Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

DOI:

10.3791/4355

⸱

4 grudnia 2012

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru zachowania lokomotorycznego u Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolności muszek do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżycia, obciążenia bakteryjnego i aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożona interakcja między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem gospodarza została opisana u wielu gatunków. W szczególności wiadomo, że nadmiar snu występuje jako reakcja na infekcję u ssaków 1, a ostatnio został również opisany u Drosophila melanogaster2. Ogólnie przyjmuje się, że sen jest korzystny dla gospodarza podczas infekcji i że jest ważny dla utrzymania silnego układu odpornościowego3,4. Jednak dowody eksperymentalne potwierdzające tę hipotezęsą ograniczone4, a funkcja nadmiernego snu podczas odpowiedzi immunologicznej pozostaje niejasna. Zastosowaliśmy multidyscyplinarne podejście, aby rozwiązać ten złożony problem i przeprowadziliśmy badania na prostym systemie modelu genetycznego, muszce owocowej Drosophila melanogaster. Używamy standardowego testu do pomiaru zachowania lokomotorycznego i snu u much i pokazujemy, w jaki sposób ten test jest używany do pomiaru zachowania u much zakażonych patogennym szczepem bakterii. Test ten jest również przydatny do monitorowania czasu przeżycia poszczególnych much podczas infekcji. Dodatkowe miary funkcji immunologicznej obejmują zdolność much do usuwania infekcji i aktywację NFκB, kluczowego czynnika transkrypcyjnego, który ma kluczowe znaczenie dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u Drosophila. Zarówno wynik przeżycia, jak i klirens bakteryjny podczas infekcji są wskaźnikami oporności i tolerancji na zakażenie. Oporność odnosi się do zdolności much do usuwania infekcji, podczas gdy tolerancja jest definiowana jako zdolność gospodarza do ograniczania uszkodzeń spowodowanych infekcją, a tym samym przetrwania pomimo wysokiego poziomu patogenu w systemie5. Monitorowanie aktywności NFκB w czasie rzeczywistym podczas infekcji zapewnia wgląd w molekularny mechanizm przetrwania podczas infekcji. Zastosowanie Drosophila w tych prostych testach ułatwia genetyczne i molekularne analizy snu i odpowiedzi immunologicznej oraz wzajemnego wpływu tych dwóch złożonych systemów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje dwie konfiguracje (Rysunek 1) do uzyskania czterech różnych odczytów pobranych od much poddanych infekcji bakteryjnej. Te dane wyjściowe obejmują: 1) zachowanie w trybie uśpienia/czuwania; 2) wynik przeżycia; 3) obciążenie bakteryjne w muchy; oraz 4) pomiar aktywności reporterowej NFκB in vivo w czasie rzeczywistym. W połączeniu z narzędziami genetycznymi, które są dostępne u Drosophila, pomiary te zapewniają mechanistyczny wgląd w molekularne powiązanie między funkcją immunologiczną a zachowaniem.

1. Mierz aktywność lokomotoryczną i sen u much.

  1. Układ używany do pomiaru aktywności lokomotorycznej i snu u muszek, który obejmuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM2, Trikinetics), inkubatory, ciemnię oraz przygotowanie zwierząt doświadczalnych i probówek aktywności, został opisany wcześniej6. To samo podejście jest stosowane tutaj, z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Oświetlenie inkubatora jest kontrolowane przez sam inkubator. Dlatego ważne jest, aby zsynchronizować ustawienia czasu między komputerem a inkubatorami.
    2. Probówki aktywności są czyszczone do ponownego użycia poprzez gotowanie na gorącej płycie w wodzie dejonizowanej. Do pierwszego gotowania dodaje się niewielką ilość detergentu, rurki dobrze się płucze i gotuje jeszcze dwa razy. Jeśli do zatkania rurki używana jest przędza, zużyte rurki aktywności (zawierające żywność, wosk, muchę i przędzę) można wyczyścić bez wcześniejszego usuwania przędzy.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść kultury zawierające muchy w stadium późnej poczwarki w inkubatorach na trzy do czterech dni, aby przystosować się do eksperymentalnego oświetlenia i innych warunków środowiskowych. Światło: ciemne lub stałe warunki są powszechnie używane do pomiaru zachowania podczas snu. W tym przykładzie muchy są przyzwyczajone do stałego światła, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie2,7,8 . Jak opisano na rysunku 1A, 1-4-dniowe muchy są umieszczane w monitorach aktywności Trikinetics DAM2 zgodnie z opisem6 i rejestrują przez co najmniej trzy dni przed infekcją.

