Artykuł metodologiczny

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4321

⸱

10 października 2012

 ,  , 
1Department of Medicine, Baylor College of Medicine , 2Division of Diabetes, Endocrinology & Metabolism, Diabetes & Endocrinology Research Center, Baylor College of Medicine , 3Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Streszczenie

Cukrzyca typu 1 jest spowodowana autoimmunologicznym zniszczeniem komórek produkujących insulinę w trzustce, zapośredniczonym przez limfocyty T. Do chwili obecnej podstawową terapią pozostaje zastępcza podaż insuliny, ponieważ transplantacja wysepek była ograniczona dostępnością dawców oraz koniecznością długotrwałej immunosupresji. Indukowana neogeneza wysepek poprzez transfer genów Neurogeniny 3 (Ngn3), specyficznego czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wysepek, oraz Betacelluliny (Btc), czynnika wzrostu wysepek, ma potencjał do wyleczenia cukrzycy typu 1.

Wektory adenowirusowe (Ads) są wysoce wydajnymi wektorami do transferu genów; jednak wczesne generacje Ads wykazują szereg wad w zastosowaniach in vivo. Wektory HDAds (helper-dependent Ads) to najbardziej zaawansowane wektory Ad, opracowane w celu poprawy profilu bezpieczeństwa wczesnych generacji Ads oraz przedłużenia ekspresji transgenu1. Charakteryzują się one brakiem toksyczności przewlekłej, ponieważ nie zawierają wirusowych sekwencji kodujących2-5, a zachowują jedynie elementy cis Ad niezbędne do replikacji i pakowania wektora. Pozwala to na klonowanie genów o wielkości do 36 kb.

W niniejszym protokole opisujemy metodę generowania HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc oraz wprowadzania tych wektorów do myszy z cukrzycą indukowaną STZ. Nasze wyniki pokazują, że jednoczesna iniekcja HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc indukuje powstawanie „neo-wysepek” w wątrobie i odwraca hiperglikemię u myszy z cukrzycą.

Protokół

1. Klonowanie genów terapeutycznych do wektora transportowego HDAd

  1. Klonuj cDNA mysiego Ngn3 oraz Btc do wektora plazmidowego pLPBL1 zawierającego wszechobecny promotor czynnika elongacyjnego-1 (BOS) oraz sygnał poli A. Po zakończeniu zweryfikuj wektory poprzez analizę sekwencji, a następnie podklonuj te kasety ekspresyjne do plazmidu transportowego pΔ28 HDAd6.
  2. Przetraw wektory transportowe HDAd enzymem PmeI w celu uwolnienia szkieletu plazmidu, oczyść DNA poprzez ekstrakcję fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie wytrącanie etanolem i zrekonstytuuj w wodzie o jakości do transfekcji.

2. Produkcja pomocniczo-zależnych wektorów adenowirusowych

Produkcja wektora HDAd obejmuje wiele etapów, których należy ściśle przestrzegać, aby uzyskać optymalne wyniki.

2.1 Transfekcja

  1. Na dwa dni przed transfekcją wysiać komórki 1167 do szalki 6-cm, aby w dniu transfekcji osiągnęły 70-80% konfluencji.
  2. Na trzy godziny przed transfekcją usunąć medium i dodać 5 ml świeżego medium wzrostowego [MEM uzupełniony o 10% FBS i 1% PSG (penicylina, streptomycyna i glutamina), Invitrogen].
  3. Przeprowadzić transfekcję komórek 116 z użyciem 10 μg DNA z kroku 1.2), stosując zestaw ProFectionR Mammalian Transfection firmy Promega zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Następnego dnia przemyć komórki 1 ml medium wzrostowego 2 razy. Dodać wirus pomocniczy (HV) w dawce 500 cząsteczek wektora (vp) /komórkę do 0,1 ml PBS zawierającego wapń i magnez (PBS++) i nanieść na komórki. Delikatnie kołysać szalkami co 10 min, aby równomiernie rozprowadzić HV.
  5. Po 60 min dodać 1,5 ml medium podtrzymującego (MEM, 5% FBS, 1% PSG).
  6. Następnego dnia dodać kolejne 1 ml medium podtrzymującego.
  7. Obserwować komórki pod kątem wystąpienia CPE (efekt cytopatyczny – komórki stają się okrągłe i odklejają się). Więcej niż 80% komórek powinno wykazywać CPE 2 dni po infekcji.
  8. Zebrać surowy lizat komórkowy (CVL, komórki i medium), dodać 10% objętości 40% sacharozy i przechowywać w temperaturze -80 °C. CVL zostaje oznaczony jako pasaż 0 (CVL-P0).

