Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Podsumowanie

Drosophila larwy są w stanie kojarzyć bodźce zapachowe z nagrodą smakową. W niniejszej pracy opisujemy prosty paradygmat behawioralny, który umożliwia analizę apetytywnego uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na zapachy.

Streszczenie

Poniżej opisujemy szczegóły metodologiczne apetytywnego asocjacyjnego uczenia się zapachowego u larw Drosophila. Układ ten, w połączeniu z interferencją genetyczną, umożliwia analizę neuronalnych i molekularnych podstaw konkretnie uczenia się asocjacyjnego w prostym mózgu larwalnym.

Organizmy mogą wykorzystywać przeszłe doświadczenia do modyfikowania obecnego zachowania. Taką aktualizację potencjału behawioralnego można zdefiniować jako uczenie się, a fizyczne podstawy tych potencjałów jako ślady pamięciowe^1-4. Neuronaukowcy starają się zrozumieć, w jaki sposób procesy te są zorganizowane pod kątem zmian molekularnych i neuronalnych w mózgu, stosując różnorodne metody na organizmach modelowych, od owadów po kręgowce^5,6. W takich badaniach pomocne jest wykorzystanie systemów modelowych, które są proste i dostępne eksperymentalnie. Larwa Drosophila okazała się spełniać te wymogi dzięki dostępności wiarygodnych testów behawioralnych, istnieniu wielu technik transgenicznych oraz prostej organizacji układu nerwowego obejmującego jedynie około 10 000 neuronów (choć z pewnymi zastrzeżeniami: ograniczeniami poznawczymi, niewielką liczbą opcji behawioralnych oraz wątpliwą bogatością doświadczeń)^7-10.

