Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Tzu-Hsing Kuo; Arun Handa; Julie A. Williams

doi:10.3791/4355

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4355

⸱

4 grudnia 2012

Tzu-Hsing Kuo¹ , Arun Handa¹ , Julie A. Williams¹

¹Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Streszczenie

Złożona interakcja między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem gospodarza została opisana u szerokiego spektrum gatunków. Nadmierna senność, w szczególności, jest znana jako reakcja na infekcję u ssaków ¹, a ostatnio opisano ją również u Drosophila melanogaster². Powszechnie przyjmuje się, że sen jest korzystny dla gospodarza podczas infekcji i jest istotny dla utrzymania sprawnego układu odpornościowego^3,4. Jednak dowody eksperymentalne wspierające tę hipotezę są ograniczone⁴, a funkcja nadmiernego snu podczas odpowiedzi immunologicznej pozostaje niejasna. W celu rozwiązania tego złożonego problemu zastosowaliśmy podejście multidyscyplinarne i przeprowadziliśmy badania na prostym genetycznym modelu systemowym, jakim jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. Wykorzystujemy standardowy test do pomiaru zachowań lokomotorycznych i snu u much, wykazując, w jaki sposób test ten służy do pomiaru zachowania much zainfekowanych patogennym szczepem bakterii. Test ten jest również przydatny do monitorowania czasu przeżycia poszczególnych much podczas infekcji. Dodatkowe miary funkcji immunologicznych obejmują zdolność much do eliminacji infekcji oraz aktywację NFκB, kluczowego czynnika transkrypcyjnego, który jest centralny dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u Drosophila. Zarówno przeżywalność, jak i eliminacja bakterii podczas infekcji są wspólnie wskaźnikami oporności i tolerancji na infekcję. Oporność odnosi się do zdolności much do eliminacji infekcji, podczas gdy tolerancja jest definiowana jako zdolność gospodarza do ograniczania uszkodzeń spowodowanych infekcją, a tym samym do przetrwania mimo wysokiego poziomu patogenu w organizmie⁵. Monitorowanie aktywności NFκB w czasie rzeczywistym podczas infekcji pozwala zrozumieć molekularny mechanizm przeżycia w trakcie infekcji. Wykorzystanie Drosophila w tych prostych testach ułatwia analizy genetyczne i molekularne snu oraz odpowiedzi immunologicznej, a także badanie wzajemnego wpływu tych dwóch złożonych systemów.

Protokół

Niniejszy protokół wykorzystuje dwa układy (Rysunek 1) do uzyskania czterech różnych odczytów pobranych od much poddanych infekcji bakteryjnej. Wyniki te obejmują: 1) zachowania związane ze snem i czuwaniem; 2) przeżywalność; 3) miano bakterii w organizmie muchy; oraz 4) pomiar aktywności reportera NFκB in vivo w czasie rzeczywistym. W połączeniu z narzędziami genetycznymi dostępnymi u Drosophila, pomiary te pozwalają na mechanistyczne zrozumienie molekularnego związku między funkcją odpornościową a zachowaniem.

1. Pomiar aktywności lokomotorycznej i snu u much

Układ wykorzystywany do pomiaru aktywności lokomotorycznej i snu u much, obejmujący system monitorowania aktywności Drosophila (DAM2, Trikinetics), inkubatory, ciemnię oraz sposób przygotowania zwierząt doświadczalnych i probówek do pomiaru aktywności, został opisany wcześniej⁶. W niniejszej pracy zastosowano to samo podejście z niewielkimi modyfikacjami.
1. Oświetlenie inkubatora jest sterowane przez sam inkubator. Dlatego ważne jest zsynchronizowanie ustawień czasu w komputerze i inkubatorach.
2. Probówki do pomiaru aktywności są czyszczone w celu ponownego użycia poprzez gotowanie na płycie grzejnej w wodzie dejonizowanej. Podczas pierwszego gotowania dodaje się niewielką ilość detergentu, a następnie probówki są dokładnie płukane i gotowane dwukrotnie. Jeśli do zatykania probówek użyto przędzy, zużyte probówki (zawierające pożywkę, wosk, muchę i przędzę) można czyścić bez uprzedniego usuwania przędzy.
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić hodowle zawierające muchy w późnym stadium poczwarki w inkubatorach na trzy do czterech dni, aby zaadaptowały się do eksperymentalnego oświetlenia i innych warunków środowiskowych. Do pomiaru zachowań związanych ze snem powszechnie stosuje się warunki cyklu światło:ciemność lub warunki stałe. W tym przykładzie muchy są aklimatyzowane do stałego światła, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie^2,7,8. Zgodnie z opisem na Rysunku 1A, należy umieścić muchy w wieku 1-4 dni w monitorach aktywności Trikinetics DAM2 zgodnie z opisem⁶ i prowadzić pomiary przez minimum trzy dni przed infekcją.

