Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Podsumowanie

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Streszczenie

Wielofunkcyjność, czyli zdolność jednej struktury peryferyjnej do generowania wielu odrębnych zachowań¹, pozwala zwierzętom na szybką adaptację ich zachowań do zmieniającego się środowiska. Morskie mięczak Aplysia californica stanowi przystępny system do badania wielofunkcyjności. Podczas żerowania Aplysia generuje kilka odrębnych typów zachowań, wykorzystując ten sam aparat pokarmowy – masę gębową. Zwoje kontrolujące te zachowania zawierają szereg dużych, zidentyfikowanych neuronów, które są dostępne do badań elektrofizjologicznych. Aktywność tych neuronów opisano w ramach programów ruchowych, które można podzielić na dwa typy: programy ingestywne (wprowadzające pokarm) i egestywne (wydalnicze), w zależności od czasu aktywności neuronalnej zamykającej chwytak pokarmowy w stosunku do aktywności neuronalnej wysuwającej lub cofającej chwytak². Jednak w izolowanych zwojach ruchy mięśni, które wywołują te zachowania, nie występują, co utrudnia pewność, czy obserwowane programy ruchowe są korelatami rzeczywistych zachowań. In vivo uzyskano zapisy z nerwów i mięśni odpowiadające programom żerowania^2,3,4, lecz bezpośrednia rejestracja z pojedynczych neuronów jest bardzo trudna⁵. Ponadto in vivo programy ingestywne można dalej podzielić na kęsy i połykania^1,2, co jest rozróżnieniem trudnym do dokonania w większości wcześniej opisanych preparatów in vitro.

Preparat zawieszonej masy bukkalnej (Rysunek 1) wypełnia lukę pomiędzy izolowanymi zwojami a nienaruszonymi zwierzętami. W tym preparacie można wywołać zachowania pokarmowe – w tym zarówno gryzienie, jak i połykanie – oraz zachowania wydalnicze (odrzucanie), przy jednoczesnej możliwości rejestracji i stymulacji pojedynczych neuronów za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych⁶. Ruchy żerowania związane z tymi różnymi zachowaniami mogą być rejestrowane, kwantyfikowane i bezpośrednio wiązane z programami motorycznymi. Programy motoryczne w preparacie zawieszonej masy bukkalnej wydają się być bardziej podobne do tych obserwowanych in vivo niż programy motoryczne wywołane w izolowanych zwojach. Zatem programy motoryczne w tym preparacie mogą być bardziej bezpośrednio powiązane z zachowaniem in vivo; jednocześnie pojedyncze neurony są bardziej dostępne do rejestracji i stymulacji niż u nienaruszonych zwierząt. Ponadto, jako etap pośredni między izolowanymi zwojami a nienaruszonymi zwierzętami, wyniki uzyskane z zawieszonej masy bukkalnej mogą pomóc w interpretacji danych otrzymanych zarówno w układach bardziej zredukowanych, jak i bardziej kompletnych. Preparat zawieszonej masy bukkalnej jest użytecznym narzędziem do charakteryzacji neuronalnej kontroli wielofunkcyjności u Aplysia.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Aby przygotować roztwór chlorku magnezu izotoniczny względem wody morskiej, w której utrzymywane są zwierzęta (~ 1,000 millosmolar), zaznacz na dużym naczyniu poziom pożądanego wolumenu. Napełnij naczynie wodą destylowaną do około 80% tego poziomu i odważ odpowiednią ilość sześciowodnego chlorku magnezu, aby uzyskać stężenie 333 mM w objętości końcowej. Dodaj chlorek magnezu do naczynia, zamknij pokrywkę i energicznie wstrząśnij, aż chlorek magnezu całkowicie się rozpuści, a następnie dolej wodę destylowaną do osiągnięcia objętości końcowej.
2. Aby przygotować sól fizjologiczną dla Aplysia, ponownie zaznacz na dużym naczyniu poziom pożądanej objętości i napełnij je wodą destylowaną do około 80% tego poziomu. Postaw naczynie na mieszalniku magnetycznym, włóż do niego mieszadło i włącz urządzenie.
3. Odważaj i dodawaj do naczynia po kolei odpowiednie ilości następujących substancji, aby uzyskać takie stężenia w objętości końcowej: 460 mM chlorku sodu, 10 mM chlorku potasu, 22 mM sześciowodnego chlorku magnezu, 33 mM siedmiowodnego siarczanu magnezu, 10 mM dwuwodnego chlorku wapnia, 10 mM glukozy oraz 10 mM MOPS.
4. Gdy substancje zostaną całkowicie rozpuszczone, zmierz pH roztworu za pomocą pH-metru. Powoli dodawaj 1 M wodorotlenek sodu, aby podnieść pH do końcowej wartości 7,5. W przypadku przypadkowego dodania zbyt dużej ilości wodorotlenku sodu, można dodać 1 M kwas solny w celu obniżenia pH.
5. Dolej wodę destylowaną do osiągnięcia objętości końcowej.
6. Aby spowolnić wzrost bakterii, przechowuj roztwory w lodówce do czasu ich wykorzystania w eksperymencie. Należy pamiętać, że temperatura może wpływać na programy motoryczne Aplysia. Nie monitorujemy temperatury w sposób rygorystyczny, ale po zakończeniu przygotowań preparaty zazwyczaj znajdują się w temperaturze bliskiej temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie naczynia pomiarowego

