Prosty protokół zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby

Summary

Ta metoda bada fenotyp zlepiania się za pośrednictwem płytek krwi erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) w izolatach klinicznych. Odbywa się to poprzez izolację i współinkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Abstract

P. falciparum powoduje większość ciężkich infekcji malarycznych. Patofizjologiczne mechanizmy leżące u podstaw malarii mózgowej (CM) nie są w pełni poznane i wysunięto kilka hipotez, w tym mechaniczne zablokowanie mikronaczyń przez czerwone krwinki pasożytujące na P. falciparum (pRBC). Rzeczywiście, podczas wewnątrzerytrocytarnego etapu swojego cyklu życiowego P. falciparum ma unikalną zdolność do modyfikowania powierzchni zakażonego erytrocytu poprzez eksport antygenów powierzchniowych o różnych właściwościach adhezyjnych na błonę RBC. Pozwala to na sekwestrację pRBC w wielu tkankach i narządach poprzez adhezję do komórek śródbłonka wyściełających mikrokrążenie żyłek pozakapilarnych ¹. W ten sposób dojrzałe formy pasożyta unikają klirensu śledziony zdeformowanych zakażonych erytrocytów ² i ograniczają ich środowisko do korzystniejszego niskiego ciśnienia tlenu ³. W wyniku tej sekwestracji we krwi obwodowej można wykryć tylko niedojrzałe pasożyty bezpłciowe i gametocyty.

Cytoadherencja i sekwestracja dojrzałego pRBC do licznych receptorów gospodarza wyrażanych na łożyskach mikrokrążenia występuje w ciężkiej i nieskomplikowanej chorobie. Jednak kilka linii dowodów sugeruje, że tylko określone fenotypy adhezyjne mogą być związane z poważnymi patologicznymi skutkami malarii. Jeden z przykładów takich specyficznych interakcji gospodarz-pasożyt został zademonstrowany in vitro, gdzie zdolność międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 do wspierania wiązania pRBC o określonych właściwościach adhezyjnych została powiązana z rozwojem malarii mózgowej ^4,5. Łożysko zostało również uznane za miejsce preferencyjnej akumulacji pRBC u kobiet w ciąży zakażonych malarią, z siarczanem chondrotyny A ulegającym ekspresji na syncytiotrofoblastach wyściełających przestrzeń międzykosmkową łożyska jako główny receptor ⁶. Rosetting pRBC do niezakażonych erytrocytów za pośrednictwem receptora dopełniacza 1 (CD35)^7,8 jest również związany z ciężką chorobą ⁹.

Jednym z ostatnio opisanych fenotypów cytoadherencji P. falciparum jest zdolność pRBC do tworzenia grudek za pośrednictwem płytek krwi in vitro. Tworzenie takich grudek pRBC wymaga CD36, glikoproteiny ulegającej ekspresji na powierzchni płytek krwi. Wykazano również, że inny ludzki receptor, gC1qR/HABP1/p32, ulegający ekspresji na różnych typach komórek, w tym na komórkach śródbłonka i płytkach krwi, ułatwia adhezję pRBC na płytkach krwi w celu tworzenia grudek ¹⁰. Nie jest jasne, czy zlepianie się występuje in vivo, ale może to odpowiadać za znaczną akumulację płytek krwi opisaną w mikrokrążeniu mózgu malawijskich dzieci, które zmarły z powodu CM ¹¹. Ponadto zdolność klinicznych izolowanych kultur do zlepiania się in vitro była bezpośrednio związana z ciężkością choroby u pacjentów z Malawi ¹² i Mozambiku ¹³ (chociaż nie u Malijczyków ¹⁴).

Ze względu na to, że kilka aspektów fenotypu zbrylania pRBC jest słabo scharakteryzowanych, obecne badania na ten temat nie są zgodne ze standardową procedurą. Jest to ważna kwestia ze względu na znaną wysoką zmienność nieodłącznie związaną z testem ¹⁵. W tym miejscu przedstawiamy metodę zlepiania się P. falciparum in vitro za pośrednictwem płytek krwi z nadzieją, że zapewni ona platformę dla spójnej metody dla innych grup i zwiększy świadomość ograniczeń w badaniu tego fenotypu w przyszłych badaniach. Mając siedzibę w Malawi, zapewniamy protokół opracowany specjalnie dla osób o ograniczonych zasobach, z tą zaletą, że świeżo pobrane izolaty kliniczne mogą być badane pod kątem fenotypu bez konieczności kriokonserwacji.