2. Zakażanie much patogennym szczepem bakterii

Opisany tutaj protokół jest specyficzny dla S. marcescens, których hodowla i utrzymanie są łatwe. Protokoły dotyczące długoterminowego przechowywania i warunków hodowli dla innych gatunków bakterii będą się różnić. S. marcescens przechowuje się w 15-50% glicerolu w temperaturze -80 °C. Aby przygotować próbki do długoterminowego przechowywania, w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wymieszaj 2 objętości nocnej hodowli bakteryjnej (O.D. ₆₀₀ = 0,5 - 1,0) z 1 objętością autoklawowanego 50% glicerolu. Przyniesie to końcowe stężenie glicerolu wynoszące 17%. Probówki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby przygotować krótkoterminowe źródło bakterii do użytku, zeskrob zamrożony stok sterylnym końcem pipety 200 μl i wykonaj posiew metodą smugową (streak plate) w trzech kierunkach na płytce z agarem LB. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać izolowane kolonie. Płytkę przechowuj w temperaturze 4 °C.
Na jeden dzień przed planowaną infekcją pobierz pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB sterylnym końcem pipety 200 μl i zanurz końcówkę w probówce z 5 ml medium LB. Hoduj bakterie przez noc lub do 16 h w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przy 250 rpm, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru przy OD₆₀₀. Stężenie w tej fazie mieści się w zakresie od 0,5 do 1. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, wykonaj subkulturę bakterii i hoduj je przez kolejne kilka godzin, aby uzyskać optymalne stężenie. Procedurę wykonuj w pobliżu źródła płomienia. Niektóre szczepy bakteryjne są zmodyfikowane pod kątem oporności na antybiotyki i są hodowane oraz selekcjonowane z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku do medium. S. marcescens (ATCC #8100) nie są oporne na antybiotyki, dlatego są hodowane w sterylnym medium bez antybiotyku. Aby zweryfikować technikę sterylną, wykonaj kulturę pozorowaną (mock culture) bez bakterii jako kontrolę.
Roztwór do infekcji much zawiera bakterie (rozcieńczone do OD₆₀₀=0,1) i 1% barwnika spożywczego (Brilliant Blue FCF) w PBS. Przygotuj roztwór do kontroli wstrzykiwania, dodając równą ilość medium LB, jaka została użyta w roztworze do infekcji, oraz 1% niebieskiego barwnika spożywczego w PBS. Roztwory przechowuj na lodzie.
Przygotuj szklane igły do wstrzykiwania much. Wyciągnij kapilary szklane (o.d. = 1 mm, i.d. = 0,58 mm, WPI) do cienkiej końcówki za pomocą wyciągarki do mikropipet (Narishige). Pod mikroskopem stereoskopowym, używając precyzyjnej pęsety, odłam końcówkę igły tak, aby otwór był wystarczająco duży, by wypełnić go płynem do wstrzykiwania poprzez zassanie strzykawką, ale jednocześnie na tyle mały, aby zminimalizować uszkodzenia muchy podczas procesu wstrzykiwania. Po odłamaniu końcówka powinna mieć rozmiar około 40-50 μm. Szklana igła jest przymocowana do plastikowej strzykawki o pojemności 3 cc za pomocą odcinka rurki. Przepływ medium do wstrzykiwania jest kontrolowany ręcznie poprzez przykładanie nadciśnienia lub ssanie strzykawką. Unikaj zanieczyszczenia gumowej rurki płynem do wstrzykiwania, ponieważ zestaw ze strzykawką jest używany zarówno do infekcji, jak i do wstrzykiwań kontrolnych.
Znieczul muchy, umieszczając je na podkładce z CO₂. CO₂ jest przepuszczany przez szczelny pojemnik z wodą, aby nawilżyć podkładkę i zredukować elektryczność statyczną, która może utrudniać manipulację muchami na podkładce. Wstrzyknij preparat, wprowadzając szklaną igłę w obszar nad scutellum na grzbietowej stronie klatki piersiowej. Przeniesienie medium do wnętrza muchy jest weryfikowane za pomocą barwnika spożywczego – muchy stają się niebieskie w miarę rozprzestrzeniania się barwnika w organizmie. Dawkę bakterii, którą otrzymują muchy, można określić ilościowo zgodnie z opisem w Sekcji 3 poniżej. Niektóre schematy eksperymentalne obejmują grupę kontrolną, która otrzymuje uraz aseptyczny poprzez wstrzyknięcie PBS z barwnikiem spożywczym, ale bez bakterii.