1. Podczas eksperymentu masa jamienna zostanie zawieszona w roztworze w okrągłym naczyniu Pyrex o wymiarach 100 mm (średnica) x 50 mm (wysokość). Naczynie to powinno posiadać przednią komorę dla masy jamiennej, wąską, podwyższoną platformę środkową, na której zwoje jamienne są przypięte do Sylgardu, oraz oddzielną, podwyższoną komorę tylną, w której izolowany jest zwoj mózgowy. Wcięcia w Sylgardzie powinny łączyć platformę zwojów jamiennych z komorą zwoju mózgowego. Należy zapoznać się z Rysunkiem 1, odnosząc się do określonych wymiarów kluczowych podczas konstruowania naczynia.
2. Aby przygotować to naczynie, należy zacząć od okrągłego naczynia Pyrex 100 x 50 mm. Przygotować Sylgard zgodnie z instrukcją dołączoną do produktu. Konstrukcja naczynia wymaga kilku etapów wlewania Sylgardu, pomiędzy którymi należy odczekać do jego utwardzenia.
3. Pierwsze wlewanie służy do utworzenia najwyższego poziomu Sylgardu w naczyniu, czyli ścianki pomiędzy komorami jamienną i mózgową (patrz Rysunek 1). Należy oddzielić tę część naczynia od pozostałych sekcji. Do budowy ścianek oddzielających sekcje można użyć plasteliny. W przypadku ścianki płaskiej można użyć kawałka tektury z podkładem z plasteliny. W przypadku ścianki zakrzywionej (która zmniejsza rozmiar komory zawierającej zwoj mózgowy) należy użyć wyłącznie plasteliny jako bazy ścianki. Wszystkie ścianki w miejscach kontaktu z Sylgardem należy pokryć folią spożywczą, aby ułatwić ich późniejsze usunięcie.
4. Gdy przestrzeń na ściankę między komorami jamienną i mózgową zostanie oddzielona zgodnie z opisem w punkcie 2.3, przy zachowaniu szczelności krawędzi w celu zminimalizowania wycieków, należy wlać Sylgard do tej przestrzeni prawie do górnej krawędzi naczynia. Pozostawić Sylgard do utwardzenia na noc i upewnić się, że jest on całkowicie stwardniały przed kontynuowaniem prac. Umieszczenie naczynia w ciepłym miejscu przyspieszy proces utwardzania.
5. Następnie należy wlać platformę zwojów jamiennych oraz komorę zwoju mózgowego (ponownie patrz Rysunek 1, który pokazuje położenie tych zwojów w gotowym naczyniu). Usunąć poprzednie ścianki oddzielające i utworzyć nową ściankę w odległości 0,5 cm od płaskiej ścianki Sylgardu w sekcji środkowej, aby oddzielić platformę zwojów jamiennych. Do utworzenia tylnej komory, w której znajdzie się zwoj mózgowy, nie są wymagane żadne ścianki. Wlać Sylgard do obu sekcji do wysokości około 3 mm poniżej poziomu górnego. Komora mózgowa powinna być nieco niżej niż platforma zwojów jamiennych. Ponownie pozostawić Sylgard do utwardzenia na noc.
6. Na koniec wlać przednią komorę (t.j. komorę, w której zawieszona będzie masa jamienna). Żadne ścianki nie są wymagane. Wlać do odpowiedniej wysokości określonej na Rysunku 1.
7. Ostatnim krokiem jest wycięcie wcięcia łączącego platformę zwojów jamiennych z komorą mózgową. Głębokość wcięcia powinna być równa poziomowi platformy zwojów jamiennych. Do wykonania wcięcia można użyć ostrza skalpela. Rysunek 1 przedstawia gotowe naczynie.