2.2 Amplifikacja wektora

  1. Zamrozić (-80 °C, 3-5 min) i rozmrozić (37 °C, 1-2 min) 3 razy.
  2. Nanieść 0,5 ml CVL uzupełnionego o HV w dawce 200 vp/cell na konfluentne komórki 116 w szalce 6-cm, a następnie delikatnie kołysać szalką co 5 min. Po 30 min dodać 1 ml pożywki podtrzymującej.
  3. Następnego dnia dodać 1 ml pożywki podtrzymującej. Po 2 dniach większość komórek powinna wykazywać CPE.
  4. Zebrać CVL i przechowywać w -80 °C (CVL-P1) zgodnie z opisem w kroku 2.1.8).
  5. Powtórzyć procedurę 3 razy, aby uzyskać CVL P2-P4.
  6. Wyekstrahować DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) z 0,2 ml CVL zebranego w fazach P1-P4 i przeanalizować amplifikację wektora za pomocą qPCR, stosując primery specyficzne dla HV i HDAd (Tabela 1). Do dalszych etapów procedury wykorzystać pasaż, w którym HDAd uległ amplifikacji wykładniczej w stosunku do HV (P3 na Rysunku 2).
  7. Współzakazić 90% konfluentne komórki 116 w szalce 15-cm przy użyciu 0,5 ml CVL oraz HV w dawce 200 vp/cell. Delikatnie kołysać szalką co 5 min. Po 30 min dodać 10 ml pożywki podtrzymującej.
  8. Po 24 h dodać 5 ml pożywki podtrzymującej.
  9. Zebrać komórki przez wirowanie przy 1,500 x g przez 5 min dokładnie 48 h po zakażeniu.
  10. Resuspender komórki w 1 ml PBS++ zawierającego 4% sacharozy (P5) i zamrozić w -80 °C.

2.3 Produkcja HDAd na dużą skalę

  1. Aby przygotować komórki 116 do infekcji w hodowli zawiesinowej, przenieś konfluentne komórki 116 z 8 szalek 15-cm do kolby spinnera o pojemności 3 L, dodaj pożywkę do wzrostu w zawiesinie (modyfikowane MEM Joklik uzupełnione o 5% FBS, 0,1 mg/ml hygromycyny i 1% PSG) do końcowej objętości 1 L i inkubuj w inkubatorze CO2 przy obrotach 60 rpm8.
  2. Codziennie przez 2 dni dodawaj 0,5 L świeżej pożywki (łącznie 2 L).
  3. Policz komórki trzeciego dnia. Komórki są gotowe do użycia po osiągnięciu całkowitej liczby 1x109.
  4. Zamroź i rozmroź P5 3 razy.
  5. Zbierz komórki z kolby spinnera 3 L poprzez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min. Zachowaj 100 ml supernatantu do ponownego zawieszenia komórek.
  6. Przenieś komórki do kolby spinnera o pojemności 250 ml. Dodaj do komórek P5 oraz HV w ilości 200 vp/cell i inkubuj przez 1 hr w 37 °C przy 60 rpm.
  7. Przenieś komórki wraz z pożywką do kolby spinnera 3 L, dodaj 2 L pożywki do wzrostu w zawiesinie. Przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do dołka płytki 12-dołkowej, aby obserwować komórki pod kątem CPE.
  8. Inkubuj komórki w kolbie spinnera przez 2 dni w inkubatorze CO2 przy 60 rpm.
  9. Zbierz komórki przez wirowanie i zawieś ponownie w 15 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), a następnie przechowuj w -80 °C (P6) do czasu puryfikacji.

