Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Podsumowanie

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Streszczenie

Heterologiczna produkcja złożonych produktów naturalnych jest podejściem opracowanym w celu rozwiązania obecnych ograniczeń i wykorzystania przyszłych możliwości. Jest ono szczególnie użyteczne w przypadku związków o wartości terapeutycznej, których nie można wytworzyć w wystarczającej ilości lub w przypadku których korzystna byłaby udoskonalona forma produkcji. Procedury eksperymentalne można podzielić na trzy komponenty: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną oraz 3) analizę produktu. Każdy z komponentów eksperymentalnych podlega ciągłej optymalizacji, aby sprostać wyzwaniom i wykorzystać możliwości związane z tym nowym podejściem.

Heterologiczna biosynteza rozpoczyna się od identyfikacji sekwencji genetycznej odpowiedzialnej za powstanie wartościowego produktu naturalnego. Przeniesienie tej sekwencji do gospodarza heterologicznego jest utrudnione przez złożoność szlaku biosyntetycznego odpowiedzialnego za formowanie produktu. Dobrym przykładem jest antybiotyk erytromycyna A. Do ostatecznej biosyntezy wymaganych jest dwadzieścia genów (łącznie >50 kb). Ponadto trzy z tych genów kodują megasyntazy, czyli enzymy wielodomenowe, z których każdy ma masę około 300 kDa. Materiał genetyczny ten musi zostać zaprojektowany i przeniesiony do E. coli w celu zrekonstruowania biosyntezy. W procesie przenoszenia klastra genetycznego erytromycyny A do E. coli opisane zostanie zastosowanie izolacji metodą PCR, konstrukcji operonów, plazmidów wielkistronicznych oraz elektrotransformacji.

Po transferze komórka E. coli musi umożliwiać późniejszą biosyntezę. Proces ten jest trudny ze względu na znaczne różnice między E. coli a większością oryginalnych organizmów gospodarzy odpowiedzialnych za tworzenie złożonych produktów naturalnych. Komórka musi dostarczyć niezbędnych substratów do wsparcia biosyntezy oraz koordynować ekspresję przetransferowanego klastra genetycznego w celu produkcji aktywnych enzymów. W przypadku erytromycyny A komórkę E. coli należało zmodyfikować tak, aby dostarczała dwa prekursory (propionyl-CoA i (2S)-metylomalonyl-CoA) wymagane do biosyntezy. Ponadto, w celu umożliwienia końcowego wytworzenia erytromycyny A, konieczne były modyfikacje sekwencji genów, optymalizacja liczby kopii plazmidu, koekspresja chaperonin, enzymatyczna modyfikacja potranslacyjna oraz kontrola temperatury procesu.

Na koniec należy ocenić sukces produkcji. W przypadku erytromycyny A zaprezentujemy dwie metody. Pierwszą z nich jest chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas (LC-MS), służąca do potwierdzenia i ilościowego oznaczenia produkcji. Bioaktywność erytromycyny A zostanie również potwierdzona za pomocą testu biologicznego, w którym sprawdzono aktywność antybiotykową wobec Bacillus subtilis. Analizy oceniające potwierdzają biosyntezę erytromycyny A w E. coli i stanowią podstawę dla przyszłych działań inżynieryjnych mających na celu usprawnienie lub zróżnicowanie produkcji, a także wytwarzanie nowych, złożonych związków naturalnych przy użyciu tego podejścia.