3. Przygotowanie elektrod

1. Wytwórz elektrody zewnątrzkomórkowe z jednorurkowych kapilar szklanych, używając wyciągacza mikropipet Flaming-Brown. Średnice wewnętrzne elektrod powinny wynosić około 40 μm, a ich rezystancje około 0.1 MΩ. Przy zastosowaniu włókna FT345B w wyciągaczu, nasze typowe ustawienia programu to: Heat 480, Pull 50, Vel 13 oraz Time 20, jednak należy pamiętać, że ustawienia różnią się w zależności od rodzaju włókna. Program ten tworzy elektrody w jednym cyklu wyciągania, bez etapu polerowania ogniem. Przed rozpoczęciem eksperymentu wypełnij elektrody zewnątrzkomórkowe soli fizjologicznej dla Aplysia.
2. Wykonaj elektrody hakowe do rejestracji z nerwu i mięśnia², stosując protokół zbliżony do opisanego przez Cullinsa i Chiela⁴, z wyjątkiem tego, że poszczególne elektrody nie muszą być owinięte wokół siebie. Kroki prowadzące do wykonania tych elektrod opisano w punktach 3.3-3.13.
3. Odetnij kawałek emaliowanego drutu ze stali nierdzewnej o średnicy 0.001 cala o długości około 60 cm. Przymocuj kulkę plasteliny do każdego końca drutu, unieś drut w powietrzu za jego środkowy punkt i zakręć dwiema kulkami plasteliny wokół siebie, aby druty owinęły się nawzajem (redukuje to przejścia pojemnościowe).
4. Złącz oba końce drutu, łącząc dwie kulki plasteliny w jedną, a drugi koniec drutu przymocuj taśmą, aby go zawiesić.
5. Pokryj cały odcinek drutu domowym klejem silikonowym, nakładając kroplę kleju na kciuk, dociskając kciuk i palec wskazujący do drutu i przesuwając nimi wzdłuż jego długości. Pozostaw klej do wyschnięcia na noc.
6. Po wyschnięciu kleju połóż drut na płaskiej powierzchni pod stereomikroskopem. Przetnij drut w miejscu, które wcześniej było jego środkiem, otrzymując dwa osobne druty skręcone ze sobą. Jest to elektroda różnicowa.
7. Użyj taśmy, aby unieruchomić jeden z końców elektrody. Za pomocą pęsety usuń klej i emalię, przygotowując oba druty na jednym końcu tak, aby uzyskać około 2 cm wolnego drutu, z czego około 1 cm powinno być pozbawione emalii. Przylutuj złoty pin łącznika do każdego z drutów i owiń piny taśmą laboratoryjną, aby pozostały odseparowane.
8. Na drugim końcu elektrody przygotuj druty tak, aby uzyskać około 3 mm wolnego drutu. Usuń emalię z ostatnich około 1 mm jednego z drutów i odegnij go na bok. Jest to drut referencyjny. Kluczowe jest, aby nieosłonięte fragmenty obu drutów nie dotykały się nawzajem.
9. Usuń emalię z drugiego drutu aż do warstwy kleju silikonowego. Wygnij ten drut w kształt haka i utnij go do długości około 1 mm. Hak ten będzie służył do mocowania do nerwu lub mięśnia. Zastosowanie krótkiego haka zapewnia większą stabilność podczas mocowania nerwu do elektrody.
10. Użyj multimetru, aby sprawdzić, czy elektroda jest prawidłowo wykonana i nieuszkodzona. Jeden złoty łącznik powinien wykazywać rezystancję w granicach 200-500 omów względem końcówki jednego drutu, a drugi złoty łącznik powinien wykazywać podobną wartość względem drugiego drutu.
11. Jeśli połączenie na jednym z drutów jest przerwane, można spróbować ponownie zdjąć emalię z końca drutu i ponownie przylutować jeden lub oba złote łączniki. Jeśli oba złote łączniki mają połączenie z obydwoma drutami, może to oznaczać, że dwa nieosłonięte druty stykają się ze sobą. Można spróbować naprawić drugi koniec, aby wyeliminować ten problem; w przeciwnym razie elektrodę należy odrzucić.
12. Powtórz tę procedurę dla takiej liczby elektrod, jaka jest potrzebna do eksperymentu. Elektrody hakowe można wykorzystywać wielokrotnie w kolejnych eksperymentach, odcinając koniec przymocowany do nerwu i formując nowe haki, aż drut stanie się zbyt krótki po wielu użyciach. Za każdym razem, gdy jest to wykonywane, użyj multimetru, aby sprawdzić ciągłość elektrody.
13. Aby odróżnić poszczególne elektrody podczas eksperymentów, opisz elektrody i ich kable. Pomocne jest użycie taśm laboratoryjnych w różnych kolorach.

4. Disekcja zwierząt i przygotowanie masy gwałkowej

1. Wybierz zdrowe zwierzę o masie około 200-300 g. Po podaniu wodorostów zwierzę powinno wykonywać kęsy z silnymi protrakcjami w regularnych odstępach czasu wynoszących 3-5 sec.
2. Umieść zwierzę w kuwecie sekcyjnej i zanieść, wstrzykując izotoniczny roztwór chlorku magnezu w ilości odpowiadającej około 50% masy ciała. Wykonaj pierwsze wstrzyknięcie strzykawką pod kątem około 15 do 30 stopni, w pobliżu środka ciała, kierując igłę w stronę ogona zwierzęcia. Po iniekcji delikatnie masuj powierzchnię ciała zwierzęcia, aby rozprowadzić chlorek magnezu. W razie potrzeby wykonaj dodatkowe wstrzyknięcia, kierując strzykawkę w stronę głowy zwierzęcia.
3. Gdy zwierzę przestanie reagować na delikatne bodźce dotykowe, przytwierdź je do kuwety szpilkami grzbietem do góry, wbijając jedną szpilkę w ogon i po jednej szpilce w każdy przedni czułek.
4. Używając pincety, uchwyć i unieś skórę zwierzęcia w środkowej części głowy, za rinoforami. Wykonaj cięcie wieńcowe w poprzek głowy zwierzęcia, tuż za uchwyconym punktem. Następnie wykonaj cięcie pośrodkowe, kierując się do przodu między rinoforami w stronę otworu gębowego, aby odsłonić masę buccalną.
5. Za pomocą pincety odciągnij płat skóry w swoją stronę, oddalając go od masy buccalnej, a następnie przetnij nerwy i tkankę łączną przytwierdzoną do ściany ciała, aby całkowicie oddzielić ten płat skóry od masy buccalnej. Należy uważać, aby nie przeciąć żadnych nerwów ani tkanek wewnątrzmasy buccalnej.
6. Używając pincety, chwyć i utrzymaj przełyk. Przetnij przełyk za punktem uchwytu. Unieś przełyk do góry, aby podnieść masę buccalną podczas wykonywania kolejnych cięć.
7. Za masą buccalną zwoje mózgowe, pleuralne i pedalne tworzą pierścień, przy czym zwój mózgowy jest połączony ze zwojami buccalnymi za pomocą konektywów mózgowo-buccalnych (CBCs). Pozostaw te zwoje pierścieniowe przytwierdzone do masy buccalnej i przetnij wszystkie nerwy odchodzące z tych zwojów do innych części ciała.
8. Przetnij tkankę łączną wokół masy buccalnej, kontynuując jej unoszenie w miarę zmniejszania się połączeń z ciałem. Gdy masa buccalna pozostanie przytwierdzona jedynie w obrębie otworu gębowego, przełyk i masę buccalną należy trzymać pionowo w górę.
9. Wykonaj ostatnie cięcie tuż przed żuwaczkami, aby uwolnić masę buccalną z ciała. Umieść masę buccalną w roztworze składającym się z 50% izotonicznego chlorku magnezu i 50% soli fizjologicznej dla Aplysia , aby utrzymać częściowe znieczulenie podczas mocowania elektrod.
10. Umieść masę buccalną wraz z roztworem w szalce Petriego z dnem z Sylgardu. Usuń zwoje pleuralne i pedalne, przecinając ich połączenia ze zwojem mózgowym. Pozostaw zwój mózgowy połączony ze zwojami buccalnymi i masą buccalną poprzez konektywy mózgowo-buccalne (CBCs); przetnij pozostałe połączenia między zwojem mózgowym a masą buccalną. Przytnij przełyk i gruczoły ślinowe do krótkiej długości, aby nie przeszkadzały w pracy.

