Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy film opisuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała (BLI) do badania przemieszczania się bakterii w żywych myszach, ze szczególnym uwzględnieniem wykorzystania bakterii w terapii genowej i komórkowej nowotworów. Bakterie stanowią atrakcyjną klasę wektorów w terapii nowotworowej, ponieważ posiadają naturalną zdolność do preferencyjnego namnażania się w guzach po podaniu systemowym. Bakterie zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji kasety genów lux umożliwiają detekcję BLI bakterii, a jednocześnie miejsc występowania guzów. Lokalizację oraz poziom bakterii w guzach w czasie można w łatwy sposób zbadać i zwizualizować w dwóch lub trzech wymiarach. Metoda ta ma zastosowanie do szerokiego zakresu gatunków bakterii i typów ksenoprzeszczepów nowotworowych. Niniejszy artykuł opisuje protokół analizy bakterii bioluminescencyjnych u myszy z podskórnymi guzami. Opisano również wizualizację bakterii komensalnych w przewodzie pokarmowym (GIT) za pomocą BLI. Ta potężna i tania strategia obrazowania w czasie rzeczywistym stanowi idealną metodę badania bakterii in vivo w kontekście badań nad nowotworami, w szczególności terapii genowej, oraz chorobami zakaźnymi. Film ten przedstawia procedurę badania E. coli znakowanych genami lux u żywych myszy, demonstrując przestrzenną i czasową analizę możliwą do uzyskania przy użyciu systemu BLI IVIS.
Protokół
1. Indukcja guza
- W celu rutynowej indukcji nowotworu, minimalną dawkę tumorigenną komórek zawieszonych w 200 μl bezserwatkowego medium hodowlanego wstrzykiwano podskórnie (s.c.) w bok wolnych od infekcji samic myszy Balb/C lub atymicznych MF1-nu/nu w wieku 6-8 tygodni, n=6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 106 komórek 4T1), używając igły strzykawki o rozmiarze 21G. Żywotność komórek użytych do inokulacji wynosiła ponad 95 %, co określono poprzez przeliczenie wizualne przy użyciu hemocytometru i testu wykluczania błękitu trypanu (Trypan Blue Dye Exclusion) (Gibco).
- Po utworzeniu się guza pozwalano mu rosnąć i rozwijać się, monitorując go dwa razy w tygodniu. Objętość guza obliczano zgodnie ze wzorem V=(ab2) Π/6, gdzie a to najdłuższa średnica guza, a b to najdłuższa średnica prostopadła do średnicy a.
2. Przygotowanie bakterii
- Szczep bakteryjny wykorzystany w niniejszym protokole to E. coli K-12 MG1655, szczep niewytwarzający toksyn białkowych, zawierający plazmid kodujący luxABCDE, który umożliwia detekcję bakterii za pomocą BLI. E. coli MG1655 z zintegrowanym luxABCDE hodowano tlenowo w temperaturze 37 °C w pożywce LB (Sigma-Aldrich, Irlandia) uzupełnionej o 300 μg/ml erytromycyny (Em). Bioluminescencyjny szczep pochodny MG1655 stworzono z wykorzystaniem plazmidu p16Slux, który zawiera konstytutywny operon PHELPluxABCDE 1.
- W celu przygotowania do podania myszom, kultury inkubowano w pożywce LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 200 rpm do fazy średnio-logarytmicznej (gęstość optyczna przy 600 nm). Bakterie zebrano poprzez wirowanie (6,000 × g przez 5 min), przemyto PBS (Sigma) i rozcieńczono w PBS do stężenia 1 × 107 jednostek tworzących kolonie (cfu)/ml do podania dożylnego (IV) lub 1 x 1010 do podania przez zgłębnik (gavage).
3. Podawanie bakterii
- Myszy zostały losowo podzielone na grupy doświadczalne, gdy objętość guzów osiągnęła około 100 mm3. W przypadku podaży dożylnej, unieruchomione myszy otrzymały każda 106 komórek w 100 μl, wstrzykniętych bezpośrednio do bocznej żyły ogonowej za pomocą igły strzykawki 28G. Liczbę żywych komórek każdego inokulum określono metodą siewu retrospektywnego.
- W badaniach nad kolonizacją przewodu pokarmowego (GIT), 109 komórek bakteryjnych podawano doustnie w 100 μl na mysz za pomocą zgłębnika, przez trzy kolejne dni. Poziom istniejących bakterii komensalnych obniżono przed podawaniem poprzez dodanie 5 mg/ml streptomycyny do wody pitnej myszy przez 7 dni przed rozpoczęciem podaży doustnej za pomocą zgłębnika 1.
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
- Obrazowanie BLI 2D in vivo wykonano za pomocą systemu IVIS100 (Caliper). W określonych punktach czasowych po podaniu bakterii myszy znieczulono przy użyciu systemu znieczulania gazowego XGI-8 firmy Caliper z zastosowaniem 3% izofluranu, a następnie przeprowadzono analizę obrazu całego ciała w systemie IVIS 100 przez 2-5 min przy wysokiej czułości.
- W przypadku obrazowania 3D znieczulone myszy umieszczono w uchwycie do obrazowania myszy wewnątrz systemu obrazowania optycznego w celu wykonania obrazowania grzbietowego (IVIS Spectrum, Caliper). Aby uzyskać obrazy sygnału lucyferazy bakteryjnej do rekonstrukcji optycznej 3D, zastosowano filtry emisyjne o długościach fal od 500-580 nm z czasem akwizycji bin 16 wynoszącym 3-4 min na filtr, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. W ramach tej sekwencji akwizycji obrazów uzyskano obraz światła strukturalnego w celu zdefiniowania mapy wysokości. Mapę tę wprowadzono do algorytmów rekonstrukcji tomografii obrazowania światła rozproszonego (DLIT), które posłużyły do utworzenia optycznego obrazu 3D przy użyciu optymalizacji najmniejszych kwadratów nieujemnych 2.
