Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).
Artykuł metodologiczny
Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Morfogeneza mieszków włosowych, złożony proces wymagający interakcji między pochodzącymi z nabłonka keratynocytami a leżącym pod nimi mezenchymem, stanowi atrakcyjny model badawczy do analizy rozwoju organów i specyficznej dla tkanek sygnalizacji. Chociaż rozwój mieszków włosowych jest podatny na manipulacje genetyczne, szybka i powtarzalna analiza czynników niezbędnych dla tego procesu wciąż stanowi wyzwanie. W niniejszej pracy opisujemy procedurę generowania celowanej nadekspresji lub knockdownu czynników za pomocą shRNA przy użyciu lentiwirusów w sposób specyficzny dla danej tkanki. Wykorzystując zmodyfikowaną wersję modelu regeneracji włosów 5, 6, 11, możliwe jest przeprowadzenie skutecznej analizy funkcji typu gain-of-function lub loss-of-function w pierwotnych keratynocytach mysich lub komórkach skóry właściwej, co ułatwia badanie szlaków sygnalizacyjnych nabłonkowo-mezenchymalnych prowadzących do morfogenezy mieszków włosowych. Opisujemy sposób izolacji świeżych pierwotnych keratynocytów mysich oraz komórek skóry właściwej, które zawierają komórki brodawki skórnej i ich prekursory, wprowadzanie lentiwirusa zawierającego shRNA lub cDNA do jednej z populacji komórkowych, a następnie łączenie komórek w celu wygenerowania w pełni uformowanych mieszków włosowych na grzbietach myszy nago (nude mice). Podejście to umożliwia analizę specyficznych dla tkanek czynników niezbędnych do wytworzenia mieszków włosowych w ciągu trzech tygodni i stanowi szybkie oraz wygodne uzupełnienie istniejących modeli genetycznych.
Protokół
1. Przygotowanie noworodków myszy w wieku od 0 do 2 dni do sekcji skóry
- Uśmierć szczenięta myszy, korzystając z komory z CO2 przez co najmniej 20 min. Pozostaw szczenięta na lodzie do godziny przed przystąpieniem do sekcji. Wysoce zaleca się stosowanie myszy P0-P2, ponieważ komórki przygotowane z starszych myszy mają ograniczoną zdolność progenitorową, co skutkuje niższymi wydajnościami przeszczepów. Przed rozpoczęciem sekcji skóry przygotuj jedną płytkę z 70% etanolem (do kroku 1.3) oraz trzy płytki z roztworem płuczącym (do kroku 3). Rozmroź roztwór Dispase i pozostaw go w temperaturze 4 °C. Po nadmiernej ekspozycji na CO2 wykonaj dyslokację szyjną szczeniąt, aby upewnić się, że zostały uśmiercone.
- Umieść uśmiercone szczenięta w naczyniu hodowlanym na lodzie i przenieś je do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
- Przemyj szczenięta, krótkotrwale zanurzając je w 70% etanolu, a następnie umieść na sterylnej płytce hodowlanej.
2. Disekcja skóry myszy
- Odciąć każdą kończynę oraz ogon u podstawy tułowia za pomocą sterylnych nożyczek.
- Mocno uchwycić ciało zakrzywioną pęsetą i naciąć skórę grzbietową wzdłuż linii od głowy do ogona za pomocą skalpela, uważając, aby nie przebić leżącej poniżej powięzi.
- Ostrożnie oddzielić skórę od linii środkowej ciała myszy.
- Mocno uchwycić odsłoniętą mysz długim ramieniem zakrzywionej pęsety, a następnie wsunąć drugą zakrzywioną pęsetę pod skórę na tylnym końcu ciała myszy i delikatnie przesunąć skórę znad bioder w stronę połowy brzusznej.
- Ostrożnie i jednym płynnym ruchem całkowicie zdjąć skórę z myszy, a następnie zutylizować truchło.
3. Płukanie skóry i inkubacja z roztworem dyspazy
- Umieść skórę w pierwszej naczyni z roztworem płuczącym stroną skóry właściwej do dołu. Rozprostuj skórę i delikatnie przemieszaj ją za pomocą pęsety. Pozostaw skórę w pierwszym naczyniu z roztworem płuczącym podczas preparowania kolejnego fragmentu skóry.