2.4 Oczyszczanie wektora

  1. Do P6 dodać 1,0 ml 5% dejksykolanu sodu. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 400 μl 2 M MgCl2, 300 μl RNazy A (10 mg/ml) oraz 300 μl DNazy I (10 mg/ml) i inkubować w 37 °C przez 1 h.
  3. Wirować przy 6 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej w celu zebrania nadsączu.
  4. probówki do ultrawirowania NVT 65 (Beckman) wysterylizować pod światłem UV przez 1 h w komorze do hodowli tkanek.
  5. Dodać 2,8 ml roztworu CsCl o niskiej gęstości (1,25 g/ml), podłożyć 2,8 ml roztworu CsCl o wysokiej gęstości (1,41 g/ml), a następnie nałożyć na wierzch 5-6 ml nadsączu, aby wypełnić probówkę do szyjki. W razie potrzeby dopełnić probówkę 100 mM Tris-HCl (pH 8,0).
  6. Wirować w 10 °C przez 30 min przy 50 000 rpm w 10 °C w wirówce Beckman LE-80K z użyciem rotora NVT-65.
  7. Przetrzeć obszar nakłucia igłą 70% etanolem i zebrać dolny opalizujący prążek za pomocą strzykawki 3-ml z igłą 22-G poprzez nakłucie boczne (Rysunek 3a). Czasami poniżej wyraźniejszego prążka wektora można dostrzec bardzo słaby prążek pomocniczy. Należy starać się pobrać jak najwięcej prążka wektora, unikając prążka pomocniczego. Na tym etapie dopuszczalne jest zasysanie części prążka pomocniczego, ponieważ zostanie on oddzielony podczas następnego wirowania nocnego.
  8. Zebrane prążki przenieść do nowych, wysterylizowanych probówek do ultrawirowania. Wypełnić probówki do szyjki, nakładając na wierzch roztwór CsCl o gęstości 1,35 g/ml.
  9. Wirować w 10 °C przy 50 000 rpm przez noc. Zebrać opalizujący prążek (Rysunek 3b).
  10. Przenieść prążek do kasety dializacyjnej (Slide-a-Lyzer, 10 000 MWCO, Thermo-scientific).
  11. Dializować przeciwko 3 L autoklawowanego 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 zawierającego 2 mM MgCl2 i 4% sacharozy w 4 °C przez noc.
  12. Wyjąć wektor HDAd z kasety dializacyjnej. Odmierzyć aliquoty 20 μl do oznaczenia miana fizycznego i 50 μl do charakterystyki DNA. (Uwaga: W przypadku wektora Ngn3 powtórzyć etap „P6” trzykrotnie, aby uzyskać wystarczającą ilość wektora, ponieważ wydajność HDAd-Ngn3 jest niska w porównaniu z HDAd-Btc lub HDAd-empty).

2.5 Charakterystyka wektorów HDAd

  1. Wyznacz miano fizyczne (vp/ml) za pomocą gęstości optycznej (OD). Dodaj 20 μl wektora lub 20 μl buforu do dializy do 380 μl buforu TE zawierającego 0.1% SDS i inkubuj w 56 °C przez 20 min. Zmierz OD przy 260 nm. Miano fizyczne = OD260 x 1.1 x 1012 x 20 (vp/ml).
  2. Przeanalizuj zanieczyszczenie HV za pomocą qPCR. Wykorzystaj alikwot 50μl do ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA z tkanek/krwi DNeasy (Qiagen). Rozcieńcz DNA 1000-krotnie i pobierz 5 μl do analizy qPCR przy użyciu starterów specyficznych dla helpera i wektora (Table 1). Zanieczyszczenie helperem powinno wynosić mniej niż 1%, co pokazano na Figure 4A.
  3. Użyj metody Southern blot do analizy struktury wektora. Przeprowadź analizę Southern blot10 przy użyciu sondy dla odwróconych powtórzeń końcowych (ITR). Reprezentatywny wynik przedstawiono na Figure 4B.
  4. Określ skuteczność in vitro. Zainfekuj znaną liczbę komórek 116 w płytce 12-dołkowej wektorem HDAd w dawce 1000 vp/cell w czterech powtórzeniach. Zbierz komórki po 48 hr i wyekstrahuj RNA, aby określić ekspresję mRNA Ngn3 i Btc za pomocą qRT-PCR (Table 1). Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Figure 5.

3. Leczenie myszy z cukrzycą za pomocą HDAd-Ngn3 i -Btc

3.1 Indukcja cukrzycy u myszy i iniekcja wektorów HDAd

  1. Przygotowanie STZ: Przygotować bufor cytrynianowy 0,1 M i dostosować pH do poziomu 4,3-4,5. Przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,22 mm. Za pomocą sterylnej wody rozcieńczyć go do uzyskania 0,01 M cytrynianu sodu o pH 4,2-4,5. W tym roztworze rozpuścić odpowiednią ilość STZ (Sigma), aby uzyskać końcowe stężenie 12,5 mg/ml. Przy tym stężeniu nie występuje wytrącanie osadu. Przechowywać ten roztwór STZ w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Bezpośrednio przed iniekcją doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej. Roztwór STZ należy przygotowywać na świeżo każdego dnia i wstrzyknąć w ciągu 5-10 min od rozpuszczenia.
  2. Wstrzyknąć ten roztwór STZ doprzewnowłocznościowo (10 μl/gm, aby uzyskać dawkę 125 μg/g masy ciała), wieczorem między godziną 17:00 a 19:00 (przed wygaszeniem świateł w pomieszczeniu dla myszy i rozpoczęciem przez nie aktywnego żerowania), przez dwa kolejne dni9.