Protocol

1. Pobieranie próbek

Płytki krwi mogą być łatwo aktywowane poprzez temperaturę, mieszanie lub przechowywanie, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Stosowanie urządzeń próżniowych do pobierania krwi w celu przygotowania płytek krwi jest nieuniknione w większości sytuacji klinicznych, ale należy je dokładnie rozważyć, ponieważ ssanie może potencjalnie spowodować aktywację płytek krwi. Ze względu na protokół kliniczny stosowany w naszym szpitalu badawczym, nasze próbki są starannie pobierane w wakutainerach cytrynianu sodu. Nie doświadczyliśmy żadnych problemów z przedwczesną aktywacją płytek krwi w tym ani w naszym poprzednim badaniu ¹². Pobieramy krew do preparatu płytek krwi od osób z grupą krwi O+, aby zminimalizować agregację nieswoistego antygenu grupy krwi. Dawcy nie przyjmowali również leków w ciągu ostatnich 7-10 dni, ponieważ wiadomo, że niektóre leki wpływają na czynność płytek krwi.

1.1 Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP)

1. Pobrać około 5 ml krwi pełnej od żywiciela niecierpiącego wcześniej na malarię lub 2,5 ml krwi od pacjentów z CM lub ciężką malarią (SM) w wakutainerze cytrynianu sodu (numer produktu BD 36276).
2. Odwirować krew pełną o stężeniu 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Nie odwirowywać w temperaturze 4 °C, ponieważ niskie temperatury mogą spowodować agregację płytek krwi.
3. Ostrożnie przenieść mętny sklarowany sklarowany sklargat do czystej probówki o pojemności 15 ml. Płytki krwi łatwo ulegają aktywacji pod wpływem zmian temperatury i wstrząsów fizycznych, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikaj potrząsania lub gwałtownych ruchów rurki.
4. Za pomocą hematocytometru Neubauera policzyć i dostosować zawiesinę płytek krwi do >300 x 10³ płytki/μl dla zdrowych dawców i <150 x 10³ płytki/μl od pacjentów z CM i SM przy użyciu 1X buforu fosforanowego (pH 7,2-7,4; PBS). Upewnij się, że wybierasz wysoki współczynnik rozcieńczenia, aby zmniejszyć liczbę płytek krwi i zapewnić jej dokładność.

Uwaga: Pacjenci z malarią mają zmniejszoną liczbę płytek krwi w porównaniu do osób zdrowych ^16,17,18. W związku z tym stężenia płytek krwi dla CM i UM są dostosowywane zgodnie ze średnią liczbą płytek krwi dla pacjentów w każdej grupie diagnostycznej malarii. Fenotyp zlepiania się P. falciparum jest powszechny w izolatach CM i wykazuje silne powinowactwo do wiązania, dlatego zmniejszone stężenie płytek krwi nie wpływa na wielkość lub częstotliwość grudek, ponieważ stężenie płytek krwi jest standaryzowane dla wszystkich przypadków CM.

1.2 Przygotowanie osocza ubogiego w płytki krwi (PPP)

1. Aby otrzymać PPP, należy odwirować część PRP otrzymaną powyżej przy 1 500 x g przez 10 minut. Większość płytek krwi jest granulowana na dnie probówki.
2. Zarówno PRP, jak i PPP można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Najlepiej użyć świeżych płytek krwi do testu zbrylania. Po 8-10 dniach większość płytek krwi będzie prawdopodobnie nieaktywna i prawdopodobnie zagregowana.

2. Kultura pasożytów

1. Przemyć granulowany pRBC trzykrotnie 5-10 ml RPMI 1640 przez odwirowanie przy 370 x g przez 5 min.
   Uwaga: w tym protokole wszystkie hodowle rozpoczynały się od około 1 ml objętości upakowanych komórek (PCV) i utrzymywały się na poziomie 5% hematokrytu. Posiewy można rozpocząć od dowolnego PCV lub pRBC i odpowiednio dostosować do niezakażonych RBC i pożywki, aby osiągnąć pożądany hematokryt.
2. Umieścić pRBC w kolbie hodowlanej i uzupełnić standardową pożywką do hodowli malarii RPMI 1640 uzupełnioną 25 mM HEPES, 5% Albumax II lub 10% surowicy i 40 μg/ml gentamycyny, aby uzyskać 5% hematokryt.
3. Kolby hodowlane należy przeniknąć mieszaniną 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla przed zamknięciem i inkubacją. Alternatywnie można zastosować hermetyczną metodę słoika na świece firmy Trager-Jensen.
4. W przypadku pRBC uzyskanego bezpośrednio od pacjentów, należy inkubować kolbę hodowlaną przez 24-36 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 w} celu uzyskania dojrzałych pasożytów.
   UWAGA: Większość linii laboratoryjnych i przystosowanych do hodowli jest bardzo łatwa do utrzymania w hodowli w standardowych warunkach. Poniżej opisano proste techniki, które można wykorzystać do synchronizacji różnych etapów pasożyta w celu utrzymania tempa wzrostu.
5. Przygotuj cienki rozmaz krwi, jak opisano poniżej, i zbadaj dojrzewanie pasożyta pod mikroskopem świetlnym.