- Po umieszczeniu kolejnego wypreparowanego fragmentu skóry w pierwszym naczyniu z roztworem płuczącym, przenieś poprzedni fragment do drugiego naczynia z roztworem płuczącym. Przechowuj fragmenty skóry w drugim roztworze płuczącym do momentu zebrania wszystkich próbek. Przenieś wszystkie fragmenty skóry do końcowego płukania i krótko przemieszaj.
- Do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm dodaj 10 ml schłodzonej do temperatury 0 °C dyspazy. Przenieś skórę do roztworu dyspazy i rozprostuj ją stroną skóry właściwej do dołu.
- Inkubuj skórę w zawieszeniu przez 8-16 hr w temperaturze 4 °C (opcja alternatywna: 1 hr w temperaturze 37 °C).
4. Oddzielenie skóry właściwej od naskórka
- Przenieś skórę do nowej sterylnejy szalki hodowlanej i rozprostuj ją stroną skóry właściwej do dołu. Ostrożnie przytrzymaj skórę właściwą w jednym z narożników za pomocą skalpela.
- Chwyć naskórek pincetą i powoli oddziel go od skóry właściwej. Naskórek powinien odkleić się jako jeden fragment. Naskórek będzie biały i cienki, natomiast skóra właściwa powinna być brązowawa, grubsza i galaretowata.
- Rozdziel obie tkanki do osobnych sterylnych szalek hodowlanych.
- Aby przygotować przeszczep z wyciszeniem/nadekspresją genu specyficznego dla skóry właściwej, pobierz skórę właściwą i posiekaj ją na bardzo małe kawałki za pomocą dwóch skalpeli. Naskórek należy odrzucić. W dniu infekcji (krok 7) przeprowadź sekcję kolejnego zestawu skór mysich, aby przygotować świeże, niepoddane działaniu komórki naskórka do połączenia z zainfekowanymi lentiwirusami komórkami skóry właściwej.
- Aby przygotować przeszczep z wyciszeniem/nadekspresją genu specyficznego dla naskórka, pokrój każdy naskórek na 6 - 8 mniejszych fragmentów. Skórę właściwą należy odrzucić. W dniu infekcji (krok 7) przeprowadź sekcję kolejnego zestawu skór mysich, aby przygotować świeże, niepoddane działaniu komórki skóry właściwej do połączenia z zainfekowanymi lentiwirusami komórkami naskórka.
5. Dysocjacja pierwotnych komórek skóry myszy (mDCs) z rozdrobnionej tkanki
- Rozdziel mDC, inkubując fragmenty skóry w świeżo przygotowanym roztworze kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 1 hr. Należy użyć 10 ml roztworu kolagenazy na jednego młodego szczura.
- Delikatnie mieszać roztwór zawierający skórę co 10 min. Stopień dysocjacji należy sprawdzać pod mikroskopem; trawiona zawiesina komórkowa powinna składać się głównie z pojedynczych komórek. Roztwór powinien zmienić kolor z przejrzystego na mętny w miarę uwalniania się komórek skóry z tkanki.
- Do roztworu kolagenazy zawierającego skórę należy dodać FBS do stężenia końcowego 10%, aby zmniejszyć aktywność kolagenazy.
- Zawiesinę komórkową należy przefiltrować przez sitko komórkowe 70 μm do nowej probówki 50 ml, aby usunąć duże, nietrawione grudki oraz całe mieszki. Należy dodać 10 ml DMEM/10%FBS na każde 30 ml przelewu w celu dalszego rozcieńczenia kolagenazy.
- Probówki zawierające trawioną skórę należy wirować przy 30 x g w wirówce stołowej przez 5 min, aby dodatkowo usunąć całe mieszki.
- Należy ostrożnie przenieść nadsącz do nowej probówki 50 ml. Komórki należy osadzić, wirując przy 200 x g w wirówce stołowej przez 5 min.