3.2 Monitorowanie poziomu glukozy u myszy i iniekcja wektorów HDAd.

  1. Poddać myszy 6-godzinnemu postowi, a następnie co tydzień mierzyć masę ciała oraz poziom glukozy we krwi, aż do wystąpienia hiperglikemii (≥250mg/dl). Do pomiaru glukozy we krwi pobranej z nacięcia ogona należy użyć glukometru One Touch. Po uzyskaniu poziomu glukozy we krwi ≥250 mg/dl, ponownie sprawdzić poziom glukozy po 48 h po 6-godzinnym postu, aby potwierdzić trwałą hiperglikemię i upewnić się, że poziom glukozy mieści się w docelowym zakresie terapeutycznym: 250-500 mg/dl.
  2. Myszy z trwałą hiperglikemią traktować pojedynczą iniekcją dożylną wektorów HDAd przez żyłę ogonową. Całkowita dawka wektora dla wszystkich grup badawczych wynosi 6x1011 vp (w 0,25 ml): 5x1011 vp Ngn3 + 1x1011 vp Btc dla grupy kombinowanej; 5x1011 vp Ngn3 + 1x1011 vp dla grupy Ngn3; 1x1011 vp Btc + 5x1011 vp pustego wektora dla grupy Btc oraz 6x1011 vp pustego wektora dla grupy kontrolnej.
  3. Iniekcja dożylna w ogon. Umieścić myszy w stabilizatorze Tailveiner (TV-150, Braintree Scientific Inc.) i użyć ciepłej wody w celu rozszerzenia żył ogonowych, a następnie oczyścić ogon 70% alkoholem. Przytrzymać ogon poniżej miejsca wstrzyknięcia kciukiem i palcem wskazującym jednej ręki, a drugą ręką wykonać iniekcję. Przed wstrzyknięciem upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza (używając igły 301/2G i strzykawki 1 ml). Wprowadzić igłę i powoli wstrzyknąć wektor. Jeśli igła znajduje się w żyle, w nasadzie igły może pojawić się błysk krwi, a podczas wstrzykiwania nie występuje opór. Po wyjęciu igły przycisnąć miejsce wstrzyknięcia gazikiem, aby zatamować krwawienie, przed umieszczeniem myszy z powrotem w klatce.
    Jeśli igła nie znajduje się w żyle, wystąpi znaczny opór podczas wstrzykiwania i pojawi się niewielka grudka podskórna. W takim przypadku należy wyjąć igłę i spróbować ponownie w innym miejscu.

3.3 Analiza efektów leczenia HDAd-Ngn3+HDAd-Btc.

  1. Co tydzień po podaniu wektora monitoruj poziom glukozy po 6 h głodzenia oraz masę ciała.
  2. Co 2 tygodnie pobieraj krew z żyły saphhenous lub żyły ogonowej w nodze, aby za pomocą komercyjnych zestawów oznaczyć poziom insuliny (Mouse Insulin ELISA kit, Mercodia) oraz enzymów wątrobowych (AST i ALT Infinity Reagents, Thermo Scientific).
    1. Umieść mysz w otwartej probówce Falcon o pojemności 50 ml, w której zamknięty koniec posiada wykonane otwory.
    2. Głowa myszy powinna znajdować się przy zamkniętym końcu probówki, a nogi i ogon przy stronie otwartej. Aby pobrać krew z lewej nogi, wysuń lewą nogę poza probówkę i delikatnie uciśnij skórę uda kciukiem i palcem wskazującym, aby unieruchomić nogę.
    3. Użyj golarki, aby usunąć owłosienie z obszaru piszczeli/dolnej części nogi w celu odsłonięcia żyły saphhenous, która znajduje się po bocznej stronie dolnej części nogi. Oczyść ogoloną skórę 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia.
    4. Nakłuj żyłę saphhenous igłą 25 G. Pobierz krew do probówki Microvette CB300 (Sarstedt) i umieść probówki w lodzie.
    5. Przed powrotem myszy do klatek dociśnij miejsce nakłucia gazikiem, aby zatamować krwawienie.
    6. Wirowuj probówki z prędkością 3,000 x g przez 5 min, pobierz nadsącz i przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.

3.4 Przeprowadź test tolerancji glukozy (GTT) 6 tygodni po leczeniu.

  1. Rozpuścić D-glukozę (Sigma) w wodzie destylowanej, aby przygotować 15% roztwór glukozy (15 g / 100 ml), a następnie poddać go filtracji sterylnej.
  2. Poddać myszy 6-godzinnej głodówce. Użyć podgrzewaczki do ogrzania zwierząt i pobrać krew (punkt czasowy 0 min). Następnie wstrzyknąć D-glukozę w dawce 1,5 g/kg d.o. (10 μl /g 15% roztworu glukozy).
  3. Pobrać krew w odstępach 15, 30, 60 i 120 min.
  4. Oznaczyć poziom glukozy i insuliny we wszystkich pobranych próbkach.