3. Przygotowanie preparatu z cienkim filmem krwi

1. Umieść około 10-15 μl krwi na jednym końcu szkiełka z matowego szkła spoczywającego na płaskiej powierzchni.
2. Dotknij kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka, aż krew zostanie równomiernie rozprowadzona na krawędzi drugiego szkiełka.
3. Trzymając drugi szkiełko pod kątem 45°, szybko, ale delikatnie, nie wywierając zbyt dużego nacisku na pierwszy szkiełko, przesuń krew w poprzek pierwszego szkiełka, aby uzyskać cienką warstwę krwi, która jest równomiernie rozprowadzona. Suszyć na powietrzu.
4. Zanurz szkiełko w metanolu na 10 sekund. Suszyć na powietrzu.
5. Zanurz szkiełko w 2% plamie Giemsa na co najmniej 10 minut. Dokładnie spłucz, aż woda będzie czysta. Suszyć na powietrzu.
6. Zbadaj szkiełko za pomocą soczewki emulsji olejowej 90-100x pod mikroskopem świetlnym

4. Oczyszczanie i synchronizacja etapów bezpłciowych

Oczyszczanie dojrzałego P. falciparum pRBC jest wymaganym krokiem do testu zbrylania. Rzeczywiście, tylko dojrzałe pasożyty są zdolne do wiązania się z receptorami płytek krwi, ponieważ na tym etapie cyklu życiowego odpowiednie ligandy ulegają ekspresji i wystają z powierzchni zakażonych erytrocytów. Istnieje kilka metod oczyszczania i synchronizacji stadiów bezpłciowych P. falciparum.: Późne stadia bezpłciowe można wzbogacić gradientem Percolla ¹⁹; Magnetyczne sortowanie komórek ²⁰ lub przy użyciu opisanego tutaj protokołu sedymentacji ^{żelatyny 21}. Synchronizacja sorbitolu wybiera etapy pierścieniowe ²², po czym pierścienie są hodowane przez 24-26 godzin w celu uzyskania dojrzałych etapów (bez konieczności wykonywania flotacji żelatyny).

4.1 Flotacja żelu plazmowego

Flotacja żelu plazmowego wykorzystuje roztwór podobny do żelatyny, aby wybrać erytrocyty o mniejszej masie, które pozostają w roztworze, podczas gdy gęste formy pierścieniowe i rozety opadają na dno. Technika ta zapewnia do 90% czystości dojrzałych erytrocytów zakażonych w stadium i może być stosowana zarówno do izolatów terenowych, jak i laboratoryjnych. Jednak, jak wspomniano wcześniej, flotacja plazmożelu usuwa rozejące pRBC, a także niedojrzałe etapy, co może skutkować zmniejszoną częstotliwością zbrylania się w próbkach o wysokiej częstotliwości zbrylania. Jednak brak rozestalającego pRBC po flotacji plazmożelu nie wpłynąłby na test zbrylania, ponieważ zbrylanie jest interakcją pRBC i niezakażonych erytrocytów, podczas gdy zbrylanie to wiązanie pRBC za pośrednictwem płytek krwi. Ligand zaangażowany w te dwie cechy jest inny; z głównie receptorem dopełniacza CR-1 na niezakażonych erytrocytach pośredniczących w roustawieniu.

1. Ogrzać roztwór gelofuzyny i surowicę/pożywkę wolną od albumaxu II do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
2. Przenieść kulturę do czystej, sterylnej probówki o pojemności 15 ml i komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 370 x g przez 5 minut.
3. Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu i ponownie zawiesić komórki w równej objętości żelofozyny i pożywki wolnej od białek.
4. Przenieść mieszaninę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odstawić na 15-20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy będzie widoczne wyraźne rozgraniczenie między górnym i dolnym poziomem.
5. Ostrożnie przenieś górną warstwę do świeżej sterylnej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 ml świeżego RPMI.
6. Wirować przy 370 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant.
7. Ocenić parazytemię i stadium rozwojowe za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadać pod mikroskopem świetlnym, jak opisano w punkcie 4.