Wprowadzenie

Erytromycyna A jest antybiotykiem poliketydowym produkowanym przez Gram-dodatnią bakterię glebową Saccharopolyspora erythraea, a obecna produkcja została stopniowo zwiększona do poziomu ~10 g/L dzięki wieloletnim, tradycyjnym protokołom mutagenezy i przesiewu, a w ostatnim czasie dzięki schematom optymalizacji procesów ^1-6. Strategie mutagenezy i przesiewu są powszechne w opracowywaniu naturalnych produktów antybiotykowych ze względu na trudności w hodowli i/lub manipulacjach genetycznych natywnych gospodarzy produkcyjnych oraz dzięki łatwo dostępnej aktywności antybiotycznej lub ulepszonym fenotypom wzrostu ułatwiającym selekcję. W przypadku erytromycyny A S. erythraea ogranicza powolny profil wzrostu oraz brak bardziej bezpośrednich technik manipulacji genetycznej (w porównaniu z organizmami takimi jak E. coli), co utrudnia szybkie usprawnienia w produkcji i biosyntezie nowych pochodnych. Po zidentyfikowaniu problemów produkcyjnych i odblokowaniu możliwości dywersyfikacji związków takich jak erytromycyna A, środowisko badawcze zaczęło dążyć do realizacji koncepcji biosyntezy heterologicznej (Rycina 1) ⁷. Działania te zbiegły się z dostępnością informacji sekwencyjnych dla klastra genów erytromycyny A ^8-11. Należy podkreślić, że liczba zsekwencjonowanych klastrów genów złożonych produktów naturalnych znacznie wzrosła ^12-16, co stało się impulsem do dalszych wysiłków w zakresie biosyntezy heterologicznej w celu uzyskania zakodowanego potencjału medycznego. Aby to osiągnąć, heterologiczna rekonstrukcja wymaga, aby nowy gospodarz spełniał potrzeby konkretnej ścieżki biosyntetycznej. E. coli zapewnia wygodę techniczną, szeroki zestaw technik biologii molekularnej oraz strategie inżynierii metabolicznej i procesowej w celu opracowania produktu. Jednak w porównaniu z natywnymi gospodarzami produkcyjnymi, E. coli nie wykazuje tego samego poziomu produkcji złożonych produktów naturalnych. Nie wiadomo było zatem, czy E. coli może służyć jako wykonalna opcja heterologiczna do biosyntezy złożonych produktów naturalnych. Przyjęto jednak założenie, że E. coli byłaby idealnym organizmem gospodarzem, gdyby udało się przeprowadzić biosyntezę heterologiczną.

W związku z tym celem podjęto pierwsze próby produkcji aglikonu poliketydowego, 6-deoksyerytronolidu B (6dEB), w E. coli. Jednak natywny metabolizm E. coli nie był w stanie zapewnić odpowiednich poziomów prekursorów propionylu-CoA i (2S)-metylomalonylu-CoA niezbędnych do biosyntezy 6dEB, a nowy gospodarz nie potrafił przeprowadzić potranslacyjnych modyfikacji enzymów syntazy deoksyerytronolidu B (DEBS). Aby rozwiązać te problemy, w E. coli zbudowano szlak metaboliczny składający się z enzymów natywnych i heterologicznych w taki sposób, aby egzogennie podawany propionian był wewnątrzkomórkowo przekształcany w propionyl-CoA, a następnie w (2S)-metylomalonyl-CoA; podczas inżynierii mającej na celu dopełnienie tego szlaku, gen sfp wprowadzono do chromosomu E. coli BL21(DE3), tworząc nowy szczep nazwany BAP1. Enzym Sfp jest fosfopanteteinylotransferazą zdolną do przyłączenia kofaktora 4'-fosfopanteteiny do enzymów DEBS ^17,18. Trzy geny DEBS (każdy o wielkości ~10 kb) umieszczono następnie w dwóch oddzielnie selekcjonowalnych wektorach ekspresyjnych zawierających indukowalne promotory T7. Po kluczowej korekcie temperatury po indukcji (do 22 °C), geny DEBS zostały skoordynowanie wyekspresowane w szczepie BAP1 w stanie aktywnym, zdolnym do generowania 6dEB ¹⁹.

Dążenie do pełnej biosyntezy erytromycyny A rozpoczęto następnie z wykorzystaniem analogicznego klastra genów z Micromonospora megalomicea lub hybrydowego szlaku składającego się z genów S. erythraea, S. fradiae oraz S. venezuelae, które produkowały odpowiednio produkty pośrednie: erytromycynę C i 6-deoksyerytromycynę D ^20-22. Niedawno nasz zespół rozszerzył te wysiłki, produkując erytromycynę A (najbardziej istotną klinicznie formę erytromycyny) przy użyciu E. coli. W przeciwieństwie do wcześniejszych prac, nasza strategia polegała na skoordynowanej ekspresji 20 oryginalnych genów S. erythraea niezbędnych do biosyntezy poliketydów, biosyntezy i przyłączania deoksycukrów, dodatkowej modyfikacji oraz autorezystencji (Rycina 2). W sumie zmodyfikowano 26 genów (natywnych i heterologicznych), aby umożliwić E. coli produkcję erytromycyny A na poziomie 4 mg/L ^23,24. Wynik ten potwierdził możliwość pełnej produkcji złożonego naturalnego produktu poliketydowego przy użyciu E. coli i stanowi podstawę do wykorzystania tej nowej opcji produkcyjnej lub poszukiwania nowych rozwiązań.