2. Zarażaj muchy patogennym szczepem bakterii

  1. Opisany tutaj protokół jest specyficzny dla S. marcescens, które są łatwe w uprawie i utrzymaniu. Protokoły dotyczące warunków długotrwałego przechowywania i hodowli innych gatunków bakterii będą się różnić. S. marcescens są przechowywane w 15-50 % glicerolu w temperaturze -80 °C. Aby przygotować się do długotrwałego przechowywania, wymieszaj 2 objętości nocnej kultury bakteryjnej (OD 600 = 0,5 - 1,0) z 1 objętością autoklawowanego 50% glicerolu w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Spowoduje to końcowe stężenie glicerolu na poziomie 17%. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C. Aby przygotować krótkotrwałe źródło bakterii w użyciu, zeskrob zamrożony wywar sterylną końcówką pipety o pojemności 200 μl i wykonaj trójkierunkową smugę na płytce agarowej LB. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać izolowane kolonie. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C.
    Na dzień przed planowanym zakażeniem należy pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl i zanurzyć końcówkę w probówce hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki LB. Hoduj bakterie przez noc lub do 16 godzin w wytrząsarce inkubatora w temperaturze 37 °C i 250 obr./min, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru o średnicy zewnętrznej600. Stężenie w tej fazie waha się od 0,5 do 1. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, należy przeprowadzić subkulturę bakterii i rozmnażać się przez kolejne kilka godzin, aby uzyskać optymalne stężenie. Wykonaj procedurę w pobliżu źródła płomienia. Niektóre szczepy bakteryjne są modyfikowane pod kątem oporności na antybiotyki i są hodowane i selekcjonowane pod kątem odpowiedniego antybiotyku dodanego do pożywki. S. marcescens (ATCC #8100) nie są oporne na antybiotyki i dlatego są hodowane w sterylnym podłożu bez antybiotyku. Aby zweryfikować sterylną technikę, wykonaj próbną hodowlę bez bakterii jako kontroli.
    Roztwór do infekowania much zawiera bakterie (rozcieńczone do OD600 = 0,1) i 1% barwnika spożywczego (Brilliant Blue FCF) w PBS. Przygotować roztwór do kontroli wstrzyknięć, dodając równoważną ilość pożywki LB użytej w roztworze do zakażenia i 1% niebieskiego barwnika spożywczego do PBS. Przechowuj roztwory na lodzie.
  2. Przygotuj szklane igły do wstrzykiwania much. Pociągnij szklane kapilary (średnica zewnętrzna = 1 mm, średnica wewnętrzna = 0,58 mm, WPI) do cienkiej końcówki za pomocą ściągacza do mikropipet (Narishige). Pod mikroskopem preparacyjnym należy za pomocą cienkich kleszczyków odłamać końcówkę igły, tak aby otwór był wystarczająco duży, aby można go było wypełnić płynem iniekcyjnym poprzez odsysanie strzykawką, ale wystarczająco mały, aby zminimalizować uszkodzenie muchy podczas procesu wstrzykiwania. Po złamaniu końcówki rozmiar końcówki powinien wynosić około 40-50 μm. Szklana igła jest przymocowana do plastikowej strzykawki o pojemności 3 cm3 z rurką. Przepływ medium iniekcyjnego jest kontrolowany ręcznie za pomocą nadciśnienia lub zasysania za pomocą strzykawki. Należy unikać zanieczyszczania gumowej rurki płynem do wstrzykiwań, ponieważ aparat strzykawkowy jest używany zarówno do iniekcji infekcyjnych, jak i kontrolnych.
  3. Znieczulij muchy, umieszczając je na podkładce CO2. CO2 jest przepuszczany przez szczelnie zamknięty pojemnik z wodą w celu nawilżenia podkładki i zmniejszenia elektryczności statycznej, co może komplikować manipulację muchami na podkładce. Wstrzyknąć muchy, wbijając szklaną igłę w obszar nad tarczką grzbietowej klatki piersiowej. Przejście pożywki iniekcyjnej do muchy jest weryfikowane przez barwnik spożywczy - muchy zmieniają kolor na niebieski, gdy barwnik spożywczy rozprzestrzenia się w systemie. Dawkę bakterii, którą otrzymują muchy, można określić ilościowo, jak opisano w sekcji 3 poniżej. Niektóre projekty eksperymentalne obejmują grupę kontrolną, która otrzymuje aseptyczne obrażenia poprzez wstrzyknięcie muchom PBS i barwnika spożywczego, ale bez bakterii.