- Komórki należy resuspender w DMEM/10%FBS (1 ml na szczura) i policzyć. Komórki należy wysiać w pożywce Amniomax C-100 w celu infekcji (krok 7) lub do połączenia z zainfekowanymi lentiwirusem KC w celu przeszczepienia (krok 9). Typowa wydajność to 20 x 106 komórek na szczura.
6. Dysocjacja pierwotnych keratynocytów (KC) z rozdrobnionej tkanki
- Dysocjuj KC, inkubując fragmenty naskórka w świeżo rozmrożonym 0,05% Trypsin-EDTA w temperaturze 37 °C przez 15 min. Użyj 7 ml Trypsin-EDTA na jednego szczeniętą myszy.
- Delikatnie mieszaj roztwór zawierający naskórek co 5 min.
- Dodaj równą objętość Neutralizing Solution do Trypsin-EDTA zawierającego naskórek, aby zahamować aktywność trypsyny.
- Osadź komórki poprzez wirowanie przy 200 x g w wirówce nakładkowej przez 5 min. Pozostała nietrawiona tkanka powinna unosić się na powierzchni.
- Ostrożnie odlej większość supernatantu z nietrawioną tkanką. Usuń pozostały supernatant za pomocą pipety 10 ml, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspenduj osad komórkowy w PBS. W przypadku niepełnego osadzenia KC, odlej większość supernatantu i powtórz wirowanie, aż większość komórek zostanie osadzona.
- Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 70 μm do nowej probówki, aby usunąć pozostałą tkankę lub agregaty.
- Osadź komórki poprzez wirowanie przy 200 x g w wirówce nakładkowej przez 5 min.
- Resuspenduj komórki w pożywce CnT-07 lub PBS (1 ml na szczeniętą myszy) i dokonaj zliczenia komórek. Użyj CnT-07 do wysiewania komórek w celu infekcji (krok 7), a PBS do połączenia z zainfekowanymi lentiwirusem mDC w celu przeszczepienia (krok 9). Typowa wydajność wynosi 3-10 x 106 komórek na szczeniętą myszy.
7. Zakażanie komórek pierwotnych lentiwirusem zawierającym shRNA lub cDNA
W dniu zakażenia należy wypreparować kolejny zestaw skór myszy, aby przygotować świeże, niepoddane obróbce pierwotne KC lub mDC, które zostaną połączone z komórkami zainfekowanymi wirusem w dniu przeszczepienia (krok 9).
-
- W przypadku mDC, wysiać 4 x 106 mDC na płytkę 10-cm w medium AmnioMAX-C100 i inkubować w 37 °C + 5% CO2 do następnego dnia, aby przeprowadzić infekcję przy 50% gęstości komórek. Zazwyczaj do wytworzenia jednego przeszczepu wykorzystuje się 3-4 płytki mDC, a do wytworzenia trzech przeszczepów w jednym eksperymencie potrzeba łącznie 10-12 płytek. Alternatywnie można pozwolić mDC przytwierdzić się i rozprzestrzenić przez minimum 2 h w 37 °C + 5% CO2 i przeprowadzić infekcję w tym samym dniu wysiewu komórek. mDC będą miały morfologię fibroblastopodobną.
- W przypadku KC, wysiać 12 x 106 KC na płytkę 10-cm w medium CnT-07 i inkubować w 37 °C + 5% CO2 do infekcji w następnym dniu. Alternatywnie można pozwolić KC przytwierdzić się i rozprzestrzenić przez minimum 2 h w 37 °C + 5% CO2 i przeprowadzić infekcję w tym samym dniu. Zazwyczaj do wytworzenia jednego przeszczepu wykorzystuje się 3-4 płytki KC. Do wytworzenia trzech przeszczepów dla jednego eksperymentu potrzeba łącznie 10-12 płytek. KC będą miały morfologię brukową.
- Preinkubować komórki przez 5-10 min z roztworem Polybrene 8 μg/ml w 37 °C + 5% CO2.
- Wymienić medium i dodać lentiwirusy + roztwór Polybrene 8 μg/ml. Miano lentiwirusów będzie zależeć od użytego konstruktu i powinno zostać określone przed infekcją.