Protokół

Poniższy tekst odnosi się konkretnie do antybiotyku erytromycyny A, jednak opisane kroki zostały zaprojektowane tak, aby można było je zastosować ogólnie do innych produktów naturalnych będących kandydatami do biosyntezy heterologicznej.

1. Transfer genetycznego klastra erytromycyny A

1. Zaprojektuj primery PCR do amplifikacji wszystkich genów związanych z klastrem erytromycyny A w chromosomie S. erythraea. Krok ten dotyczy tych kandydatów na produkty naturalne, których sekwencje genetyczne zostały określone. Alternatywnie wymagane geny można zsyntetyzować (korzystając z ofert kilku dostawców komercyjnych), co daje zaletę w postaci możliwości zaprojektowania nowo syntetyzowanych genów pod kątem optymalnego wykorzystania kodonów w nowym gospodarzu E. coli. W przypadku syntezy DNA aktualnym wyzwaniem jest generowanie genów megasyntetaz, których długość może przekraczać 10 kb. Technicznie synteza jest możliwa, lecz jest trudna i kosztowna. Przewiduje się, że ciągłe ulepszenia w technologii syntezy genów wyeliminują obecne niedogodności i dalej potwierdzą słuszność tego podejścia w dostarczaniu heterologicznego materiału genetycznego.
2. Przeprowadź PCR, wykorzystując jako matrycę świeżo przygotowane DNA genomiczne S. erythraea. DNA chromosomalne można przygotować z kultur S. erythraea lub z mrożonych zasobów bakterii (Rycina 3)²⁵. Reakcje PCR mogą przynieść korzyść z dodatku DMSO (4 μl w reakcjach 50 μl), aby zniwelować wpływ wysokiej zawartości G+C w docelowych genach S. erythraea. Każdy amplifikowany gen powinien zostać zsekwencjonowany, aby potwierdzić odzyskanie pełnego genu oraz brak mutacji wprowadzonych podczas procesu PCR.
3. Poprzez trawienie restrykcyjne i ligację wprowadź każdy z wyizolowanych genów do wektorów ekspresyjnych zaprojektowanych dla E. coli (Rycina 3). Proces ten rozpoczyna się od zaprojektowania miejsc restrykcyjnych w primerach PCR, aby umożliwić trawienie i ligację do odpowiednich wektorów ekspresyjnych (przykład zamieszczono na Rycynie 3). Wykorzystano wektory pET21 oraz pET28. Wektor pET28 umożliwia włączenie sekwencji liderowej 5', co pomogło w ekspresji genów w przypadku erytromycyny A. Potwierdź ekspresję poszczególnych genów za pomocą RT-PCR, analizy SDS-PAGE (z użyciem frakcji białek rozpuszczalnych) lub odpowiednich testów fenotypowych (Rycina 4).
4. Skonstruuj operony na podstawie genów pomyślnie wyekspresowanych z poszczególnych plazmidów ekspresyjnych (Rycina 3). Tradycyjnie stosowano kombinacje kompatybilnych enzymów restrykcyjnych o spójnych końcach (takich jak XbaI i SpeI) ²⁴, aby sekwencyjnie przekształcać geny w operony; jednak miejsca restrykcyjne wybrane do konstrukcji operonu nie mogą znajdować się w sekwencjach wyizolowanych genów (lub muszą zostać z nich usunięte), co można uniknąć, stosując syntezę genów. Krok ten konsoliduje 20 genów erytromycyny A przed transformacją E. coli. Obecnie metodą tą wprowadzono do standardowego wektora pET do 20 kb obcego DNA (dwa geny po ok. 10 kb każdy). Co więcej, podejście to wykorzystano do generowania operonów zawierających dziewięć genów. Nie jest dokładnie znane, jaka ilość DNA lub ile genów może zostać zintegrowanych z plazmidami typu pET; jednak powyższe wartości stanowią punkt odniesienia dla skomplikowanych układów, takich jak szlak biosyntezy erytromycyny. Wreszcie, standardowe etapy ligacji in vitro i następujące po nich etapy udanej transformacji stają się coraz trudniejsze wraz ze wzrostem rozmiaru operonu i plazmidu. Temperatura ligacji (12-22 °C) i czas (3-24 h) są zmienne, a do wspomagania procesu tworzenia końcowych konstruktów plazmidowych stosuje się elektrotraformację.
5. Wprowadź nowo zaprojektowane plazmidy biosyntetyczne do szczepu E. coli BAP1 za pomocą elektrotraformacji (Rycina 5). Procedurę można próbować, wprowadzając plazmidy sekwencyjnie lub w kombinacji. Przy transformacji plazmidów o znacznych rozmiarach lub ich licznej grupy tradycyjnie stosowano elektrotraformację (w przeciwieństwie do transformacji chemicznej). Po transformacji wysiej komórki na stałą pożywkę LB zawierającą tetracyklinę (5 mg/l), karbenycylinę (100 mg/l), kanamycynę (50 mg/l), streptomycynę (50 mg/l) i apramycynę (50 mg/l), aby wyselekcjonować komórki utrzymujące plazmidy. Stosowanie sześciu różnych antybiotyków selekcyjnych po transformacji komórki E. coli jest bardzo rzadkie, lecz odzwierciedla to po prostu całkowitą liczbę plazmidów niezbędnych do końcowej biosyntezy erytromycyny A. Choć jest to możliwe, podejście to ograniczy możliwości produkcyjne związku po rozpoczęciu hodowli (patrz poniżej).

