij odcinek drutu srebrnego (średnica 0,005") o długości 30 mm do wykorzystania jako przewód uziemiający. Zdejmij 1 mm izolacji z jednego końca i przylutuj go do pinu masy.
5. Montaż końcowy i przygotowanie przed implantacją
- Aby zmniejszyć tarcie elektrod o prowadnice, należy napełnić prowadnice lekkim olejem mineralnym. Siły kapilarne są wystarczające, aby napełnić rurki za pomocą jednej kropli oleju umieszczonej na jednym z końców.
- Aby stworzyć osłonę ochronną dla silnika i elektrod, należy wyciąć z folii przezroczystej prostokąt o wymiarach 12 mm x 25 mm i zgiąć go w szeroki kształt litery U. Użyj cyjanoakrylanu, aby przykleić osłonę do zewnętrznych powierzchni podwozia (Rycina 6). Wytnij z folii przezroczystej prostokąt o wymiarach 15 mm x 6 mm i przyklej go cyjanoakrylanem wokół złącza. Aby uniknąć kolizji ze złączem, dłuższa krawędź folii powinna być zrównana z górną krawędzią złącza.
- Przed implantacją należy wysterylizować elektrody i prowadnice, zanurzając wysunięte elektrody w roztworze wody dejonizowanej z wybielaczem w stosunku 10:1 na 10 min. Następnie należy dokładnie przepłukać całość sterylną wodą.
- Do utrzymania mikronapędu w manipulatorze stereotaktycznym podczas implantacji można użyć uchwytu podobnego do tego zastosowanego w kroku 2.5.
6. Reprezentatywne wyniki
Ten protokół wymaga około 5 h aktywnego czasu montażu, z dodatkowymi 6-8 h przerw na wyschnięcie epoksydy i kleju. Jednakże, po pierwszym zmontowaniu mikronapędu, można go przygotować do ponownego użycia (t.j. wymienić elektrody, prowadnice elektrod i przewody elektrod) w czasie krótszym niż 2 h. Jakość i charakter rejestracji uzyskanych zgodnie z tym protokołem będą, oczywiście, w części zależeć od celu rejestracji, wyboru elektrod oraz wszelkich procesów przetwarzania sygnału w stopniu wejściowym (headstage) lub w dalszych etapach toru sygnałowego za mikronapędem. Pomijając te kwestie, możliwe jest uzyskanie stabilnych rejestracji od zwierzęcia w trakcie zachowań w okresie przekraczającym dziesięć tygodni. Przykłady rejestracji pojedynczych jednostek z jądra robustus archistriatum (RA) u śpiewającego ptaka w trakcie zachowań przedstawiono na Rysunku 7A; aktywność wielojednostkowa z tego samego obszaru przedstawiono na Rysunku 7B.
Rycina 1. Model 3D zmontowanego zmotoryzowanego mikronapędu. Mikronapęd składa się z kilku głównych komponentów: (i) podwozia, (ii) silnika z gwintowanym wałem wyjściowym, (iii) prowadnicy elektrod, (iv) rurek prowadnicy, (v) elektrod, (vi) rurek prowadzących elektrody oraz (vii) złącza.
Rycina 2. A) Model i schemat połączeń złącza. Przewody silnika: b, i, l. Przewody elektrod: c, d, e, f. Przewód uziemiający: k. Pozostałe piny są dostępne dla aparatury pomocniczej. B) Zdjęcie złącza przymocowanego do obudowy za pomocą epoksydu Torr Seal. Zwróć uwagę na położenie zarówno złącza, jak i znajdujących się pod nim prowadnic przewodów. Klej cyjanoakrylanowy utrzymujący prowadnice w pozycji wysycha do stanu przezroczystego, w związku z czym nie jest widoczny na zdjęciu.
Rycina 3. Zespół przenośnika elektrod.
Rysunek 4. A) Rurki prowadzące elektrody umieszczone w obudowie przed nałożeniem Kwik-Cast. B) Aby upewnić się, że elektrody wychodzą z dołu napędu równolegle, należy ściśle zebrać dolne końce rurek prowadzących przed dodaniem ostatniej kropli Kwik-Cast.
Rycina 5. Długość, na jaką prowadnice elektrod wystają poza spód napędu, jest określona przez anatomię miejsca implantacji. Schemat ilustruje wymiary istotne dla ustalenia długości prowadnic. W przypadku implantacji u ptaka śpiewającego wystarczająca jest długość 1,5 mm.
Rycina 6. Gotowy zmotoryzowany mikronapęd z zamocowanymi osłonami ochronnymi.