- Wirować płytki w wirówce stołowej przy 200 x g przez 1 h w 32 °C w celu zainfekowania komórek lentiwirusami.
- Usunąć medium zawierające lentiwirusy i dodać świeże medium. W przypadku KC raz przemyć komórki PBS przed ponownym dodaniem świeżego medium. Zazwyczaj zainfekowane komórki regenerują się przez noc w 37 °C + 5% CO2. Alternatywnie można zapewnić co najmniej dwie godziny regeneracji w 37 °C + 5% CO2 przed trypsynizacją komórek do przeszczepów. Kontynuować hodowlę niewielkiej części zainfekowanych komórek w celu sprawdzenia wydajności infekcji, zgodnie z opisem w sekcji Reprezentatywne Wyniki.
8. Przygotowanie zainfekowanych komórek do szczepienia
- Wyizolować świeże pierwotne mDC lub KC ze skóry, postępując zgodnie z krokami 4-6. Resuspender komórki w lodowatym, sterylnym PBS. Policzyć komórki.
-
- W przypadku przeszczepu z wyciszeniem/nadekspresją genu specyficznego dla skóry właściwej, odłączyć zainfekowane mDC od płytek, stosując 0,05% Trypsyna-EDTA w temperaturze 37 °C przez 8 min.
- W przypadku przeszczepu z wyciszeniem/nadekspresją genu specyficznego dla naskórka, odłączyć zainfekowane KC od płytek, stosując 0,125% Trypsyna-EDTA w temperaturze 37 °C przez 15 min.
- Zneutralizować aktywność trypsyny, stosując DMEM + 10% FBS (mDC) lub roztwór neutralizujący (KC). Przenieść trypsynizowane komórki do probówki 50 ml.
- Odwirować komórki w wirowarce stołowej przy 200 x g przez 5 min.
- Resuspender komórki w lodowatym, sterylnym PBS. Policzyć komórki.
- Połączyć komórki zainfekowane wirusem ze świeżo przygotowanym, niepoddanym działaniu wirusa odpowiednim typem komórek. Na jeden przeszczep połączyć 7-10 x 106 mDC z 7-10 x 106 KC w lodowatym, sterylnym PBS i odwirować zawiesinę komórkową w wirowarce stołowej w temperaturze 4 °C. Resuspender komórki w 50-100 μl lodowatego, sterylnego PBS. Przechowywać komórki w lodzie do momentu przygotowania komór przeszczepowych myszy nu/nu.
9. Przygotowanie łoża rany i mocowanie komory na grzbiecie myszy nu/nu
Na dzień przed szczepieniem należy wysterylizować narzędzia chirurgiczne w autoklawie oraz sterylną silikonową komorę poprzez namoczenie w 70% etanolu. Przed użyciem komory należy zastąpić 70% etanol sterylnym PBS.
- Zanurzyć mysz nu/nu (samice w wieku 7-12 tygodni) w narkozie, stosując ketaminę (8 mg/ml)/ksylazynę (1.6 mg/ml) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe (100 μl/10 g masy ciała) lub inną preferowaną metodę. Zastosować lubrykant do oczu. Pod myszą umieścić matę grzewczą.
- Zdezynfekować skórę grzbietu myszy naga jodem, a następnie oczyścić gazikami nasączonymi alkoholem.
- Miejscowo nanieść 1-3 krople 0,25% bupiwakainy w miejscu nacięcia. Chwycić pęsetą skórę grzbietu myszy nagiej u podstawy szyi.
- Za pomocą sterylnych nożyczek wyciąć w uchwyconej skórze mały okrągły otwór (o średnicy ok. 1 cm).
- Umieścić sterylną komorę na dnie rany i przykryć krawędzie komory otaczającą ją skórą.
- Utrwalić komorę w miejscu za pomocą szwów wzdłuż jej krawędzi (6 szwów na komorę), jak pokazano na Rysunku 2A.