- Analiza obrazu: Obszary zainteresowania zidentyfikowano i ilościowo oceniono przy użyciu oprogramowania Living Image (Caliper).
5. Reprezentatywne wyniki
W niniejszym badaniu niepatogenne bakterie komensalne E.coli K-12 MG1655 wykazujące ekspresję operonu luxABCDE podano dożylnie myszom z podskórnymi ksenoprzeszczepami guzów 4T1. Sygnał bakteryjny lux wykryto specyficznie w guzach myszy po podaniu dożylnym (Rysunek 2). Odzyskanie hodowli bakterii z próbek pobranych od myszy potwierdza istnienie liniowej zależności między liczbą żywych bakterii a ilością wykrytego światła (Rysunek 3). Dzięki zastosowaniu 3D BLI uzyskano również obrazowanie in vivo bakterii komensalnych podanych doustnie do przewodu pokarmowego.
Rysunek 1. Harmonogram protokołu. U myszy indukuje się guzy podskórne, a bakterie podaje się po rozwoju guza (100 mm3). U żywych myszy wykonuje się obrazowanie BLI w różnych punktach czasowych po podaniu bakterii (strzałki wskazują typowe terminy).
Rysunek 2. Podanie E. coli MG1655 luxABCDE myszom z nowotworem. Podskórne guzy 4T1 indukowano u myszy MF1 nu/nu, a E. coli MG1655 luxABCDE podano po rozwoju nowotworu. Każde zwierzę otrzymało 106 komórek wstrzykniętych bezpośrednio do bocznej żyły ogonowej. Obrazowanie myszy przeprowadzono w czterech punktach czasowych podczas badania (czarne kropki na osi z i obrazy), z późniejszym odzyskaniem żywych bakterii (cfu) z guzów pobranych od uśpić myszy (wykres słupkowy). W czasie badania zaobserwowano wzrost liczby bakterii i ekspresji genów plazmidowych specyficznie w guzach (na każdy punkt czasowy przedstawiono reprezentatywną mysz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rycina 3. Zależność między liczbą bakterii wewnątrzguza a bioluminescencją. Żywe bakterie w guzach wyliczono za pomocą hodowli bakteryjnej ex vivo z guzów po wykonaniu BLI w różnych punktach czasowych po podaniu dożylnym (IV). Na wykresie przedstawiono wartości logarytmiczne liczby bakterii (cfu) w stosunku do jednostek bioluminescencji in vivo. Zaobserwowano silną korelację między liczbą bakterii a sygnałami bioluminescencji bakteryjnej R2=0,97171.
Rysunek 4. Trójwymiarowy obraz IVIS przewodu pokarmowego myszy skolonizowanego przez E. coli MG1655. Przewód pokarmowy myszy został skolonizowany poprzez doustną administrację 109 cfu E. coli przez trzy kolejne dni. Przedstawiono przykładowy obraz wyizolowany z tomografii 3D skolonizowanej myszy. Obrazy 3D zawierają cyfrowy atlas szkieletu myszy w celu zapewnienia rejestracji anatomicznej. Bioluminescencja E. coli MG1655 jest widoczna w kolorze zielonym dla niższych i fioletowym dla wyższych poziomów intensywności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W kontekście terapii genowej wykorzystanie czynników biologicznych do dostarczania genów terapeutycznych pacjentom wykazuje duże perspektywy 3-5. Podobnie jak wirusy, wrodzone właściwości biologiczne bakterii umożliwiają efektywne dostarczanie DNA do komórek lub tkanek, szczególnie w przypadku nowotworów. Wykazano, że bakterie podawane systemowo mają naturalną zdolność do kierowania się w stronę guzów, co skutkuje wysokim poziomem replikacji miejscowej, albo na zewnątrz komórek nowotworowych (gatunki nieinwazy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za wsparcie związane z niniejszym manuskryptem otrzymane z programu Seventh Framework Programme Komisji Europejskiej (PIOF-GA-2009-255466) oraz irlandzkiej Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Szczepy E. coli znakowane Lux zostały uprzejmie przekazane przez dr. Cormaca Gahana z University College Cork.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| linia komórkowa 4T1 | ATCC | CRL-2539 | Syngeneiczny model raka piersi pochodzący z samoistnie powstałego guza gruczołu mlekowego myszy BALB/c |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Fosforanowy bufor solny |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 do obrazowania 2D; IVIS Spectrum do obrazowania 3D. | |
| pożywka Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Pożywka wzrostowa dla E. coli |
| Erytromycyna | Sigma-Aldrich | E5389 | Antybiotyk |
| Streptomycyna | Sigma-Aldrich | S9137 | Antybiotyk |
| myszy MF1nu/nu | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Myszy nago-athymiczneFoxn1nu |
| myszy Balb/c | Harlan (UK) | 066 | Haplotyp:H-2d |
| Kaniula do gavage'u | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | prosta igła do zgłębnika 22G x 38 mm |
| Strzykawka do iniekcji dożylnej | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Strzykawka insulinowa z igłą 28 G x ½ mikrocienka igła do infuzji dożylnej (IV) o długości 1 cala. |
| Strzykawka do inokulacji guza | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ igła calowa |
Bibliografia
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940(2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