3.5 Analiza tkanek w celu oceny ekspresji wektorów oraz oceny indukcji neogenezy wysepek.

We wszystkich tych etapach kontrole niezbędne do wiarygodnej interpretacji wyników obejmują: (1) myszy z cukrzycą traktowane pustym wektorem, (2) myszy bez cukrzycy oraz (3) trzustkę myszy bez cukrzycy służącą jako kontrola pozytywna dla ekspresji hormonów swoistych dla wysepek oraz czynników transkrypcyjnych.

  1. Pobrać wątrobę i trzustkę w 3. i 6. tygodniu po leczeniu. Podzielić każdy organ na 2 części: pierwszą do błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie i przechowywania w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji RNA i białek, a drugą do utrwalenia w 10% formalinie przez noc przed analizą immunohistochemiczną.
  2. Wyekstrahować RNA zgodnie ze standardowym protokołem i przeanalizować ekspresję hormonów specyficznych dla wysepek oraz czynników transkrypcyjnych, wraz z Ngn3 i Btc w celu potwierdzenia ekspresji wektora, w wątrobie metodą qRT-PCR przy użyciu specyficznych starterów9, 10.
  3. Wyekstrahować insulinę i c-peptyd z wątroby metodą ekstrakcji kwasowo-etanolowej i określić ich ilość za pomocą komercyjnych zestawów ELISA (ultra sensitive Insulin assay, Mercodia, C-peptide ELISA kit, Wako).
  4. Wykonać barwienie immunocytochemiczne na hormony specyficzne dla wysepek (insulina, glukagon, PP, SST) oraz specyficzne dla wysepek czynniki transkrypcyjne w skrawkach zatopionych w parafinie9, 10. Ekspresję Ngn3 i Btc można również potwierdzić za pomocą barwienia immunocytochemicznego.

4. Reprezentatywne wyniki

Klonowaliśmy cDNA Ngn3 oraz Btc do wektorów pΔ28 sterowanych przez powszechny promotor eIF2a (BOS), tworząc HDAd-Ngn3 oraz HDAd-Btc. Jak pokazano na Rysunku 2, względna kontaminacja HV znacząco spadła (co sugeruje większą amplifikację wektora i mniejszą amplifikację pomocnika) w pasażu 3. W związku z tym do dalszej produkcji wektora wykorzystaliśmy P3. Po pierwszej ultrawirowaniu w nieciągłym gradiencie CsCl zebraliśmy najniższy prążek wektora, a następnie, podczas drugiej ultrawirowki, zebraliśmy opalizujący prążek odpowiadający wektorowi HDAd (Rysunek 3). Oczyszczony wektor HDAd wykazywał mniej niż 1% kontaminacji HV (Rysunek 4A) w badaniu qPCR i nie wykazywał kontaminacji pomocnikiem w analizie southern blotting (Rysunek 4B), co wskazuje na wystarczającą jakość do infuzji wektora u myszy. Dalsza analiza obejmowała ekspresję transgenu poprzez zakażenie 116 komórek. Poziomy ekspresji mRNA dla Ngn3 i Btc były w komórkach zainfekowanych wektorem ponad 10 000 razy wyższe w porównaniu z komórkami niezainfekowanymi (Rysunek 5).

Następnie HDAd-Ngn3 oraz -Btc podano myszom z cukrzycą indukowaną STZ poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, przy czym myszy z wstrzykniętym pustym wektorem oraz myszy z wstrzykniętym HDAd-Btc służyły jako kontrola negatywna. Hiperglikemia została cofnięta, a glukozostymulowana sekrecja insuliny została przywrócona u myszy leczonych zarówno HDAd-Ngn3, jak i HDAd-Btc, natomiast nie zaobserwowano tego u myszy leczonych wektorem z pojedynczym genem lub kontrolnym pustym wektorem (Rysunek 6). Leczenie HDAd-Ngn3-Btc wywołało neogenezę wysepek, co określono ilościowo poprzez oznaczenie całkowitej zawartości insuliny i C-peptydu (Rysunek 6E), przyjmując w charakterze kontroli myszy niediabetyczne oraz myszy z cukrzycą leczone pustym wektorem. Obecność C-peptydu i insuliny w stosunku ekvimolarnym potwierdza, że insulina wykryta w wątrobie jest rzeczywiście w niej syntetyzowana. RT-qPCR potwierdził, że wątroba myszy leczonych HDAd-Ngn3-Btc wykazuje ekspresję wszystkich hormonów i czynników transkrypcyjnych specyficznych dla wysepek9. Immunohistochemia wykazała obecność komórek insulinowo-dodatnich w wątrobie myszy leczonych HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc, natomiast nie zaobserwowano komórek insulinowo-dodatnich u myszy leczonych wektorem kontrolnym (Rysunek 7). Potwierdziliśmy również brak pozostałości wysepek w trzustkach myszy leczonych Ngn3-Btc w porównaniu do licznych wysepek w trzustkach niediabetycznych. Ekspresję wektorów (Ngn3 i Btc) wraz ze specyficznymi dla linii wysepek czynnikami transkrypcyjnymi (Pdx-1 i Nkx6.1) oceniono również za pomocą immunobarwienia wątroby (Rysunek 7).