- Po przygotowaniu komór delikatnie zamieszać zawiesinę komórkową i pobrać ją do igły o rozmiarze 23 G przymocowanej do strzykawki 1 ml. Jeśli zawiesina komórkowa osiadła na dnie, delikatnie resuspender ją za pomocą końcówki pipety 1 ml przed pobraniem do igły.
- Przebić komorę igłą i powoli nanieść komórki na ranę.
- Umieścić myszy w czystych, autoklawowanych klatkach. Przechowywać po 2 myszy w klatce, dodając do wody pitnej antybiotyki oraz Tylenol (3 mg/ml). Z naszego doświadczenia wynika, że dwie samice w klatce nie powodują niekorzystnych urazów komory, przeszczepu ani zwierząt.
- Pod połową klatki umieścić matę grzewczą i obserwować myszy do czasu ustąpienia działania anestetyku.
10. Usunięcie komory po 7–9 dniach
- Zanurzyć mysz nu/nu z implantowaną komorą w narkozie zgodnie z krokiem 9.1. Nałożyć smar do oczu.
- Zdezynfekować skórę wokół komory jodyną, a następnie oczyścić gazikami nasączonymi alkoholem.
- Ostrożnie przeciąć szwy i wyjąć mysz z komory.
- Delikatnie usunąć komorę z myszy. Jeśli nowy przeszczep skóry przykleił się do komory, należy lekko unieść część komory i ostrożnie oddzielić przeszczep za pomocą pęsety. Podczas usuwania komory należy dociskać przeszczep. Przeszczep powinien wyglądać na matowy i nieprzezroczysty, jak pokazano na Rysunku 2B.
- Na otwartą ranę nałożyć nieprzywierający opatrunek z cienką warstwą antybiotyku i przymocować go szwami (2 szwy).
- Owinąć mysz bandażem, aby zabezpieczyć opatrunek i chronić ranę. Przymocować bandaż szwami.
- Silikonowe komory należy wyczyścić, szorując je łagodnym mydłem, a następnie dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną. Moczyć komory w 70% etanolu przez noc, wysuszyć na powietrzu i przechowywać.
11. Badanie wzrostu włosa u myszy
- Zdjąć bandaże i opatrunek po 3 dniach od usunięcia komory. Przeszczep powinien być suchy i mieć od nieprzezroczystego do brązowego koloru.
- Okresowo sprawdzać u myszy wzrost włosem. Włosy powinny zacząć pojawiać się w 16. dniu po przeszczepieniu.
Zarys procedury
Dzień 1 (2-3 godz.): Uśmiercić nowonarodzone szczątka, usunąć skórę i pozostawić w dyspazie w temperaturze 4 °C przez noc.
Dzień 2 (2-3 godz.): Izolacja pierwotnych komórek skóry i wysiewanie ich przy zalecanej gęstości komórkowej.
Dzień 3 (3-4 godz.): Zakaź komórki lentiwirusem. Usuń skórę z innego zestawu nowonarodzonych szczeniąt i pozostaw w dyspazie w temperaturze 4 °C przez noc.
Dzień 4 (6-8 godz.): Wyizolować pierwotne komórki ze skóry, policzyć je i pozostawić na lodzie. Odzyskać komórki zainfekowane lentiwirusem poprzez trypsynizację i wirowanie, policzyć je i połączyć 7-10 x 106 komórek skóry właściwej i keratynocytów w 50-100 μl PBS na każdy przeszczep. Przygotować łoże rany u myszy, przymocować komorę i nanieść mieszaninę komórkową na łoże rany.
Alternatywne schematy procedury
Alternatywne schematy procedury pozwolą skrócić czas jej przeprowadzania z czterech do trzech dni.
- Połącz dzień 1 i dzień 2, traktując skóry mysie dyspazą w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę (przewidywany czas: 5-7 hr).
- Połącz dzień 2 i dzień 3, infekując komórki lentiwirusem po dwóch godzinach od wysiania komórek (przewidywany czas: 5-7 hr).