Drosophila larvae mogą tworzyć skojarzenia między zapachami a apetycznym wzmocnieniem smakowym, takim jak cukier^11-14. W standardowym teście, opracowanym w laboratorium B. Gerbera, zwierzęta przechodzą wzajemne treningi dwuzapachowe: pierwsza grupa larw jest eksponowana na zapach A wraz ze wzmocnieniem smakowym (nagrodą w postaci cukru), a następnie na zapach B bez wzmocnienia⁹. W tym samym czasie druga grupa larw przechodzi trening odwrotny, doświadczając zapachu A bez wzmocnienia, a następnie zapachu B wraz ze wzmocnieniem (nagrodą w postaci cukru). Następnie w obu grupach testowana jest preferencja między dwoma zapachami. Stosunkowo wyższa preferencja dla zapachu nagradzanego odzwierciedla uczenie się asocjacyjne – prezentowane jako wskaźnik wydajności (performance index, PI). Wniosek dotyczący asocjacyjnego charakteru wskaźnika wydajności jest przekonujący, ponieważ poza współzależnością między zapachami a substancjami smakowymi, inne parametry, takie jak ekspozycja na zapach i nagrodę, upływ czasu oraz sposób obchodzenia się ze zwierzętami, nie różnią się między dwiema grupami⁹.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Larwy dzikiego typu Drosophila są hodowane w temperaturze 25 °C i wilgotności 60%-80% w cyklu światło/ciemność 14/10. Aby kontrolować dokładny wiek larw, do jednej fiolki (wysokość 6 cm i średnica 2,5 cm) zawierającej około 6 ml standardowej pożywki dla muszek umieszcza się zawsze 20 samic i 10 samców. Muszki mogą składać jaja przez 12 hr, po czym w drugim dniu są przenoszone do nowej fiolki. 5-6 dni po złożeniu jaj larwy osiągają stadium żerującego 3^rd stadium larwalnego, jeśli są hodowane w 25 °C, i mogą zostać wykorzystane w eksperymencie behawioralnym. Należy jednak upewnić się, że pobiera się tylko larwy, które wciąż znajdują się w pożywce, a nie te ze ścianek fiolki. Larwy te osiągnęły już „wędrujące 3^rd stadium larwalne” – krótko przed przepoczwarczeniem – a ich użycie komplikuje interpretację wyników.
2. Przygotowanie szalek Petri z 2,5% agarozą (inne laboratoria stosują w całym eksperymencie stężenia agaru 1%, jednak niższe stężenia mogą pozwolić żerującym larwom w 3^rd stadium larwalnym na wgryzanie się w podłoże): Rozpuścić 2,5 g agarozy w 100 ml ddH₂O. Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia. Ostrożnie wymieszać roztwór i ponownie wstawić go do kuchenki mikrofalowej, aż cała agaroza się rozpuści. Nalać gorący roztwór agarozy do szalek Petri tak, aby dno szalek było całkowicie zakryte, a roztwór agarozy tworzył gładką powierzchnię. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zamknąć pokrywki. Nie należy zamykać pokrywek natychmiast, aby zapobiec kondensacji wody na pokrywkach.
3. Przygotowanie szalek Petri z 2M fruktozą: Rozpuścić 2,5 g agarozy w 100 ml ddH₂O (ponownie, możliwe jest zastosowanie 1% stężenia agaru, jednak może to pozwolić żerującym larwom w 3^rd stadium larwalnym na wgryzanie się w podłoże). Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia. Ostrożnie wymieszać roztwór i ponownie wstawić go do kuchenki mikrofalowej, aż cała agaroza się rozpuści. Do gorącego roztworu ostrożnie dodać 35 g fruktozy; powoli mieszać mieszaninę aż do rozpuszczenia cukru, aby uniknąć gwałtownego wrzenia. Nalać gorący roztwór fruktozy i agarozy do szalek Petri tak, aby dno było całkowicie zakryte, a roztwór fruktozy i agarozy tworzył gładką powierzchnię. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zamknąć pokrywki. Nie należy zamykać pokrywek natychmiast, aby zapobiec kondensacji wody na pokrywkach.
4. Przygotowanie pojemników z zapachem 1-oktanolu (OCT): Wlać 10 μl czystego OCT do specjalnie wykonanego teflonowego pojemnika na zapach i zamknąć go pokrywką z kilkoma małymi otworami, aby umożliwić odparowywanie zapachu. Szczegółowy opis pojemników znajduje się w pracy Gerber and Stocker 2007. Przygotować trzy pojemniki na zapach OCT. Pojemniki na zapach umożliwiają odparowywanie wprowadzonych substancji chemicznych, zapobiegając jednocześnie bezpośredniemu kontaktowi larw z tymi substancjami. W ten sposób opisane tutaj eksperymenty odnoszą się konkretnie do uczenia się olfaktorycznego u larw, bez zakłóceń związanych z efektami gustatorycznymi.
5. Przygotowanie pojemników z zapachem octanu amylu (AM): Rozcieńczyć AM 1:50 w oleju parafinowym. Wlać 10 μl rozcieńczenia do specjalnie wykonanego teflonowego pojemnika na zapach i zamknąć go pokrywką z kilkoma małymi otworami, aby umożliwić odparowywanie zapachu. Przygotować trzy pojemniki na zapach AM. Rozcieńczenie jest ważne z powodów praktycznych, a mianowicie aby uniknąć silnej preferencji jednego zapachu nad drugim, co mogłoby zamaskować zależną od uczenia się zmianę w relatywnej preferencji między dwoma zapachami. Równą atrakcyjność obu zapachów należy być może potwierdzić w laboratorium przed eksperymentem, stosując opisany później test (2.5) z naiwnymi zwierzętami. Wartości zaprezentowane tutaj opierają się na kilku publikacjach laboratorium Gerbera, które zostały niedawno powtórzone w naszym laboratorium^9,15,16.
6. Oznakowanie szalek Petri: Przed eksperymentami behawioralnymi wszystkie szalki Petri muszą zostać zakodowane. Oznacza to, że szalki Petri zawierające fruktozę muszą być oznakowane na przykład symbolem „X” lub „A”, a szalki zawierające tylko agarozą symbolem „Y” lub „B”. Kod ten powinien zostać ujawniony eksperymentatorowi dopiero po zarejestrowaniu wszystkich danych. Dzięki przeprowadzeniu eksperymentów metodą „ślepej próby” wyklucza się możliwość wpływu oczekiwań eksperymentatora na wyniki larw. Dla ułatwienia zrozumienia przez szerokie grono czytelników, w dalszej części będziemy mówić o zapachach jako o bodźcach warunkowych (CS1 lub CS2), które są albo nagradzane, gdy są prezentowane na szalce Petri z fruktozą (+), albo nienagradzane, gdy są prezentowane na szalce Petri z samą agarozą (-).