5. Mocowanie elektrody hakowej

1. Do rejestracji i stymulacji można przymocować elektrody hakowe do kilku różnych nerwów i mięśni, w zależności od potrzeb eksperymentu (Rycina 2).
2. Aby scharakteryzować wzorce wykazane in vivo przez Cullinsa i Chiela⁴, przymocuj elektrody do nerwu radularnego, mięśnia I2 oraz nerwów bukkalnych 2 i 3. Wspólnie rejestracje te ukazują aktywność neuronów ruchowych głównych mięśni wewnętrznych masy bukkalnej^3,7,8 i pozwalają na identyfikację fazy protrakcji z zapisu mięśnia I2³, fazy retrakcji z zapisów z nerwów bukkalnych 2 i 3^2,5,8 oraz czasu zamknięcia chwytaka pokarmowego z zapisu z nerwu radularnego². Przymocuj dodatkową elektrodę hakową do gałęzi a nerwu bukkalnego 2 w celu stymulacji wzorca. Mocowanie elektrod odbywa się zgodnie z procedurą podobną do tej zaprezentowanej przez Cullinsa i Chiela⁴, która została opisana w poniższych krokach.
3. Przy każdym mocowaniu elektrody umieść elektrodę na manipulatorze grubszym. Do manipulatora przyklej taśmą drewniany patyk z klipsem krokodylkiem na końcu i użyj klipsa do przytrzymania końcówki elektrody. Klips powinien być przymocowany do sekcji elektrody pokrytej silikonem, około 1 cm przed końcem powłoki silikonowej. Użyj manipulatora, aby ustawić elektrodę hakową w pobliżu masy bukkalnej.
4. Kładąc masę bukkalną na boku i dociskając ją do ścianki naczynia dla stabilności, zacznij od nerwu radularnego, który jest najtrudniejszy do przymocowania elektrody. Istnieją dwie opcje dostępu do tego nerwu.
5. Nerw radularny wychodzi spod zwoju bukkalnego i przechodzi pod mięśniem I2 w dwóch gałęziach. Najpierw sprawdź, czy można uzyskać dostęp do nerwu radularnego bez przecinania mięśnia. Delikatnie odsuń białą osłonkę łączącą zwoje bukkalne z mięśniem I2; nie przecinaj tej osłonki. Jeśli nerw jest dostępny, użyj pęsety z końcówką zgiętą w hak, aby unieść jedną gałąź nerwu.
6. Jeśli nerw radularny nie jest dostępny w ten sposób, drugą opcją jest zlokalizowanie nerwu pod cienkim mięśniem I2 i wykonanie niewielkiego nacięcia w I2 w celu odsłonięcia nerwu. Nacięcie to powinno przejść przez dwie warstwy mięśnia. Użyj pęsety hakowatej, aby wyciągnąć gałąź nerwu radularnego spod mięśnia.
7. Użyj manipulatora, aby ustawić hak elektrody obok nerwu. Aby umieścić nerw w haku, pomocne jest trzymanie nerwu w pęsecie hakowatej, jednocześnie używając drugiej pęsety do rozdzielenia dwóch trzymanych połówek nerwu.
8. Po bezpiecznym umieszczeniu nerwu w haku, użyj manipulatora, aby unieść nerw z dala od masy bukkalnej, aż zostanie napięty, ale nie rozciągaj go zbyt mocno.
9. Weź chusteczkę Kimwipe i ciasno skręć jeden róg, aby utworzyć mały knot. Użyj tego knota do osuszenia końcówki elektrody i odcinka nerwu, który został zahaczony.
10. Użyj drugiej pęsety z zakrzywioną końcówką, aby nałożyć kropelkę superkleju Quick Gel na zahaczony nerw. Rozpocznij aplikację w punkcie styku drutu z nerwem. Upewnij się, że hak jest całkowicie pokryty klejem, a końcówka drutu referencyjnego nie jest zaklejona (Rycina 3).
11. Użyj strzykawki z dołączoną rurką polietylenową, aby nanieść roztwór z naczynia na klej, co spowoduje utwardzenie jego powierzchni. Upewnij się, że klej jest dokładnie obmyty roztworem, aby zapewnić jego prawidłowe zastygnięcie.
12. Użyj manipulatora, aby zwolnić napięcie nerwu, a następnie zwolnij elektrodę z klipsa. To kończy procedurę mocowania jednej elektrody hakowej.
13. Następnie należy przymocować elektrodę do mięśnia I2. Rejestrujemy aktywność EMG z mięśnia I2, a nie aktywność ENG z unerwiającego go nerwu, ponieważ nerw I2 jest bardzo mały i trudny do dostępu w nienaruszonej masie bukkalnej. W pobliżu nerwu bukkalnego 2 użyj pęsety hakowatej, aby unieść jedno lub dwa pasma mięśnia I2, i użyj drugiej pęsety, aby pomóc oddzielić je od reszty mięśnia. Oddzielona część I2 powinna mieć grubość podobną do nerwu bukkalnego 2 lub 3. Uważaj, aby nie oddzielić zbyt dużo (co może doprowadzić do denrwacji mięśnia). Przymocuj elektrodę hakową tą samą procedurą, która była stosowana dla nerwu radularnego.
14. Kolejną elektrodą do przymocowania jest elektroda dla gałęzi a nerwu bukkalnego 2. Gałąź ta może być stymulowana elektrycznie w celu wywołania programów ruchowych⁹. Zanim nerw bukkalny 2 przejdzie pod mięśniem I1 w bruzdzie bocznej, nerw rozdziela się na trzy części; gałąź a jest pierwszą odchodzącą gałęzią. Gałęzie są dość małe, dlatego mocowanie elektrody należy przeprowadzić ostrożnie. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą mocowania elektrody.
15. Nerwy bukkalne 2 i 3 są łatwo dostępne. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, mocując elektrody mniej więcej w połowie drogi między zwojem bukkalnym a bruzdą boczną.
16. Aby pomóc w rozróżnieniu neuronów o projekcjach jednostronnych i obustronnych, warto również przymocować elektrody do nerwów bukkalnych 2 i 3 po drugiej stronie masy bukkalnej, a także do gałęzi a nerwu bukkalnego 2, ponieważ niektóre neurony różnie reagują na stymulację ipsilateralną i kontralateralną BN2-a.