Rysunek 7. Reprezentatywne zapisy z jądra robustus archistriatum (RA) u zachowującego się naturalnie zebra fincha. A) Aktywność pojedynczych jednostek zarejestrowana za pomocą elektrod platynowo-irydowych 10MΩ. Góra: przykładowy zapis wykonany tydzień po implantacji. Dół: przykładowy zapis z tej samej elektrody co powyżej, dziewięć tygodni później. B) Aktywność wielojednostkowa zarejestrowana za pomocą elektrod platynowych 1MΩ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Pliki dodatkowe: Podwozie, czółenko oraz rurki elektrod zostały zaprojektowane w oprogramowaniu CAD SolidWorks 2010. Pliki części są dostarczone zarówno w formacie zastrzeżonym (*.sldprt), jak i w formacie neutralnym dla dostawcy (*.iges), a wymiarowane rysunki produkcyjne są dostępne w formacie PDF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół pozwoli na stworzenie urządzenia zdolnego do rejestracji wysokiej jakości z minimalnymi artefaktami ruchowymi tylko pod warunkiem zachowania należytej staranności podczas konstrukcji. Pasowanie elementu ruchomego (shuttle) w obudowie ma krytyczne znaczenie: zbyt ciasne pasowanie wiąże się z wysokim ryzykiem przeciążenia silnika, natomiast zbyt luźne z wysokim ryzykiem wystąpienia znacznych artefaktów ruchowych. Idealne pasowanie pozwoli elementowi ruchomemu na przebycie całej długości gwintow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Ester and Joseph Klingenstein Fund, McKnight Endowment Fund oraz NINDS 1R01NS066408-01A1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podwozie | Własny wykonanie | Wycięte z PEI | |
| Suwak elektrod | Własny wykonanie | Wycięte z PEI | |
| Rurki suwaka | Własny wykonanie | Wycięte ze stali nierdzewnej | |
| Konektor | Omnetics | A7886-001 | Pasuje do A7877-001 |
| Silnik z przekładnią | Faulhaber | 0206-A-001-B-021-47:1 | |
| Przewodnik drutu | Small Parts, Inc. | SWPT-0113-12 | |
| Przewodnik elektrod | Small Parts, Inc. | SWPT-0045-12 | |
| Elektrody Pt-Ir 10MΩ | Microprobes, Inc | PI2PT310.0H3 | |
| Drut platynowy | A-M Systems | 772000 | Do przewodów elektrod |
| Drut srebrny | A-M Systems | 786000 | Do przewodu uziemiającego |
| Drut wolframowy | A-M Systems | 797000 | Do pinów elektrod |
| Folia przezroczysta | 3M | AF4300 | |
| Uszczelniacz Torr Seal | Varian Inc., Agilent | 9530001 | |
| Kwik-Cast | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | |
| Cyjanoakrylan | Krazy Glue | KG517 | |
| Szybkowiążąca żywica epoksydowa | Hardman | 04001 | |
| Lekki olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Podchloryn sodu | |||
| Obcinaczki boczne | |||
| Ostrze skalpela | |||
| Pinceta | |||
| Uchwyt napędowy | Własny wykonanie | Przykleić konektor dopasowujący do strzykawki lub pręta za pomocą żywicy epoksydowej | |
| Mały imadło |
Bibliografia
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Brain Research. 34, 171-175 (1971).
- Pennartz, C. M., Berke, J. D., Graybiel, A. M., Ito, R., Lansink, C. S., van der Meer, M., Redish, A. D., Smith, K. S., Voorn, P. Corticostriatal Interactions during Learning, Memory Processing, and Decision. 29, 12831-12838 (2009).
- Kepecs, A., Uchida, N., Zariwala, H., Mainen, Z. F. Neural correlates, computation, and behavioural impact of decision confidence. Nature. 455, 227-2231 (2008).
- Hahnloser, R. H. R., Kozhevnikov, A. A., Fee, M. S. An ultra-sparse code underlies the generation of neural sequences in a songbird. Nature. 419, 65-70 (2002).
- Leonardo, A., Fee, M. S. Ensemble Coding of Vocal Control in Birdsong. J. Neurosci. 25 (3), 652-661 (2005).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. J. Neurosci. Methods. 112, 83-94 (2001).
- Ölveczky, B. P., Otchy, T. M., Goldberg, J. H., Aronov, D., Fee, M. S. Changes in the neural control of a complex motor sequence during learning. J. Neurophys. 106, 386-397 (2011).
- Otchy, T. M., Ölveczky, B. P. Effects of Sensory Experience on the Development and Maintenance of a Motor Program Underlying a Complex Motor Sequence. Soc. for Neurosci. Abstr. , (2011).
- Goldberg, J. H., Adler, A., Bergman, H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes two putative pallidal cell types in the songbird basal ganglia: comparison to the primate internal and external pallidal segments. J. Neurosci. 30 (20), 7088-7098 (2010).
- Goldberg, J. H., Fee, M. S. Singing-related neural activity distinguishes four classes of putative striatal neurons in the songbird basal ganglia. J. Neurophys. 103 (4), 2002-2014 (2010).
- Venkatachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted microwire implantation for chronic recording from neocortex. J. Neurosci. Methods. 90, 37-46 (1999).
- Shirvalkar, P. R., Shapiro, M. L. Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze. J. Vis. Exp. (44), e2155(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie