Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Ming Jiang; Haoran Zhang; Blaine A. Pfeifer

doi:10.3791/4346

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

18.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4346

⸱

13 stycznia 2013

Ming Jiang¹ , Haoran Zhang² , Blaine A. Pfeifer¹

¹Chemical and Biological Engineering Department, State University of New York at Buffalo, ²Chemical Engineering Department, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Streszczenie

Heterologiczna produkcja złożonych produktów naturalnych jest podejściem opracowanym w celu rozwiązania obecnych ograniczeń i wykorzystania przyszłych możliwości. Jest ono szczególnie użyteczne w przypadku związków o wartości terapeutycznej, których nie można wytworzyć w wystarczającej ilości lub w przypadku których korzystna byłaby udoskonalona forma produkcji. Procedury eksperymentalne można podzielić na trzy komponenty: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną oraz 3) analizę produktu. Każdy z komponentów eksperymentalnych podlega ciągłej optymalizacji, aby sprostać wyzwaniom i wykorzystać możliwości związane z tym nowym podejściem.

Heterologiczna biosynteza rozpoczyna się od identyfikacji sekwencji genetycznej odpowiedzialnej za powstanie wartościowego produktu naturalnego. Przeniesienie tej sekwencji do gospodarza heterologicznego jest utrudnione przez złożoność szlaku biosyntetycznego odpowiedzialnego za formowanie produktu. Dobrym przykładem jest antybiotyk erytromycyna A. Do ostatecznej biosyntezy wymaganych jest dwadzieścia genów (łącznie >50 kb). Ponadto trzy z tych genów kodują megasyntazy, czyli enzymy wielodomenowe, z których każdy ma masę około 300 kDa. Materiał genetyczny ten musi zostać zaprojektowany i przeniesiony do E. coli w celu zrekonstruowania biosyntezy. W procesie przenoszenia klastra genetycznego erytromycyny A do E. coli opisane zostanie zastosowanie izolacji metodą PCR, konstrukcji operonów, plazmidów wielkistronicznych oraz elektrotransformacji.

Po transferze komórka E. coli musi umożliwiać późniejszą biosyntezę. Proces ten jest trudny ze względu na znaczne różnice między E. coli a większością oryginalnych organizmów gospodarzy odpowiedzialnych za tworzenie złożonych produktów naturalnych. Komórka musi dostarczyć niezbędnych substratów do wsparcia biosyntezy oraz koordynować ekspresję przetransferowanego klastra genetycznego w celu produkcji aktywnych enzymów. W przypadku erytromycyny A komórkę E. coli należało zmodyfikować tak, aby dostarczała dwa prekursory (propionyl-CoA i (2S)-metylomalonyl-CoA) wymagane do biosyntezy. Ponadto, w celu umożliwienia końcowego wytworzenia erytromycyny A, konieczne były modyfikacje sekwencji genów, optymalizacja liczby kopii plazmidu, koekspresja chaperonin, enzymatyczna modyfikacja potranslacyjna oraz kontrola temperatury procesu.

Na koniec należy ocenić sukces produkcji. W przypadku erytromycyny A zaprezentujemy dwie metody. Pierwszą z nich jest chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas (LC-MS), służąca do potwierdzenia i ilościowego oznaczenia produkcji. Bioaktywność erytromycyny A zostanie również potwierdzona za pomocą testu biologicznego, w którym sprawdzono aktywność antybiotykową wobec Bacillus subtilis. Analizy oceniające potwierdzają biosyntezę erytromycyny A w E. coli i stanowią podstawę dla przyszłych działań inżynieryjnych mających na celu usprawnienie lub zróżnicowanie produkcji, a także wytwarzanie nowych, złożonych związków naturalnych przy użyciu tego podejścia.

Wprowadzenie

Erytromycyna A jest antybiotykiem poliketydowym produkowanym przez Gram-dodatnią bakterię glebową Saccharopolyspora erythraea, a obecna produkcja została stopniowo zwiększona do poziomu ~10 g/L dzięki wieloletnim, tradycyjnym protokołom mutagenezy i przesiewu, a w ostatnim czasie dzięki schematom optymalizacji procesów ^1-6. Strategie mutagenezy i przesiewu są powszechne w opracowywaniu naturalnych produktów antybiotykowych ze względu na trudności w hodowli i/lub manipulacjach genetycznych natywnych gospodarzy produkcyjnych oraz dzięki łatwo dostępnej aktywności antybiotycznej lub ulepszonym fenotypom wzrostu ułatwiającym selekcję. W przypadku erytr....