2. Rekonstytucja biosyntetyczna w E. coli

1. Szczep BAP1 został zaprojektowany tak, aby dostarczać substratów niezbędnych do biosyntezy oraz modyfikować potranslacyjnie megasyntazę deoxyerytronolidu B. Pojedyncze geny szlaku erytromycyny A zostały przetestowane pod kątem ekspresji genów i skonsolidowane jako operony w plazmidach ekspresyjnych. Niniejsza sekcja poświęcona jest warunkom hodowli w celu sprawdzenia skoordynowanej aktywności pełnego szlaku erytromycyny A.
2. Pobrać 3 oddzielne kolonie świeżo transformowanego szczepu BAP1 i zaszczepić je w 1,5 ml kultur LB zawierających wymagane antybiotyki selekcyjne dla plazmidów (w stężeniach tych samych, co powyżej, stosowanych do selekcji transformantów na podłożu stałym), izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG; 100 μM) oraz arabinozę (2 mg/ml) w celu indukcji ekspresji genów, a także 20 mM propionianu sodu w celu wsparcia wewnątrzkomórkowego tworzenia prekursorów biosyntetycznych. Po potwierdzeniu produkcji można przeprowadzić hodowlę w większej skali w celu zwiększenia i maksymalizacji miana produktu.
3. Hodować komórki w temperaturze 22 °C przy 250 rpm przez 24-48 h. W tym przypadku selekcja antybiotykowa zapewnia utrzymanie wymaganych plazmidów we wczesnych etapach hodowli komórkowej. Jednak plazmidy mogą zostać łatwo utracone wraz ze zmianą poziomu antybiotyku selekcyjnego w czasie trwania hodowli. Może to prowadzić do niestabilności plazmidów (i.e., utraty jednego lub więcej plazmidów podczas hodowli), co z kolei ograniczy zdolność produkcyjną. Problem ten pogłębia się, gdy do wprowadzenia pełnego heterologicznego klastra genów stosuje się plazmidy niekompatybilne. Ma to miejsce w przypadku związku erytromycyna A (Rycina 5) i musiałoby zostać rozwiązane, aby rzeczywiście uzyskać nadekspresję związku w E. coli. Jednak w celu wykazania początkowej produkcji takie błędy projektowe są tolerowane, aby szybko ustalić wykonalność podejścia heterologicznego.
4. Kultury oczyścić poprzez wirowanie przy 10 000 rpm w mikrocentry fudze Eppendorf. Usunąć nadkład i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
5. W przypadku erytromycyny A problem braku produkcji związku rozwiązano poprzez włączenie chaperonin GroES/EL (stosując konkretnie pGro7, aby zniwelować brak aktywności enzymów po ekspresji) oraz wprowadzenie dodatkowych kopii genów (w przypadku genów, co do których podejrzewano słabą ekspresję/aktywność). Podobne strategie mogą być wymagane przy innych próbach heterologicznej produkcji naturalnych produktów.