6. Pozycjonowanie zwoju i ścieńczenie osłonki

1. Masę bukkalną należy przenieść do okrągłej szalki Pyrex o wymiarach 100 x 50 mm opisanej w sekcji 2. Patrz Rysunek 1.
2. Nanieś cienką warstwę smaru próżniowego na wcięcie między komorą mózgową a bukkalną, używając końcówki pipety do nabrania grudki smaru próżniowego i rozprowadzenia jej na wcięciu. Stwierdzono, że smar próżniowy lepiej minimalizuje wycieki niż wazelina. Wypełnij przednią komorę roztworem soli fizjologicznej dla Aplysia. Ostrożnie przenieś masę bukkalną z szalki Petriego do przedniej komory tej większej szalki, upewniając się, że żadna z elektrod nie jest zbyt mocno naciągnięta, co mogłoby doprowadzić do przerwania nerwów.
3. Jeśli szalka musi zostać przeniesiona pod inny mikroskop stereoskopowy w celu cieńszenia osłonki, należy zachować szczególną ostrożność przy elektrodach hakowych. Pogrupuj elektrody znajdujące się po jednej stronie masy bukkalnej, a następnie pogrupuj elektrody po drugiej stronie masy bukkalnej. Ostrożnie trzymaj elektrody, chwytając taśmę laboratoryjną zakrywającą piny złączy, ponownie upewniając się, że żadna z elektrod nie jest zbyt mocno naciągnięta.
4. Gdy szalka zostanie ustawiona pod mikroskopem, elektrody powinny delikatnie opadać po bokach szalki i spoczywać na platformie obok niej.
5. Podczas przerw i pomiędzy etapami eksperymentu napowietrzaj roztwór soli w komorze masy bukkalnej za pomocą kamienia napowietrzającego do akwariów.
6. Przypnij ganglion mózgowy z tyłu, tak aby konektywy mózgowo-bukkalne (CBCs) przechodziły przez wcięcie. Nanieś więcej smaru próżniowego na CBCs, a następnie dodaj więcej roztworu soli dla Aplysia do obu części szalki, aby zwoje były całkowicie zanurzone. Upewnij się, że ilość dodanego smaru próżniowego znajduje się powyżej poziomu soli w komorze mózgowej lub bukkalnej, aby zapobiec wyciekom między komorami. Na tym etapie masa bukkalna powinna spoczywać na dnie przedniej komory, aby nie oddziaływać zbyt silnie na nerwy i zwoje.
7. Przypnij zwoje bukkalne do środkowej platformy. Aby uniknąć uszkodzenia nerwów, które są wciąż przyczepione do masy bukkalnej, umieszczaj piny wyłącznie na osłonce między dwoma nerwami. Dodaj dwa kolejne piny po stronie CBCs, aby je rozciągnąć i zakotwiczyć.
8. Utrzymuj zwoje bukkalne w pozycji płaskiej lub obróconej, w zależności od lokalizacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania. Aby obrócić ganglion bukkalny, użyj precyzyjnej pęsety, aby chwycić nadmiar osłonki CBC i przypiąć go między nerwami bukkalnymi 2 i 3. Dzięki temu widoczne będą większość ciał komórkowych znajdujących się blisko tylnej komory, do których nie można łatwo dotrzeć od góry ganglionu bukkalnego. Na koniec dodaj dwa piny na osłonce ganglionu bukkalnego po stronie masy bukkalnej, aby zminimalizować ruch ganglionu bukkalnego. Patrz Rysunek 4.
9. Użyj precyzyjnej pęsety, aby chwycić osłonkę ganglionu bukkalnego w pobliżu tylnej komory, a następnie odetnij nadmiar osłonki precyzyjnymi nożyczkami, nie odsłaniając ciał komórkowych. Aby zminimalizować uszkodzenia, usuń tylko taką ilość osłonki, jaka jest niezbędna do zobaczenia ciał komórkowych.