Wyniki
Na Rysunku 1 przedstawiamy wynik specyficznego dla skóry wyciszenia shRNA za pomocą lentiwirusa białka Smoothened (Smo), kluczowego elementu szlaku sygnałowego Shh, w 3-tygodniowym regenerującym się przeszczepie włosów. Przeszczepy kontrolne z zastosowaniem samego wektora lentiwirusowego wykazują silny wzrost włosów (Rysunek 1A). W przeciwieństwie do nich, specyficzne dla skóry wyciszenie Smo skutkuje utratą wzrostu włosów (Rysunek 1B). Barwienie hematoksyliną i eozyną obrazuje stopień rozwoju mieszków włosowych w warunkach kontrolnych i doświadczalnych (Rysunek 1C, D). Fenotyp wzrostu włosów przy podobnych zabiegach może być zmienny między eksperymentami, w tym w przypadku kontroli pozytywnej z samą infekcją wektorem lentiwirusowym. Dlatego w każdym eksperymencie należy zawsze uwzględnić przeszczepy kontrolne jako punkt odniesienia, ponieważ 30% przeszczepów może nie powodzić wzrostu w wyniku bliznowacenia lub niepełnego przylegania. W przypadku badania interakcji między dwoma czynnikami, np. nadekspresji cDNA jednego czynnika w celu przywrócenia funkcji po wyciszeniu shRNA innego czynnika, należy zawsze uwzględnić przeszczepy z samym wyciszeniem, aby wykazać efekt utraty funkcji w każdym doświadczeniu. Zapewni to niezbędny zakres do określenia, w jaki sposób konkretny gen zaburza ścieżkę regeneracji mieszków włosowych oraz w jaki sposób dwa geny wchodzą ze sobą w interakcję.
Usuwanie komory (Rycina 2A) musi być przeprowadzone z najwyższą ostrożnością. Nowo powstały przeszczep powinien być lekko mętny, z matową powierzchnią (Rycina 2B). Przeszczep może przylegać do komory, dlatego ważne jest delikatne uniesienie jednej strony, aby upewnić się, że przeszczep pozostaje przytwierdzony do łoża rany. Przeszczep jest dość stabilny po trzech dniach i nie powinien sprawiać większych trudności podczas usuwania opatrunku. Po trzech tygodniach powinien być widoczny intensywny wzrost włosów (Rycina 2C). Pominięcie mDCs lub KCs spowoduje regenerację miejsca rany bez odrostu włosów (Rycina 2D)11. Śmierć komórkowa lub utrata jednego z typów komórek również skutkuje brakiem włosów, w przeciwieństwie do zredukowanej regeneracji włosów w przypadku wyciszenia genu Smo w skórze właściwej, jak pokazano na Rycini 1B.
Aby zapewnić pomyślny przebieg analizy, przed szczepieniem krytyczne jest osiągnięcie ponad 90% infekcji wirusowej komórek z odpowiednią wydajnością nadekspresji lub wyciszenia. Ze względu na ograniczenia czasowe procedury szczepienia, zalecamy rozstrzygnięcie problemów z wydajnością infekcji wirusowej przed rozpoczęciem eksperymentu ze szczepieniem oraz zawsze zachowanie niewielkiej porcji komórek w dniu procedury szczepienia w celu weryfikacji utraty lub uzyskania ekspresji. Miano lentiwirusa będzie różnić się w zależności od zastosowanego konstruktu i powinno zostać określone przed infekcją, aby osiągnąć wydajność na poziomie 90-100%. Monitorujemy wydajność infekcji wirusowej za pomocą GFP współwyrażanego z wektora lentiwirusowego. Rutynowo przeprowadzamy ilościowy PCR i/lub Western blot, aby określić stopień wyciszenia lub nadekspresji. Wykorzystanie wektorów o podwójnej ekspresji z tagami fluorescencyjnymi do znakowania komórek zainfekowanych wirusem umożliwia raportowanie trwałości sygnału i liczby komórek wykazujących ekspresję naszych konstruktów w dojrzałych szczepach. Stosujemy GFP sterowane przez promotor CMV z wektora lentiwirusowego pSicoR-CMV-GFP 10 w połączeniu z shRNA dla Smo. Na Rysunku 3 przedstawiamy 3-tygodniowy szczep specyficzny dla skóry właściwej, w którym GFP jest ekspresowane lentiwirusowo w brodawce mieszkowej reprezentatywnego mieszka włosowego.