2. Trening i test nagrody cukrowej

1. Pobrać 30 żerujących larw 3^rd stadium z fiolki z pożywką. Przenieść je do pierwszej szalki Petriego zawierającej kilka kropli wody z kranu i ostrożnie przesuwać je pędzlem w przód i w tył. Następnie przenieść je do drugiej szalki Petriego, również zawierającej kilka kropli wody z kranu, aby upewnić się, że na ścianach ciała larw nie pozostała pasta pokarmowa; w przeciwnym razie larwy mogłyby odczuwać zapach pożywki podczas eksperymentu. Mogłoby to prawdopodobnie zamaskować proces uczenia się oraz ich wyniki w sytuacji testowej.
2. Trening: Aby nauczyć larwy kojarzenia zapachów z apetycznym sygnałem cukrowym, stosuje się następujący schemat. Umieścić pojemnik z zapachem OCT po lewej i prawej stronie szalki Petriego oznaczonej znakiem „X” – czyli szalki zawierającej nagrodę w postaci fruktozy (+), (eksperyment „ślepy”, szczegóły w punkcie 1.6). Umieścić grupę 30 żerujących larw 3^rd stadium na środku szalki Petriego, zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, podczas gdy zwierzęta są narażone na działanie OCT. Należy upewnić się, że larwy nie utknęły w kropli wody i są w stanie pokonać jej napięcie powierzchniowe. Dzięki temu larwy mogą swobodnie poruszać się po szalce Petriego i doświadczać bodźców węchowych i/lub smakowych.
3. Trening: Usunąć larwy z szalki Petriego za pomocą zwilżonego pędzla i przenieść je na drugą szalkę Petriego oznaczoną literą „Y” – czyli szalkę zawierającą wyłącznie agar (-) – z pojemnikiem z zapachem AM umieszczonym po jej lewej i prawej stronie. Zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, podczas gdy zwierzęta są narażone na działanie AM.
4. Trening: Powtórzyć punkty 2.2) i 2.3) dwukrotnie, tak aby wszystkie 30 larw przeszło trzy cykle treningowe: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). W tym eksperymencie CS1 reprezentuje OCT, a CS2 reprezentuje AM.
5. Test: Umieścić jeden pojemnik z zapachem AM i jeden z zapachem OCT po przeciwnych stronach szalki Petriego zawierającej wyłącznie agar. Przenieść wytrenowane zwierzęta na środek testowej szalki Petriego. Zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min. Następnie policzyć liczbę larw po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.
6. Powtórzyć kroki od 2.1) do 2.5) z drugą grupą 30 żerujących larw 3^rd stadium, ale zamienić eksperymentalne role AM i OCT w taki sposób, aby zwierzęta otrzymały następujący trening: CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). W tym eksperymencie CS1 reprezentuje OCT, a CS2 reprezentuje AM.
7. Możliwe układy treningu. Powyżej przedstawiono trening składający się z trzech prób treningowych OCT / (+) - AM / (-) lub w grupie odwrotnej z trzech prób treningowych AM / (+) - OCT / (-). Jednak aby uniknąć efektów zależnych od sekwencji podczas treningu, ważne jest zróżnicowanie kolejności bodźców w następnych powtórzeniach całego eksperymentu. Poprzez zmianę kolejności CS1 lub CS2, a także prezentacji nagrody na pierwszej lub drugiej przedstawionej szalce, możliwe są cztery różne sekwencje prób treningowych:

Pierwsza grupa	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Grupa odwrotna	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Aby zapobiec systematycznym efektom bodźców w otaczającym środowisku eksperymentalnym, w połowie przypadków test należy przeprowadzić w taki sposób, aby OCT znajdowało się po lewej stronie, a AM po prawej. W pozostałej połowie przypadków AM powinno być prezentowane po lewej stronie, a OCT po prawej.

3. Testy sprawności sensoryczno-motorycznych istotnych dla wykonywanego zadania

Projekt powyższych eksperymentów pozwala na samodzielną analizę uczenia się związku zapach-cukier u larw dzikiego typu w 3^rd stadium rozwojowym podczas żerowania. Jednak w codziennej praktyce laboratoryjnej badacze zazwyczaj wykorzystują dwie lub więcej różnych grup eksperymentalnych larw, aby sprawdzić, czy uczenie się olfaktoryczne zależy od konkretnego genu, specyficznego zestawu neuronów, linii mutantów, specjalnej diety pokarmowej, różnych warunków hodowli, toksycznych substancji chemicznych dodanych podczas rozwoju itp. Zatem w każdym przypadku, gdy testowane są dwie lub więcej grup eksperymentalnych larw, należy przeprowadzić zestaw obowiązkowych eksperymentów kontrolnych, aby sprawdzić, czy różne grupy larw wykazują prawidłową sprawność sensoryczno-motoryczną. Jest to niezbędne, ponieważ potencjalne fenotypy niekoniecznie wynikają ze zmniejszonej lub zniesionej zdolności do kojarzenia zapachów z cukrem. Zamiast tego, potencjalne deficyty uczenia się mogą wynikać z zaburzeń na dowolnym etapie obwodów sensoryczno-motorycznych w przetwarzaniu zapachów i/lub cukru. Innymi słowy, jeśli larwa mutant nie jest w stanie wyczuć cukru, nie może utworzyć pamięci cukrowej. Nie pozwala to jednak na wyciągnięcie wniosku, że larwa nie potrafi się uczyć. W szczegółach, aby przetestować prawidłowe przetwarzanie OCT, AM i fruktozy u larw transgenicznych, należy przeprowadzić następujące eksperymenty kontrolne.