UWAGA: Dojrzałe prRBC obejmują od 60 do 90% zakażonych erytrocytów, w zależności od początkowej parazytemii hodowli. W przypadku wysokiego odsetka dojrzałych pasożytów należy stosować kultury z początkową parazytemią ≥10%.

5. Test zbrylania

1. Za pomocą hematocytometru Neubauera policzyć i dostosować zawiesinę pRBC otrzymaną po flotacji plazmożelu do wartości 1 x^10,8 pRBC/μl.
2. W świeżej probówce o pojemności 1,5 ml ponownie zawiesić pRBC w stężeniu 5% hematokrytu, oranż akrydynowy w stężeniu końcowym 20 μg/ml i PRP w stężeniu 10% objętości całkowitej.
   Zamiast pomarańczy akrydynowej kultury pasożytów można barwić bromkiem etydyny w ilości 25 μg/ml przez 5 minut przed użyciem.
   Np. w przypadku mieszaniny reakcyjnej o objętości 200 μl należy dodać 10 μl dojrzałego pRBC, 20 μl 3 płytek krwi o wymiarach 300 x 10/μl w przypadku PRP od zdrowych dawców lub 150 x 10³ płytki krwi/μl od pacjentów z SM i 170 μl pożywki bezbiałkowej.
   UWAGA: Stosunek płytek krwi do pRBC w końcowych reakcjach wynosi 20:1. Jest to ważne, ponieważ pozwala na określenie maksymalnej częstotliwości zbrylania próbki. Jeśli w grupie kontrolnej doda się mniej płytek krwi, nie wszystkie zbrylające się prrbc mogą mieć szansę na zlepianie się.
3. W ten sam sposób należy przygotować następujące grupy kontrolne: niezakażone krwinki czerwone i PRP oraz pRBC z PPP, aby ustalić rolę płytek krwi w zlepianiu się pRBC.
4. Przenieść zawiesinę do fiolki ze stożkową nakrętką o pojemności 1,5-2,0 ml.
5. Umieścić fiolkę pod delikatnym mieszaniem, zwijając z prędkością 10-12 obr./min w temperaturze pokojowej.
6. Sprawdzić, czy nie tworzy się grudek za pomocą szkiełka mokrego przygotowanego przez pipetowanie 10 μl mieszaniny pRBC ± płytek krwi na szkiełku szkiełkowym, przykryć szkiełkiem podstawowym i zbadać pod wpływem fluorescencji.
7. Pobieranie próbek można pobierać w odstępach 15-20 minut, co daje łącznie 120 minut. Za grudkę uważa się skupienie trzech lub więcej zakażonych erytrocytów.

Results

Przykład testu grudek za pośrednictwem płytek krwi, wykorzystującego około 70% dojrzałych stadiów P. falciparum po wzbogaceniu przez flotację plazmażelu, pokazano na rysunku 2. Kępa to skupisko trzech lub więcej zakażonych erytrocytów. Barwienie pomarańczą akrydynową lub bromkiem etydyny można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Oranż akrydynowy jest widmowo podobny do fluoresceiny, z maksimum wzbudzenia przy 502 nm i maksimum emisji przy 525 nm (zielony), podczas gdy bromek etydyny ma maksimum wzbudzenia przy 493 nm i maksimum emisji przy 620 nm (podobnie jak barwniki rodaminowe, czerwony). Grudki są łatwe do zauważenia pod mikroskopem, ponieważ w normalnym świetle pojawiają się jako agregaty komórkowe, a pod wpływem fluorescencji jako plamy koloru zielonego lub czerwonego po zabarwieniu odpowiednio barwnikami bromku pomarańczy akrydynowej lub etydyny, jak pokazano na rysunku 2 (30-minutowy punkt czasowy przy użyciu pomarańczy akrydynowej). Im większe grudki, tym większe skupisko komórek pojawia się w normalnym świetle i tym większe plamy zieleni lub czerwieni pod fluoryzacją dla odpowiednich barwników. Ponieważ barwniki celują w DNA, a tym samym barwią jądra, płytki krwi i niezakażone erytrocyty nie są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną ze względu na brak jąder.