7. Stymulacja i rejestracja

1. Po zakończeniu procesu ścieńczenia osłonki, podłącz wszystkie piny elektrod do gniazd w kablach łączących się z wzmacniaczami. Ponownie upewnij się, że elektrody nie są zbyt mocno naciągnięte podczas wykonywania tej czynności. Sprawdź, czy elektrody są prawidłowo podłączone do odpowiednich kabli i czy polaryzacje są prawidłowe.
2. Aby wypłukać pozostałości chlorku magnezu, zastąp sól fizjologiczną dla Aplysia w komorze masy bukkalnej świeżą solą fizjologiczną dla Aplysia.
3. Przewlecz jedwabną nić chirurgiczną przez tkankę miękką z przodu masy bukkalnej, przedgrzbietowo względem chrząstki żuchwy, i użyj dwóch kawałków plasteliny, aby przymocować nić do krawędzi naczynia, zawieszając w ten sposób masę bukkalną za jej koniec przedni. Należy pamiętać, że koniec tylny jest utrzymywany przez nerwy bukkalne przyłączone do zwojów bukkalnych.
4. Ustaw manipulator trzymający szklaną elektrodę zewnątrzkomórkową tak, aby końcówka elektrody znajdowała się w pobliżu zwoju bukkalnego.
5. Aby zlokalizować i zidentyfikować neuron, użyj manipulatora, aby delikatnie docisnąć końcówkę elektrody zewnątrzkomórkowej do osłonki nad somą neuronu (Rysunek 5). Przyłóż prąd stymulujący, a następnie przełącz używany do pobudzania somy kanał w tryb rejestracji, aby zapisać aktywność na elektrodzie zewnątrzkomórkowej i odpowiadającą jej aktywność na nerwach (Rysunek 6). W celu identyfikacji neuronów pomóż sobie opublikowanymi mapami zwojów i opisami neuronów, w tym projekcjami nerwowymi i unerwieniem mięśni (np. ^7,8).
6. Do rejestracji wideo programów żerowania ustaw lustro z boku naczynia tak, aby widoki przedni i boczny masy bukkalnej były widoczne jednocześnie (schematyczne rozmieszczenie lustra przedstawiono na Rysunku 1). Ustaw kamerę wideo tak, aby oba widoki znajdowały się w jej polu widzenia.
7. Rejestrację wideo i elektrofizjologiczną można zsynchronizować, wysyłając impuls TTL zarówno do elektronicznego timera w polu widzenia kamery, jak i do kanału w AxoGraph, programie komputerowym służącym do zapisu i analizy danych elektrofizjologicznych. Impuls ten wyznacza punkt czasowy, który jest identyczny w zapisach AxoGraph i wideo, na podstawie czego można zsynchronizować pliki.
8. Po zlokalizowaniu neuronu można rejestrować jego aktywność podczas różnych zachowań przypominających żerowanie, które można wywołać zgodnie z poniższym opisem.
9. Aby wywołać programy motoryczne przypominające odrzucanie, stymuluj BN2-a długą serią impulsów o częstotliwości 2 Hz i czasie trwania 1 msec⁹ (nasze doświadczenie wskazuje, że taka stymulacja niezawodnie generuje wzorce egestywne w tych warunkach). Wzorce trwają przez cały czas stymulacji i mogą utrzymywać się jeszcze przez krótką chwilę po jej zakończeniu.
10. Aby wywołać programy motoryczne przypominające gryzienie¹², umieść kilka kryształków stałego karbacholu bezpośrednio na zwoju mózgowym. Alternatywnie, jeśli konieczny jest kontrolowany poziom ekspozycji na karbachol, użyj roztworu karbacholu w stężeniu od 1 do 10 mM w soli fizjologicznej dla Aplysia. Wyższe stężenia z większym prawdopodobieństwem wywołają odpowiedzi. Wzorce repetytywne zazwyczaj rozpoczynają się w ciągu 5 min i trwają około 10 do 15 min przed stopniowym wygasaniem.
11. Aby wywołać programy motoryczne przypominające połykanie¹³, podaj karbachol i poczekaj, aż masa bukkalna wygeneruje silne gryzienia. Następnie, podczas gryzienia, umieść pasek wodorostów (suszonej nori) w pysku zwierzęcia tak, aby radula chwyciła wodorosty (Rysunek 7). Paski mają zazwyczaj szerokość 0,5 cm i długość 5 cm.
12. Po pierwszej serii wzorców wywołanych karbacholem często możliwe jest uzyskanie dodatkowych odpowiedzi na karbachol. Dokładnie wypłucz sól fizjologiczną dla Aplysia w komorze zwoju mózgowego, usuwając i zastępując sól co najmniej trzy razy. Odczekaj co najmniej 20 min przed ponownym podaniem karbacholu. Odczekanie do 40 min może przynieść bardziej wiarygodne wyniki.