figure-protocol-1
Rycina 1. Schemat terapii genowej u myszy z cukrzycą z wykorzystaniem systemu wirusowego zależnego od wirusa pomocniczego (HDAd). Najpierw Ngn3 i Btc, w kasecie sterowanej przez powszechny promotor BOS, są klonowane do wektorów wahadłowych HDAd (pΔ28). HDAd jest produkowany w kilku etapach, obejmujących transfekcję, seryjne pasażowanie w celu amplifikacji oraz infekcję na dużą skalę, po której następuje oczyszczanie wektora. Po ocenie jakości, wektory HDAd są wstrzykiwane dożylnie do myszy z cukrzycą indukowaną STZ poprzez żyłę ogonową. Efekty leczenia są oceniane poprzez pomiar poziomu glukozy, masy ciała, test GTT oraz analizę ekspresji genów w wątrobie.

figure-protocol-2
Rycina 2. Wyznaczanie amplifikacji wektora HDAd. DNA jest ekstrahowane z pasaży od P0 do P4 przy użyciu zestawów do ekstrakcji DNA (Qiagen). DNA jest rozcieńczane 1000-krotnie, a 5μl DNA jest wykorzystywane do PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Stosuje się startery specyficzne dla wirusa pomocniczego i wektora. Krzywe wzorcowe są generowane poprzez rozcieńczenia szeregowe (od 10-5 do 1 ng/ml) plazmidu wektora wahadłowego HDAd oraz plazmidu HV (panele górne). Przy użyciu krzywych wzorcowych i wartości Ct obliczana jest liczba kopii wektora oraz wirusa pomocniczego, a stosunek HDAd/HV jest przedstawiony jako procent całkowitej ilości wirusa (pomocniczy + HDAd). Zatem względna amplifikacja wektora jest obliczana jako: [liczba kopii wektora / (liczba kopii wektora + wirusa pomocniczego)]. W przedstawionym przykładzie (panel dolny) amplifikacja wektora HDAd osiągnęła plateau w P4, podczas gdy względny stosunek HDAd/HV wzrastał w P3. W związku z tym do kolejnego etapu wybrano P3.

figure-protocol-3
Rycina 3. Reprezentatywne prążki wektora HDAd po nieciągłej ultracentryfugacji w gradiencie gęstości CsCl. Wektor HDAd jest oczyszczany z 3L hodowli w bioreaktorze typu spinner w sekwencyjnym gradiencie gęstości CsCl. (A) Po pierwszej ultracentryfugacji w gradiencie gęstości widoczny jest pojedynczy opalizujący prążek wektora (strzałka) poniżej nieprzezroczystych szczątków komórkowych (CD). Opalizujący prążek (strzałka) jest zbierany do drugiej centryfugacji w gradiencie gęstości. (B) Po drugiej ultracentryfugacji w gradiencie gęstości opalizujący prążek (strzałka) jest zbierany w celu przeprowadzenia dializy.

figure-protocol-4
Rycina 4. Analiza zanieczyszczenia wirusem pomocniczym. DNA jest ekstrahowane z 50μl oczyszczonego wirusa, a zanieczyszczenie pomocnicze jest oceniane jak w Rycynie 2. Rycina pokazuje, że zanieczyszczenie pomocnicze HDAd-Ngn3 oraz HDAd-Btc wynosi mniej niż 1%.

figure-protocol-5
Rycina 5. Analiza struktury wektora HDAd. Analiza Southern blot została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem (Oka K, et al.). Ścieżka 1: DNA z wirusa pomocniczego; Ścieżka 2: DNA z P3; Ścieżka 3: DNA z P4; Ścieżka 4: oczyszczony wektor. Otwarte strzałki wskazują prążki pochodzące z wirusa pomocniczego, a wypełnione strzałki wskazują prążki ITR pochodzące z wektora HDAd.