Losowe tworzenie małych grudek pRBC po 4,7±1,6 pRBC/grudkach następuje po 30 minutach. Rozmiar grudki znacznie wzrasta do średnio >15 pRBC/grudki po inkubacji przez 120 minut, przy czym niektóre grudki zawierają liczne pRBC/grudki, których nie można było wizualnie policzyć. Częstość fenotypu zlepiania się oblicza się jako liczbę zakażonych komórek obecnych w kępkach/1,000 zakażonych komórek, policzonych w zduplikowanych testach.

Rysunek 1. Przepływ pracy dla eksperymentu z zbrylaniem. Osocze bogate i ubogie w płytki krwi (A) oraz hodowlę erytrocytów zakażonych P. falciparum (B) przygotowuje się, a następnie łączy w celu oznaczenia zbrylania (C).

Rysunek 2. Zlepianie się erytrocytów zakażonych izolatem laboratoryjnym P. falciparum. Grudki utworzone przez HB3 w czasie 0, 30 i 120 min w osoczu bogatopłytkowym (A) i słabe tworzenie się grudek w osoczu ubogim w płytki krwi (B).

Ograniczenia testu

Istnieją ograniczenia, które konkretnie wpływają na funkcję płytek krwi lub wpływają na wynik, a większość z nich została już podkreślona przez Armana i ^{Rowe'a 15}. W tym miejscu wymieniamy niektóre z potencjalnych problemów, które mogą wystąpić na różnych etapach testu:

1. Adaptacja izolatów klinicznych do hodowli in vitro może być wyzwaniem, ponieważ czasami wymagane są dłuższe okresy hodowli, aby osiągnąć wystarczająco wysoką parazytemię, aby umożliwić tworzenie się grudek. Przy wysokich wskaźnikach zmienności antygenowej P. falciparum, fenotyp adhezyjny pasożyta przystosowanego do hodowli może nie odzwierciedlać pierwotnej populacji pasożyta infekującego po dłuższym czasie w hodowli.
2. W celu uniknięcia nieswoistej aglutynacji spowodowanej antygenami grup krwi, dawcy płytek krwi powinni być dopasowani pod względem antygenu grupy krwi z izolatami klinicznymi stosowanymi w tym samym teście lub uniwersalną grupą antygenu krwi dawcy O-. Jednak osoby z grupą krwi O- są rzadkie w miejscach afrykańskich, takich jak Malawi, i dlatego powszechnie stosowane płytki krwi są pozyskiwane od dawców grupy krwi O+ i muszą być dopasowane do grupy krwi.
3. Liczenie grudek na mokrym preparatu jest kłopotliwe i trudne do uchwycenia obrazu, ponieważ komórki są w ciągłym ruchu. Zazwyczaj pRBC gromadzą się na krawędziach szkiełka nakrywkowego lub mają tendencję do sklejania się, tworząc "fałszywe" grudki, które można łatwo pomylić z prawdziwymi grudkami. Aby zmniejszyć ruch komórek, przed analizą pozwól komórkom na osadzanie się przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Test zbrylania jest wrażliwy na czas i dlatego pozwala na analizę tylko jednej próbki na osobę na raz w celu uzyskania optymalnej dokładności. Punkty czasowe pobierania próbek dla dwóch różnych próbek mogą łatwo nakładać się na siebie, co prowadzi do niedopasowania punktów czasowych pobierania próbek między próbkami w przypadku obsługi więcej niż jednej próbki w tym samym czasie. W takich okolicznościach zaawansowane oprogramowanie ilościowe może obliczyć rozmiary grudek lub alternatywnie można użyć przeciwciał specyficznych dla komórek do analizy składu grudek. Chociaż techniki te mogą znacznie poprawić znaczenie danych, w warunkach ubogich w zasoby, w których ten test może być stosowany, takie techniki i sprzęt nie są łatwo dostępne.