3. Oznaczenie ładunku bakteryjnego

Jednym ze sposobów oceny odpowiedzi immunologicznej na infekcję bakteryjną jest oznaczenie ładunku bakteryjnego po zakażeniu. D. melanogaster stanowi doskonały model do wyznaczania tego parametru, ponieważ cała mucha może zostać poddana homogenizacji w celu oszacowania całkowitej liczby bakterii w organizmie. Podstawą tego protokołu jest fakt, że podczas wzrostu na podłożu stałym, takim jak agar w bulionie Luria (LB) na szalce Petriego (szalka LB), pojedyncza bakteria tworzy widoczną, odróżnialną kolonię. W związku z tym, poprzez homogenizację zakażonych much w płynnym podłożu LB, przygotowanie rozcieńczeń seryjnych homogenatu i wysianie rozcieńczonego homogenatu na szalki LB, można oznaczyć liczbę komórek bakteryjnych zakażających muchę. W celu weryfikacji, czy infekcja nie została zanieczyszczona innymi gatunkami bakterii, należy zastosować grupę kontrolną much wstrzykniętych PBS i barwnikiem spożywczym, ale bez bakterii. W tym przypadku na płytce z agarem LB nie powinny pojawić się żadne kolonie.

Przed przystąpieniem do właściwego etapu homogenizacji należy wysterylizować w autoklawie wszystkie materiały, które będą wykorzystywane w tej procedurze. Dotyczy to końcówek do pipety 200 μl przeciętych nożyczkami, pożywek LB oraz tłuczków używanych do homogenizacji. Płytki należy przygotować, wlewając wysterylizowane w autoklawie podłoże LB/agar do sterylnych szalek Petriego o średnicy 10 cm co najmniej 1 dzień przed homogenizacją much.
Muchy należy znieczulić, zebrać do probówek mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać probówki w lodzie.
Homogenizację należy przeprowadzać w pobliżu płomienia, aby zapobiec kontaminacji. Zaleca się wykonanie homogenizacji kontrolnej z użyciem much niezinfekowanych, szczególnie w przypadku stosowania szczepów bakteryjnych takich jak S. marcescens, które nie są oporne na antybiotyki. Należy homogenizować minimum 2 grupy po 10 much w każdym wariancie doświadczalnym. Liczbę much użytych do jednego homogenatu określa badacz. Niektóre grupy stosowały jedną muchę na homogenat, co jest przydatne do oceny zmienności obciążenia bakteryjnego między poszczególnymi muchami⁸, podczas gdy inne stosowały od 3 do 10 much na homogenat w celu porównania genotypów lub warunków doświadczalnych^9-12.
1. Do każdej probówki mikrocentryfugowej zawierającej muchy należy dodać 400 μl pożywki LB i przeprowadzić homogenizację za pomocą małego motoru z tłuczkiem (Kontes).
2. Używając wysterylizowanych, przeciętych końcówek do pipety, należy wykonać rozcieńczenie szeregowe homogenatu w stosunku 1:10, dodając 20 μl homogenizowanego podłoża LB/bakteryjnego do probówki mikrocentryfugowej 1,5 μl zawierającej 180 μl pożywki LB. Przecięcie końcówek do pipety zapobiega ich zatykaniu przez szczątki much i zapewnia przeniesienie odpowiedniej objętości.
3. Współczynnik rozcieńczenia określa się empirycznie i zależy on od genotypu muchy, zastosowanego szczepu bakteryjnego oraz warunków doświadczalnych. Dla much typu dzikiego zainfekowanych S. marcescens należy stosować rozcieńczenia 1:10² lub 1:10³ dla much homogenizowanych bezpośrednio po infekcji oraz rozcieńczenia 1:10⁴ lub 1:10⁵ dla much homogenizowanych 24 hr po infekcji.
4. Należy nanieść 100 μl podłoża LB/bakteryjnego z probówek mikrocentryfugowych zawierających ostateczne rozcieńczenie i rozprowadzić podłoże na płytce LB za pomocą szklanych kulek (VWR), aby zapewnić równomierny rozkład.
5. Szklane kulki należy wyrzucić do 100% roztworu EtOH. Płytki LB należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.
6. W ramach opcjonalnego kroku można użyć systemu obrazowania ze światłem widzialnym w celu uzyskania obrazu płytek LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Liczbę kolonii należy zliczyć bezpośrednio na płytce lub na podstawie obrazu płytki, korzystając z narzędzia do liczenia w oprogramowaniu Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
7. Liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na jedną muchę oblicza się według wzoru: [n /(N *D *v)]*V; gdzie n = liczba kolonii wyrosłych na płytce LB; N = liczba much połączonych w jednej probówce mikrocentryfugowej; D = współczynnik rozcieńczenia; v = objętość roztworu rozniesionego na każdą płytkę; V = początkowa objętość homogenatu.