Rycina 1. Analiza histologiczna wzrostu mieszków włosowych. (A) Widok kontrolnego przeszczepu regenerującego włosy z komórkami skóry właściwej zainfekowanymi pustym wektorem lentiwirusem oraz niepoddanymi działaniu leków keratynocytami. (B) Wyciszenie genu Smoothened za pomocą lentiwirusego shRNA w komórkach skóry właściwej w połączeniu z niepoddanymi działaniu leków keratynocytami prowadzi do utraty mieszków włosowych. (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną pokazuje, że anagenowe mieszki włosowe w przeszczepach kontrolnych rozciągają się w głąb skóry właściwej, a (D) mieszki włosowe po wyciszeniu genu Smoothened pozostają zahamowane i w dużej mierze nieobecne. Wszystkie obrazy wykonano trzy tygodnie po przeszczepieniu. Pasek skali oznacza 100 μm.
Rysunek 2. Przeszczepianie komórek pierwotnych. (A) mysz nu/nu z zaszytą komorą zawierającą pierwotne komórki skóry właściwej i keratinocyty. (B) Usunięcie komory odsłania nowo powstałą skórę o matowym i nieprzezroczystym charakterze. (C) W pełni wyrośnięte włosy na przeszczepie z zastosowaniem pierwotnych komórek skóry właściwej i keratinocytów typu dzikiego w trzech tygodniach po przeszczepieniu. (D) Dodanie pierwotnych komórek skóry właściwej bez keratinocytów nie prowadzi do wzrostu włosów po trzech tygodniach. Podobne wyniki uzyskano po dodaniu pierwotnych keratinocytów bez komórek skóry właściwej.
Rycina 3. Utrzymanie ekspresji GFP w brodawce skórnej. Obrazy konfokalne brodawki skórnej z 3-tygodniowego zregenerowanego przeszczepu. GFP była wyrażana w populacji komórek skóry z wektora lentiwirusowego i wykryta w brodawce skórnej (kolor zielony). Versican (kolor czerwony) wyznacza obszar brodawki skórnej, a jądra komórkowe zostały oznakowane barwnikiem Hoechst (kolor niebieski). Należy zauważyć, że GFP jest wyrażane specyficznie w komórkach skóry, a nie w otaczających je keratynocytach. Pasek skali oznacza 20 μm.
Dyskusja
Testy rekonstrukcji włosa stanowią unikalny model regeneracji organów służący do badania mechanizmu tworzenia nowych mieszków włosowych de novo. W niniejszej pracy opisujemy zmodyfikowany test komory dla włosów, który jest użyteczny w określaniu funkcji genów w procesie formowania się mieszków włosowych. Nasz test opiera się na opisanym w literaturze teście rekonstrukcji włosa w komorze 5, 6,11, który zmodyfikowaliśmy poprzez wprowadzenie techniki ekspresji lentiwirusowej w celu uzyskania nadekspresji lub wyciszenia genów w komórkach skóry właściwej lub naskórka. Nasza metoda stanowi szybką alternatywę dla generowania tkankowo specyficznych knockoutów genetycznych. Test ten pozwala nam zademonstrować funkcję genów w formowaniu się mieszków włosowych w czasie zaledwie trzech tygodni — od zakażenia komórek pierwotnych lentiwirusem do pobrania przeszczepu. Nasz test można rozszerzyć na badanie interakcji genetycznych poprzez jednoczesne dostarczanie shRNA/cDNA za pomocą lentiwirusa do jednego typu komórek 12, a także na badanie sygnalizacji między komórkami skóry właściwej a komórkami naskórka.