Discussion

Opisaliśmy test zlepiania się płytek krwi stosowany do badania pRBC w izolatach klinicznych bezpośrednio w terenie. Zlepianie się płytek krwi, charakterystyczne zachowanie izolatów klinicznych P. falciparum , zostało zidentyfikowane jako odrębny fenotyp adhezyjny, częsty w izolatach wiążących CD36 ^12,23-24. Użyliśmy tego testu do zidentyfikowania trzech głównych punktów: 1) silny fenotyp zbrylania in vitro P. falciparum wyizolowany od dzieci z Malawi, który jest związany z ciężkością choroby i diagnozą 2) pośredniości selektora P nowego receptora P, zlepiający się na płytkach krwi wraz z CD36, 3) stopień małopłytkowości występujący u pacjentów z CM jest wystarczający, aby ograniczyć dalsze tworzenie się grudek pRBC in vitro ¹². Udział płytek krwi w tworzeniu się grudek wykazano poprzez badanie preparatu do mokrego szkiełka, jak opisano w punkcie 6. Płytki krwi można wyizolować z PRP przez wirowanie z dużą prędkością w celu zminimalizowania reakcji antygenowych grup krwi; jednak użyliśmy całego PRP, aby zminimalizować przedwczesną aktywację płytek krwi w wyniku nadmiernego obchodzenia się i wirowania z dużą prędkością. Aktywność płytek krwi można zmierzyć za pomocą testu agregacji płytek krwi przy użyciu słabych agonistów płytek krwi, epinefryny lub difosforanu adenozyny (ADP) ²⁵ , jak opisano w ²⁶.

Istnieje kilka aspektów testu, które wcześniej zostały słabo scharakteryzowane, jednym z nich jest znaczenie wyboru źródeł PRP i wpływ grup antygenów krwi na wynik testu. Otworzyliśmy PRP od osób, które miały grupę krwi O+ i nie przyjmowały żadnych leków w ciągu ostatnich 7-10 dni przed pobraniem krwi, ponieważ niektóre farmaceutyki mogą wpływać na zachowanie płytek krwi.

Inne czynniki, które mogą wpływać na powodzenie zbrylania, obejmują hematokryt pRBC, poziomy parazytemii i długość testu zbrylania. Korzystając z wysokiego hematokrytu i liczby płytek krwi, trudno byłoby stwierdzić, czy gromada jest naprawdę grudką, czy też zbyt wiele komórek po prostu siedzi razem, ponieważ są gęsto upakowane ¹⁵. Zbrylanie się również na ogół zwiększa się wraz z dłuższym czasem inkubacji. Są to wszystkie przydatne wskazówki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania badań zbrylania.

Odkryliśmy, że próbki z różnych grup klinicznych mogą być analizowane równolegle przy użyciu PRP od tego samego dawcy, jeśli jest to możliwe, ale w warunkach ograniczonych zasobów, takich jak miejsca polowe, pula transfuzji jest na ogół ograniczona. W związku z tym trudno jest mieć jednego dawcę O+ w celu standaryzacji testów. W związku z tym zidentyfikowaliśmy kilku dawców O+, aby w miarę możliwości zapewnić zgodność grup krwi. Korzystanie z wielu dawców jest również pomocne w przypadku dużych próbek, tak aby ciężar oddawania krwi nie spoczywał tylko na jednej osobie.

Punkty pobierania próbek po 15-20 minutach są znacznie bardziej wykonalne, jeśli testy przeprowadza jedna osoba, co pozwala na przygotowanie preparatu na mokro i przeprowadzenie kinetyki testu bez nakładania się na siebie czasu pobierania próbek. Większość danych mikroskopowych ma charakter wizualny i jest w pewnym stopniu obiektywna; Dlatego ważne jest, aby liczenie komórek było weryfikowane przez więcej niż jedną osobę. W takim przypadku obsługa jednej próbki na raz może pozwolić na pełną analizę trzech do czterech próbek dziennie, w zależności od osobistej wydajności.

Zlepianie płytek krwi można wykonać zarówno przy użyciu izolatów klinicznych, jak i laboratoryjnych. W przypadku linii laboratoryjnych zaleca się stosowanie pasożytów wiążących CD36 w celu maksymalizacji częstotliwości zbrylania. Test może być połączony z innymi testami aglutynacji, takimi jak rosetting lub stosowany w testach hamowania zbrylania, które umożliwiłyby badanie receptorów na płytkach krwi, które mogą pośredniczyć w wiązaniu pRBC, słabo poznanym i zbadanym aspekcie tego fenotypu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
Pomarańcz akrydynowy	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
Gelofusine	B Braun	Gelofusine
1 M HEPES	Invitrogen	15630
Gentamycyna	Invitrogen	15750045	50 mg/ml
Albumax	GIBCO	1102-037
Vacutainer cytrynianu sodu	BD	362760	o pojemności 4 ml
Mikroskop odwrócony	Leica	MD16000 B
Mikroskop fluorescencyjny	Leica	EL6000	Zawiera filtry fluorescencyjne światła niebieskiego i zielonego do oranżu akrydynowego i bromku etydyny