3. Analiza produktu

1. Aby potwierdzić i ilościowo określić tworzenie erytromycyny A, wstrzyknij nadsącz z hodowli do systemu LC-MS (Rycina 6). W celu potwierdzenia produkcji oraz jako standard podczas kwantyfikacji wykorzystano komercyjnie dostępną erytromycynę A. W przypadku braku komercyjnie dostępnych standardów, analiza LC-MS wymagałaby dodatkowej charakterystyki chemicznej za pomocą NMR i wysokorozdzielczej spektrometrii mas.
2. Porównaj poziom produkcji pomiędzy 3 koloniami/hodwlami z transformacji BAP1. Wybierz producenta o najwyższej wydajności i przygotuj bank glycerolowy z danej kolonii. Krok ten można przeprowadzić równolegle z hodowlami produkcyjnymi z Sekcji 2 Protokołu, wykorzystując niewielką część kultur do przygotowania banków glycerolowych. Przechowuj bank glycerolowy w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
3. Używając potwierdzonego szczepu o najwyższej wydajności, rozpocznij oddzielną hodowlę produkcyjną i wyekstrahuj końcowy nadsącz dwukrotną objętością octanu etylu. Użyj systemu odparowania próżniowego do wysuszenia ekstraktu, a następnie zawieś go ponownie w 100 μl metanolu. Przenieś ekstrakt na sterylny dysk filtracyjny (średnica ok. 1/4 cala) i poczekaj, aż dysk wyschnie. Osobno hoduj B. subtillis w płynnym medium LB przez noc. Dodaj 20 μl kultury B. subtilis do 20 ml płynnego agaru LB w temperaturze 45 °C. Wylej agar na płytki i poczekaj, aż stężeje. Umieść dysk filtracyjny na płytce i inkubuj w temperaturze 37 °C (Rycina 7). Alternatywnie, ekstrakt można dodać do kultur płynnych w płytce 96-dołkowej, aby określić aktywność ilościowo za pomocą czytnika płytek (Rycina 7).

Wyniki

Pożądanym rezultatem tego podejścia jest otrzymanie w pełni bioaktywnego produktu naturalnego z heterologicznego gospodarza E. coli. Najlepiej obrazują to wyniki LC-MS wykorzystane do potwierdzenia i ilościowego oznaczenia produkcji (Rysunek 6) oraz test bioaktywności przeciwbakteryjnej służący do potwierdzenia końcowej aktywności (Rysunek 7). W ogólnym schemacie biosyntezy heterologicznej wynik ten definiuje sukces. Po jego osiągnięciu wysiłki badawcze koncentrują się na optyma...

Dyskusja

Kluczowe etapy biosyntezy heterologicznej występują w trzech punktach proceduralnych procesu: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstytucja biosyntezy; oraz 3) analiza produktu. Problem na dowolnym etapie uniemożliwi osiągnięcie ostatecznego celu, jakim jest ustanowienie biosyntezy heterologicznej. Być może najtrudniejszym aspektem procesu jest ustanowienie rekonstytuowanej biosyntezy, ponieważ jest ona absolutnie niezbędna do przeprowadzenia pomyślnej analizy. Jednak rekonstytucja zależy od starannego zaprojektowania i trans...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Termocykler PCR	Eppendorf	Mastercycler personal
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher	BP231
Elektroporator	BioRad	Micropulser
IPTG	Fisher	BP1620
Propionian sodu	Sigma	P1880
L-arabinoza	Sigma	A3256
Inkubator z wytrząsaniem i chłodzeniem	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Mikrowirówka	Eppendorf	Centrifuge 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Plasmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Octan etylu	Sigma	270989
Metanol	Sigma	322415
Wirówka próżniowa	Eppendorf	Concentrator 5301
Rotawapor	Buchi	R-200