Nasz test na włosach najlepiej nadaje się do wykrywania silnych fenotypów związanych z nabyciem lub utratą funkcji w regeneracji mieszków włosowych, podczas gdy subtelne defekty są trudniejsze do zaobserwowania. Wykorzystując nasz test regeneracji włosów, z powodzeniem wykazaliśmy specyficzną dla skóry funkcji kilku genów 1,12. Na podstawie markera GFP współwyrażanego z wektora lentiwirusowego wyrażającego shRNA 10, wykazaliśmy, że komórki dermalne donora wyrażające shRNA przetrwały w zregenerowanych przeszczepach włosów. Komórki GFP-dodatnie były obecne w brodawce dermy (DP) zregenerowanych mieszków włosowych (Rysunek 3). Komórki DP prawdopodobnie wykazywały różne stopnie wyciszenia genów, ponieważ komórki wyrażały zróżnicowane poziomy GFP, w związku z czym obserwowany fenotyp mieszków włosowych obejmował zakres od hipomorfu genetycznego do nulla.
Jednym z ulepszeń dla tego testu będzie wprowadzenie szybkiej i wydajnej selekcji komórek o wysokiej ekspresji shRNA przed przeszczepieniem, na przykład poprzez wykorzystanie FACS do oczyszczenia komórek wykazujących silną ekspresję GFP. Alternatywą jest zastosowanie w tym badaniu komórek mutantów lub komórek z warunkowym knockoutem 9. Z drugiej strony, bardzo użyteczny byłby system hodowli zdolny do zachowania funkcji komórek DP, ponieważ potencjał komórek DP jest stopniowo tracony w miarę kolejnych pasażowań pierwotnych komórek skóry. Potencjalne systemy hodowli obejmują zastosowanie biomateriałów pochodzących z sztucznych nisz lub hodowli agregacyjnych2,7,8,13. Kolejnym ulepszeniem będzie opracowanie niezawodnej metody mrożenia komórek epidermy z wysokim wskaźnikiem przeżywalności komórek, co ograniczy konieczność wykorzystywania drugiej grupy szczeniąt myszy (krok 7) do generowania świeżych keratynocytów w badaniach nad specyficzną dla skóry właściwej utratą lub nabyciem funkcji.
Ten test w komorze dla włosów pozwala uzyskać gęstość i jakość mieszków włosowych zbliżoną do normalnej skóry myszy, choć wzrost włosów jest nieco mniej zsynchronizowany, a orientacja mieszków bardziej przypadkowa. Do ograniczeń genetycznego testu regeneracji włosów należą wymagania dotyczące dużej ilości lentiwirusa i liczby komórek; ponadto metoda ta jest bardzo pracochłonna pod względem chirurgicznym w porównaniu z innymi formami testów rekonstrukcji włosów, takimi jak testy z łatą i płatem 3,4,14. Jednakże jakość mieszków włosowych oraz czas potrzebny na wykrycie wzrostu włosów są lepsze niż w innych testach 4. Nasz ukierunkowany test regeneracji włosów stanowi szybkie i wygodne uzupełnienie istniejących modeli genetycznych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez NIH NRSA 1F32CA14208701 (S.X.A.) oraz granty NIH AR052785 i AR046786 (A.E.O. oraz W.-M.W.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0,25% trypsyny-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| Suplement AminoMAX-C100 | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycyna | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dyspaza | Roche | 4942078001 | |
| Kollagenaza, typ 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Szalka do hodowli tkankowej | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Nożyczki preparacyjne | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Pinceta | Fisher Scientific | 10-275 | zakrzywiony |
| Skalpel | Medex Supply | GRF-2975#10 | Rozmiar nr 10 |
| 70 μbarwnik do komórek m | VWR | 21008-952 | |
| probówka stożkowa do wirowania 15 ml | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Gaziki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 1368063 | |
| igła 23 G | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Smar do oczu | CVS | 8883660 | |
| Tampony z powidonem i jodem | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Komory krzemowe | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Szwy | Acuderm | SUP3524 | |
| Elastyczny plaster | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Opatrunek nieprzywierający | TELFA | 1050 | |
| Materiały | |||
Roztwór do płukania PBS Roztwór dyspazy HBSS Pożywka neutralizująca HBSS Roztwór polybrenu HBSS |
Bibliografia
- Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
- Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
- Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
- Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
- Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
- Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
- Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
- Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
- Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
- Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
- Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).
Przedruki i uprawnienia