1. Test preferencji naiwnych OCT

Pobierz 30 żerujących larw 3^rd stadium z fiolki z pożywką. Umyj je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Umieść pojedynczy pojemnik z zapachem OCT po jednej stronie szalki Petriego z agarozą, przenieś larwy na środek szalki, zamknij pokrywkę i odczekaj 5 min, aby larwy mogły przemieszczać się po szalce i zorientować się w stronę źródła zapachu OCT. Następnie policz liczbę larw znajdujących się po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.

2. Test preferencji naiwnych AM

Pobrać 30 żerujących larw 3^rd stadium z fiolki z pożywką. Umyć je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Umieścić pojedynczy pojemnik z zapachem AM po jednej stronie szalki Petriego z agaroza, przenieść larwy na środek szalki, zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, aby larwy mogły przemieścić się po szalce i zorientować w kierunku źródła zapachu AM. Następnie policzyć liczbę larw znajdujących się po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.

3. Test preferencji w stosunku do cukrów u osobników naiwnych

Pobierz 30 żerujących larw 3^rd stadium z fiolki z pożywką. Umyj je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Przygotuj szalki Petriego, w których jedna połowa zawiera 2,5% agarozy, a druga połowa mieszaninę 2M fruktozy i agarozy. Umieść larwy na szalce Petriego, zamknij pokrywkę i odczekaj 5 min, aby larwy mogły przemieścić się po szalce i zorientować w stronę strony zawierającej fruktozę. Następnie policz liczbę larw po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.

Przygotowanie szalek Petri z podziałem pół na pół: Przygotuj standardowe płytki agarowe zgodnie z opisem w sekcji 1.2. Po ostygnięciu szalek Petri wypełnionych agarozą, ostrożnie przetnij agar wzdłuż osi pionowej za pomocą skalpela. Usuń jedną połowę agarozy z szalki Petri. Do pustej połowy szalki Petri dodaj gorący roztwór fruktozo-agarozy (sposób przygotowania opisano w sekcji 1.3). Należy dopilnować, aby obie połowy stykały się ze sobą i nie tworzyły wyraźnej krawędzi – wpływa to na behawioralny wybór larw i znacząco utrudnia analizę zachowania⁴.

Trening pozorowany

Pomimo przeprowadzenia testów sprawdzających, czy transgeniczne larwy 3^rd stadium są w stanie odróżnić na poziomie typu dzikiego OCT od powietrza (3.1), AM od powietrza (3.2) oraz cukier od czystej agarozy (3.3), niedawno wprowadzono dodatkowy zestaw eksperymentów testowych (dyskusję na ten temat zobacz w Gerber and Stocker, 2007). Uzasadnienie tych eksperymentów jest następujące. Podczas treningu larwy są poddawane intensywnym manipulacjom oraz sukcesywnej stymulacji zapachowej i cukrowej. W związku z tym jest wysoce prawdopodobne, że obserwowany fenotyp uczenia się jest mylący (mimo że testy percepcji zapachu i cukru u osobników naiwnych znajdują się na poziomie typu dzikiego!). Rzeczywiście możliwe jest, że zwierzęta transgeniczne różnią się od larw typu dzikiego pod względem odporności na stres, motywacji, zmęczenia, adaptacji sensorycznej, uczenia się kontekstowego oraz zmian w poczuciu sytości. Dlatego Michels et al. (2005) wprowadzili kontrole sprawdzające, czy dany mutant jest w stanie: (1) wykryć AM w porównaniu z pustym pojemnikiem na zapach, jeśli traktuje się larwy dokładnie tak samo jak podczas treningu, z wyjątkiem pominięcia nagrody i jedynie wystawienia na oba zapachy; (2) wykryć OCT po zastosowaniu tego samego schematu; (3) wykryć AM w porównaniu z pustym pojemnikiem na zapach, jeśli traktuje się larwy w sposób zbliżony do treningu, z wyjątkiem pominięcia zapachów i jedynie wystawienia na nagrodę; oraz (4) wykryć OCT po zastosowaniu tego samego schematu. Kompletną dyskusję i dalsze szczegóły dotyczące metod można znaleźć w Michels et al (2005) oraz Gerber and Stocker (2007).