4. Ocena snu i czasu przeżycia po infekcji

W przypadku much, które nie są pobierane do pomiaru ładunku bakteryjnego, kontynuuj monitorowanie zachowania przez kolejne 7-10 dni. Czas przeżycia zależy od genotypu muchy, warunków środowiskowych oraz gatunku bakterii użytych do infekcji.
Po około 10 dniach zakończ eksperyment, pobierz i przetwórz dane behawioralne zgodnie z wcześniejszym opisem⁶. Do analizy parametrów snu wykorzystywane jest specjalistyczne oprogramowanie Insomniac2, oparte na środowisku Matlab. Należy pamiętać o wyeliminowaniu martwych much z analizy behawioralnej. Zazwyczaj ogranicza to analizy do pierwszego dnia po infekcji, w zależności od rodzaju infekcji i genotypu muchy. Śmierć w teście jest sygnalizowana momentem, w którym wszystkie zliczenia aktywności spadają do zera. Aby ułatwić analizę przeżywalności, do przetwarzania surowych plików danych z systemu Trikinetics DAM używa się Drosonex – specjalistycznego oprogramowania napisanego w języku Microsoft Visual C++ 6.0. Oprogramowanie to generuje pliki Excel zawierające czas przeżycia każdej muchy (w godzinach), kompiluje dane o aktywności ze wszystkich monitorów w jednym arkuszu oraz raportuje procent przeżywających much w czasie zgodnie z ustawieniami użytkownika. Pliki Excel są zaprojektowane tak, aby można było je zintegrować z innymi pakietami oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.

5. Pomiar aktywności NFκB podczas infekcji z użyciem testu reporterowego lucyferazy

Transgeniczne muchy κB-luc wykorzystane w tym teście zostały wygenerowane wcześniej, zgodnie z opisem w Kuo et al., 2010². W skrócie, reporter κB-luc zawiera 8 powtórzeń sekwencji wiążącej NFκB, które zostały wstawione do promotora powyżej ramki odczytu lucyferazy.

Dostosuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetlenia zgodnie z opisem w sekcji 1.2. W tym przykładzie muchy κB-luc w wieku 1-4 dni są utrzymywane w fiolkach zawierających pożywkę z 5% sacharozy i 2% agaru i umieszczane w stałym świetle (LL) przez 2 dni, aby osiągnęły ten sam wiek co pozostałe muchy w momencie infekcji.
Przygotuj mikropłytkę 96-dołkową dla much. Każdy dołek zawiera 2 warstwy pożywki (Rysunek 2); warstwa wierzchnia zawiera lucyferynę, która jest substratem lucyferazy. Do każdego dołka dodaj 300 μl roztworu 5% sacharozy i 2% agaru i pozostaw do stężenia. Następnie do każdego dołka dodaj 50 μl warstwy wierzchniej zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru i 2 mM lucyferyny (Gold BioTechnology, Inc.). Stężenia lucyferyny stosowane do pomiaru aktywności reportera u Drosophila różniły się w literaturze i wynosiły nawet 100 μM¹³. Wymagane stężenie można określić empirycznie. Pomiędzy nakładaniem warstw pożywki przykryj płytkę gęstą tkaniną z siatki, aby ułatwić suszenie przy zachowaniu sterylności. Należy pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia, nawet do jednej godziny, aby zapobiec przyklejaniu się much do kropel kondensatu. Ponieważ lucyferyna jest światłoczuła, należy unikać wystawiania płytek na światło bardziej niż jest to konieczne.
Nałóż przezroczystą folię klejącą (Top-Seal-A; Perkin Elmer) na mikropłytkę 96-dołkową i wykonaj perforacje za pomocą cienkiej igły, robiąc 2 otwory na dołek. Otwory te będą nie tylko umożliwiać wymianę powietrza w każdym dołku, ale także pozwolą na znieczulanie much indywidualnie. Za pomocą ostrego ostrza i linijki wykonaj nacięcia między każdą kolumną. Umożliwi to łatwe wprowadzanie i usuwanie much w grupach po 8 osobników.
Aby wprowadzić muchy do mikropłytki, wyjmij fiolki z inkubatora i znieczul muchy na podkładce z CO₂. Wprowadzaj muchy pojedynczo do każdego dołka, kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przypadkowo przyklei się do folii uszczelniającej, pozostaw ją w spokoju, ponieważ często są one w stanie uwolnić się bez ingerencji. Wróć z mikropłytką do inkubatora w warunkach LL na 8-24 h, aby muchy zaadaptowały się do nowego środowiska i skonsumowały substrat lucyferyny.
Wyhoduj bakterie S. marcescens i przygotuj roztwór do infekcji zgodnie z powyższym opisem.
Znieczul muchy, używając końcówki mikropipety podłączonej do linii CO₂ niskiego ciśnienia. Umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi wykonanymi dla każdego dołka. Zachowaj ostrożność, aby ciśnienie CO₂ było wystarczająco wysokie, by znieczulić muchę, ale na tyle niskie, by uniknąć jej zranienia. Przenoś pojedynczo każdą muchę w grupach po osiem na podkładkę z CO₂ i zainfekuj zgodnie z powyższym opisem. Po infekcji zwróć każdą muchę do jej pierwotnego dołka i ponownie zamknij mikropłytkę.
Zmierz luminescencję (licznik luminescencji i scyntylacji TopCount-NXT; Perkin-Elmer). Licznik luminescencji TopCount posiada kasetę ładunkową na płytki, która umożliwia zaprogramowane i zautomatyzowane odczyty w sposób ciągły w żądanych odstępach czasu przez dowolny okres (zazwyczaj do pięciu dni). Funkcja ta nie jest dostępna we wszystkich instrumentach, dlatego gromadzenie danych w eksperymentach przeprowadzanych na innych urządzeniach może być rzadsze. Licznik luminescencji znajduje się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą i harmonogramem oświetlenia. Podczas ładowania płytek do kasety, układaj płytki z muchami pomiędzy przezroczystymi płytkami pustymi, aby zapewnić muchom dostęp do światła. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta, aby zbierać odczyty co godzinę przez minimum 24 h. W tym przykładzie detektory są zaprogramowane tak, aby odczytywać każdy dołek przez 10 s i wyrażać wynik jako liczbę impulsów (jednostki arbitralne) na sekundę. Wartość ta jest uśredniana z 3 odczytów na dołek. Wyeksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź standardową analizę, przedstawiając wyniki luminescencji na wykresie.