Obecnie w Stanach Zjednoczonych bezkręgowce nie wymagają formalnej zgody instytucjonalnej komisji ds. korzystania i opieki nad zwierzętami. Zapewniliśmy jednak, że wszystkie zabiegi przeprowadzane na Aplysia minimalizują krzywdę i cierpienie zwierzęcia, a wszystkie sekcje są wykonywane w pełnej anestezji.

Wyniki

Gdy elektroda zewnątrzkomórkowa zostanie umieszczona nad somą neuronu i użyta do jego stymulacji, można zaobserwować一一 correspondence między impulsami w kanale somy a impulsami w nerwach, do których neuron ten rzutuje (Rysunek 6, panel lewy, stymulacja zidentyfikowanego neuronu B9). Kanał somy (kanał górny) zostaje przełączony w tryb stymulacji w momencie przyłożenia prądu (czas 1 na rysunku), a następnie szybko przełączony w tryb rejestracji (czas 2). Dzięki zachowaniu pozycji elektrody można rejestrowa...

Dyskusja

Wcześniejsze prace scharakteryzowały programy motoryczne Aplysia u nienaruszonego zwierzęcia oraz w preparatach zredukowanych, takich jak izolowane zwoje. U nienaruszonego zwierzęcia, mimo że uzyskano zapisy z pojedynczych neuronów⁵, tego typu eksperymenty są bardzo trudne, a elektrody nie mogą być przenoszone z neuronu na neuron podczas karmienia. W izolowanych zwojach nie można obserwować ruchów karmienia indukowanych przez aktywność neuronalną. Preparat zawieszonej masy gwałkowej wypełnia lukę międ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S671	Biologiczny, certyfikowany
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P217	Certyfikowany ACS
Sześciowodny chlorek magnezu	Acros Organics	19753	99%
Siedmiowodny siarczan magnezu	Fisher Scientific	M63	Certyfikowany ACS
Dwuwodny chlorek wapnia	Fisher Scientifc	C79	Certyfikowany ACS
Glukoza (dekstroza)	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
Bufor MOPS	Acros Organics	17263	99%
Karbachol	Acros Organics	10824	99%
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	SS255	Certyfikowany
Kwas solny	Fisher Scientific	SA49	Certyfikowany
Jednotubowa kapilara szklana	A-M Systems	6150
Wytwornica mikropipet Flaming-Brown model P-80/PC	Sutter Instruments		Użyty żarnik: FT345B
Drut ze stali nierdzewnej w powłoce emaliowej	California Fine Wire		0.001D, powłoka h
Domowy klej silikonowy Silicone II	GE
Superklej Duro Quick-Gel	Henkel corp.
Wzmacniacz A-M Systems model 1700	A-M Systems		Ustawienia filtrów: 300-500 Hz nerwy, 10-500 Hz mięsień I2
Wielokanałowy stymulator Pulsemaster	World Precision Instruments	A300
Izolator bodźca	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
Licznik sumujący Veeder-Root	Danaher	C342-0562
Złote piny łącznikowe	Bulgin	SA3148/1
Złote gniazda łącznikowe	Bulgin	SA3149/1
Elastomer silikonowy Sylgard 184	Dow Corning
Szalka krystalizacyjna 100 x 50 mm	Pyrex
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning
końcówki do pipet	Fisher Scientific	21-375D
Piny Minutien	Fine Science Tools	26002-10
Plastelina modelarska	Sargent Art	22-4400
Szwy jedwabne	Ethicon	K89OH
Cicha pompa powietrzna Whisper	Tetra	77849
Przewód akwariowy	Eheim	7783	12/16 mm
Kamień napowietrzający Elite Airstone	Hagen	A962
Nożyczki sprężynowe Vannasa	Fine Science Tools	15000-08
Precyzyjna pęseta Dumont #5	Fine Science Tools	11254-20
Wodorosty Yaki Sushi Nori	Rhee Bros
Ręczniki Kimwipes	Kimberly-Clark	34155