4. Analiza danych dla uczenia się nagrody cukrowej

1. Aby ocenić dane z protokołu uczenia się nagrody cukrowej, należy obliczyć indeks preferencji OCT (PREF OCT) dla każdej z dwóch grup trenowanych wzajemnie:
   Dla pierwszej grupy, która przeszła trening OCT/(+) - AM/ (-):
   PREF OCT (OCT+/AM-) = (# larw po stronie OCT - # larw po stronie AM) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej
   Dla drugiej grupy, która przeszła trening AM/ (+) - OCT/(-):
   PREF AM (AM+/OCT-) = (# larw po stronie AM - # larw po stronie OCT) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej

2. Oblicz indeks wydajności (PI) dla dwóch wartości PREF uzyskanych w punkcie 4.1). PI reprezentuje uczenie się asocjacyjne poprzez zniesienie zakłócających efektów ekspozycji na zapach i karę, upływu czasu oraz manipulacji:
   PI = (PREF OCT (OCT+/AM) + PREF AM (AM+/OCT)) / 2
   W związku z tym wartości PI mogą mieścić się w zakresie od -1 do 1. Istotnie ujemne wartości reprezentują uczenie się awersyjne, natomiast istotnie dodatnie wartości opisują uczenie się apetytywne. Pełny eksperyment obejmuje zazwyczaj 10 lub więcej wartości PI. Dane są wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych zawierających wszystkie wartości danej grupy eksperymentalnej. 50% wartości znajduje się wewnątrz pudełka; mediana indeksu wydajności jest zaznaczona pogrubioną linią wewnątrz wykresu pudełkowego.

5. Analiza danych dla zdolności sensoryczno-motorycznych istotnych dla zadania

1. Aby ocenić dane podczas badania prawidłowego przetwarzania zapachu OCT, należy obliczyć indeks preferencji zapachu OCT w następujący sposób:
   Odor PREF OCT = (# larw po stronie OCT - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej
2. Aby ocenić dane podczas badania prawidłowej percepcji zapachu AM, należy obliczyć indeks preferencji zapachu AM w następujący sposób:
   Odor PREF AM = (# larw po stronie AM - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej
3. Aby ocenić dane podczas badania prawidłowej percepcji fruktozy, należy obliczyć indeks preferencji fruktozy w następujący sposób:
   PREF fructose = (# larw po stronie fruktozy - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej
4. Szczegółowe informacje dotyczące treningu pozorowanego (sham training) podano w pracy Michels et al. 2005.

Wyniki

Rycina 1A przedstawia ogólny schemat procedur eksperymentalnych dotyczących uczenia się asocjacyjnego zapachów u larw. Poprzez parowanie jednego z dwóch prezentowanych zapachów z nagrodą w postaci cukru, larwy nabywają potencjału behawioralnego do wykazania reakcji atrakcyjnej wobec nagrodzonego zapachu w porównaniu z zapachem nienagrodzonym. Dwie grupy larw są zawsze trenowane poprzez parowanie wzmocnienia z zapachem OCT lub AM. Indeks wydajności (PI) mierzy funkcję asocjacyjną jako różnicę w preferencj...

Dyskusja

Opisany układ badawczy u larw Drosophila umożliwia badanie asocjacyjnego uczenia się węchowego w stosunkowo prostym mózgu. Podejście to jest proste, tanie, łatwe do wdrożenia w laboratorium i nie wymaga zaawansowanego sprzętu⁹. Przedstawiamy wersję eksperymentu służącą do badania asocjacyjnego uczenia się apetycyjnego, wzmacnianego nagrodą w postaci fruktozy¹¹. Opisany układ opiera się na serii badań parametrycznych, w których kompleksowo przeanalizowano zmienne takie jak liczba prób trenin...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fruktoza	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agaroza	Sigma	A5093	9012-36-6
1-oktanol	Sigma	12012	111-87-5
Octan amylu	Sigma	46022	628-63-7
Olej parafinowy	Sigma	18512	8012-95-1