figure-protocol-6
Rycina 6. Poziom ekspresji Ngn3 lub Btc w komórkach 116 zainfekowanych wektorem HDAd-Ngn3 lub HDAd-Btc. Komórki 116 w płytkach 12-dołkowych zainfekowano wektorem HDAd-Ngn3, HDAd-Btc lub wektorem pustym w dawce 1000 vp/cell przez 2 dni. Komórki zebrano, a całkowite RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika Trizol. Przeprowadzono qRT-PCR z użyciem starterów specyficznych dla Ngn3 lub Btc. Względna ekspresja mRNA Ngn3 lub Btc wzrosła ponad 10 000-krotnie w komórkach zainfekowanych HDAd-Ngn3 lub HDAd-Btc. Rycina przedrukowana z Dev.Cell 2009 Mar; 16 (3) : 358-73; Yechoor et. al., za zgodą wydawnictwa Elsevier.

figure-protocol-7
Rysunek 7. Transfer genów HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc u myszy z cukrzycą indukowaną STZ prowadzi do odwrócenia cukrzycy i indukcji neogenezy wysepek w wątrobie. (A) Poziom glukozy w osoczu i (B) masa ciała myszy z cukrzycą indukowaną STZ leczonych HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc. (C) Poziom glukozy i insuliny w osoczu podczas IP-GTT w 6. tygodniu po leczeniu. (D) Reprezentatywne barwienie na insulinę w wątrobie 12 tygodni po leczeniu. *p<0.05 (w porównaniu z grupą z pustym wektorem). Rysunek przedrukowano z Dev. Cell 2009 Mar; 16 (3) : 358-73; Yechoor et al., za zgodą wydawnictwa Elsevier.

nazwastarter forwardstarter reverse
helperGACCATCAATCTTGACGACCATGTCGCTTTCCAGAACCC
wektorTTGGGCGTAACCGAGTAAGACTTCCTACCCATAAGCTCC
Ngn3AAGAGCGAGTTGGCACTCAGTCTGAGTCAGTGCCCAGATG
BtcGCACAGGTACCACCCCTAGATGAACACCACCATGACCACT

Tabela 1. Sekwencje starterów.

Dyskusja

Wektory HDAd zostały opracowane, aby wyeliminować wady wczesnych generacji Ad i wykorzystać je w zastosowaniach terapii genowej. Pozostają jednak wyzwania techniczne. Na przykład HDAd wymaga HV do pakowania, a amplifikacja wektora nie jest tak wydajna jak w przypadku wczesnych generacji Ad. HV jest wirusem Ad pierwszej generacji i jakiekolwiek zanieczyszczenie HV obniża skuteczność HDAd. Dlatego kluczowe są wysoce wydajna transfekcja oraz optymalne warunki dla każdego kolejnego pasażu. Innym krytycznym parametrem w produkcji wektora jest wybór pasażu (P1-P4), który powinien zostać użyty do następnego pasażu 5, wykorzystywanego bezpośrednio jako inokulum dla komórek w zawiesinie. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsze rezultaty uzyskuje się, stosując pasaż, w którym proporcja wektora HDAd gwałtownie wzrasta w kolejnym pasażu (P3 na Rysunku 2). Wydajność wektorów HDAd zależy od kaset transgenów. Podczas produkcji wektora oba transgeny są ekspresjonowane, ponieważ oba geny znajdują się pod promotorem powszechnym. Ngn3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, a Btc czynnikiem wzrostu, co sugeruje, że wektor HDAd ekspresjonujący czynnik transkrypcyjny, który może wpływać na linię komórkową, hamuje amplifikację wektora, podczas gdy wektor ekspresjonujący hormon wzrostu wspomaga replikację i pakowanie wektora.

W obliczu epidemii cukrzycy niezbędne jest opracowanie nowych metod przywracania masy komórek $\beta$. W niniejszym raporcie opisujemy metody wykorzystania zalet wektorów HDAd w celu transferu genu czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wyspkową, Ngn3, wraz z czynnikiem wzrostu wyspkowych komórek $\beta$, betacelluliną, aby indukować neogenezę wysepek w obszarach okołoportalnych wątroby. Aby ocenić skuteczność tego procesu, ważne jest wybranie myszy ze stabilną hiperglikemią oraz zapewnienie stałego uwzględnienia odpowiednich grup kontrolnych. W eksperymentach z transferem genów należy zawsze wykorzystywać myszy z cukrzycą traktowane pustym wektorem. Ponadto zastosowanie myszy z cukrzycą traktowanych oddzielnie HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc pozwala przetestować indywidualny wkład tych dwóch genów w neogenezę wysepek. Nasze dane wykazują, że sam Ngn3 jest wystarczający do indukcji neogenezy wysepek, jednak dodatek czynnika wzrostu Btc potęguje odpowiedź, prowadząc do silnej indukcji neogenezy wysepek. Ważne jest również potwierdzenie, że ekspresja wektora została rzeczywiście osiągnięta w tkance docelowej, czyli w wątrobie, a także wykazanie, że insulina oznaczona w osoczu traktowanych myszy nie pochodzi z resztkowych wysepek w trzustce, poprzez udowodnienie braku wysepek trzustkowych u myszy z cukrzycą.

Podsumowując, zaleta systemu wektorów HDAd w transferze genów polega na wysokiej pojemności klonowania, wydajnej transdukcji i długotrwałej ekspresji genów w wątrobie przy minimalnej toksyczności przewlekłej, a także na braku integracji genomu wektora z chromosomem gospodarza. Głównymi ograniczeniami są złożone etapy jego generowania, a zastosowania in vivo ograniczają się przede wszystkim do wątroby przy użyciu najpopularniejszego serotypu Ad 5. Neogeneza wysepek, prowadząca do pełnego przywrócenia poziomu insuliny w osoczu i tolerancji glukozy u myszy z cukrzycą, może zostać wywołana w wątrobie poprzez transfer genów czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wysepek, Ngn3, wraz z czynnikiem wzrostu wysepek, betacelluliną. W niniejszym raporcie przedstawiamy optymalny protokół generowania wysokiej jakości HDAd-Ngn3 oraz HDAd-Btc i prezentujemy techniki indukcji oraz oceny neogenezy wysepek w wątrobach myszy z cukrzycą w celu odwrócenia hiperglikemii.

Przypis: Wektory wirusowe oraz linie komórkowe opisane w niniejszym materiale są dostępne w Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine (http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731). Dostępne są również niektóre komercyjne zestawy do generowania wirusów HDAd (np. Microbix biosystems Inc.).

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty z NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY); Centrum Badań nad Cukrzycą i Endokrynologią (DERC - P30DK079638) w Baylor College of Medicine, grant pilotażowy i wykonalności z DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zestaw do transfekcji komórek ssaków ProFectionRPromegaE1200
DNeasy Blood &zestaw do izolacji tkanek (50)Qiagen69504
PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROXQuanta Biosciences95055-500
Deoksycholan soduSigmaD6750-25G
proszek MEMInvitrogen61100087
penicylina streptomycynaSigma15140122
FBSAtlanta BiologicalsS11150
L-glutaminaInvitrogen25030-081
Hygromycyna BSigmaH0654-1G
MEM EAGLE JOKLIKSigmaM0518-10L
RNazaRoche10109169001
DNaza I, stopień IIRoche10104159001
StreptozotocynaSigmas0130
Szklane kolby z mieszadłemCorning4500-3L
Szklane kolby z mieszadłem (spinner flasks)Corning4500-250
Kaseta Slide A-lyzerPIERCE CHPI66380
Probówka Optiseal polyallomer, 11,2 mlBeckman Coulter362181
Chlorek cezu 1 kgJT4042-2VWR
Beckman LE-80KBeckman CoulterOptymalna ultrawirówka LE-80K
FiltrujVWR28143-338
probówka wirówkowa 500 mlCorning431123
stabilizator do iniekcji dożylnych w ogonBraintree Scientific, Inc.tv-150
ELISA insuliny, myszMercodia10-1247-01
microvette CB300Sarstedt16.443.100
D-glukozaSigmaG8270
Zestaw ELISA do oznaczania C-peptydu mysiegoWako Pure Chemical Industries, Ltd#631-07231
przeciwciało przeciwinsulinowe świnki morskiejAbcamab7842
przeciwciało kozie przeciwko Pdx1prezent od dr. Christophera Wrighta
przeciwciało mysie przeciwko Ngn3Konsorcjum Biologii Komórek Beta,
Uniwersytet Pensylwanii		AB2013
przeciwciało mysie przeciwko Nkx6.1Beta Cell Biology Consortium,
Uniwersytet Pensylwanii		F64A6B4
przeciwciało przeciwko betacellulinieNauki o komórkachPAAQ1
Zestaw odczynników kolorystycznych ALT (SGPT).Teco DiagnosticsA526 - 120
Zestaw odczynników do oznaczeń końcowych kolorymetrycznych AST/(SGOT)Teco DiagnosticsA561-120

Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt.

Bibliografia

  1. Parks, R. J. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).
  2. Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).
  3. Belalcazar, L. M. Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Circulation. 107, 2726-2732 (2003).
  4. Oka, K. Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor. Circulation. 103, 1274-1281 (2001).
  5. Nomura, S. Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia. Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).
  6. Ng, P. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).
  7. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).
  8. Oka, K., Chan, L. Helper-Dependent Adenoviral Vectors. Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).
  9. Yechoor, V. Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes. Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).
  10. Yechoor, V. Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice. Endocrinology. , (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

cukrzyca indukowana STZekspresja Ngn3 Btcoczyszczanie wektoragradient chlorku cezuiniekcja do żyły ogonowejtest tolerancji glukozy
Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.