3. Określ obciążenie bakteryjne

Jednym z podejść do oceny odpowiedzi immunologicznej na infekcję bakteryjną jest określenie obciążenia bakteryjnego po infekcji. D. melanogaster jest doskonałym modelem do określenia tego parametru, ponieważ cała mucha może być homogenizowana w celu oszacowania całkowitej liczby bakterii u osobnika. Uzasadnieniem tego protokołu jest to, że podczas uprawy na stałym podłożu, takim jak agar z bulionu Luria (LB), na szalce Petriego (szalka LB), pojedyncza bakteria tworzy widoczną, rozpoznawalną kolonię. W związku z tym, homogenizując zakażone muchy w płynnym podłożu LB, generując seryjne rozcieńczenia homogenatu i rozprowadzając rozcieńczony homogenat na płytkach LB, można określić liczbę komórek bakteryjnych infekujących muchę. W celu sprawdzenia, czy infekcja nie została skażona innymi gatunkami bakterii, należy użyć grupy kontrolnej much, którym wstrzyknięto PBS i barwnik spożywczy, ale bez bakterii. W tym stanie na płytce agarowej LB nie powinno być żadnych kolonii.

  1. Autoklaw należy wszystkie materiały, które zostaną użyte do tej procedury, przed wykonaniem właściwego etapu homogenizacji. Obejmuje to końcówki do pipet o pojemności 200 μl pocięte nożyczkami, pożywkę LB i tłuczki używane do homogenizacji. Przygotować płytki, wlewając autoklawowane podłoże LB/agar do sterylnych szalek Petriego o średnicy 10 cm co najmniej 1 dzień przed homogenizacją much.
  2. Znieczulij i zbierz muchy w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj probówki na lodzie.
  3. Przeprowadzić homogenizację w pobliżu płomienia, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Homogenizacja kontrolna zawierająca muchy bez infekcji jest zalecana zwłaszcza w przypadku stosowania szczepu bakteryjnego, takiego jak S. marcescens, który nie jest odporny na antybiotyki. Homogenizować co najmniej 2 grupy po 10 much każda na warunki eksperymentalne. Liczba much użytych na homogenat jest określana przez eksperymentatora. Niektóre grupy używały jednej muchy na homogenat, co jest przydatne do oceny zmienności obciążenia bakteryjnego między poszczególnymi muchami8, podczas gdy inne używały od 3 do 10 much na homogenat do porównania genotypu lub warunków eksperymentalnych9-12.
    1. Dodać 400 μl pożywki LB do każdej probówki do mikrowirówki zawierającej muchy i homogenizować za pomocą małego silnika i tłuczka (Kontes).
    2. Używając wysterylizowanych, wyciętych końcówek pipet, seryjnie rozcieńczyć homogenat w stosunku 1:10, dodając 20 μl homogenizowanego LB/pożywki bakteryjnej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 μl zawierającej 180 μl pożywki LB. Odcinanie końcówek pipet zapobiega zatykaniu się odłamków much i zapewnia przenoszenie odpowiedniej objętości.
    3. Współczynnik rozcieńczenia jest określany empirycznie i zależy od genotypu muchy, użytego szczepu bakteryjnego i warunków doświadczalnych. W przypadku much typu dzikiego zakażonych S. marcescens należy stosować rozcieńczenia 1:102 lub 1:103 dla much homogenizowanych bezpośrednio po zakażeniu oraz rozcieńczenia 1:104 lub 1:105 dla much homogenizowanych 24 godziny po zakażeniu.
    4. Dodać 100 μl LB/pożywki bakteryjnej z probówek do mikrowirówek zawierających końcowe rozcieńczenie i rozprowadzić pożywkę na płytce LB za pomocą szklanych kulek (VWR), aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
    5. Wyrzuć szklane kulki do 100% roztworu EtOH. Umieścić na noc płytki LB w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    6. Opcjonalnie należy użyć systemu obrazowania ze światłem widzialnym w celu uzyskania obrazu płytek LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Policz liczbę kolonii na samej płycie lub na obrazie płytki za pomocą narzędzia do liczenia w oprogramowaniu Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
    7. Obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na muchę, korzystając ze wzoru: [n /(N *D *v)]*V; gdzie n = liczba kolonii wyhodowanych na płytce LB; N = liczba much zebranych w jednej probówce do mikrowirówki; D = współczynnik rozcieńczenia; a v = objętość roztworu rozprowadzonego na każdej płytce; V = początkowa objętość homogenatu.

4. Oceń czas snu i czasu przeżycia po infekcji

  1. W przypadku much, które nie są zbierane w celu pomiaru obciążenia bakteryjnego, kontynuuj monitorowanie zachowania przez kolejne 7-10 dni. Na czas przeżycia ma wpływ genotyp muchy, warunki środowiskowe i gatunki bakterii wykorzystywanych do infekcji.
  2. Po ~10 dniach zakończ eksperyment, pobierz i przetwórz dane behawioralne zgodnie z wcześniejszym opisem6. Niestandardowe oprogramowanie Insomniac2, które jest oparte na Matlabie, służy do analizy parametrów snu. Ważne jest, aby wyeliminować martwe muchy z analizy behawioralnej. Zwykle ogranicza to analizy do pierwszego dnia po zakażeniu, w zależności od rodzaju infekcji i genotypu muchy. Zgon w teście jest wskazywany przez czas, w którym wszystkie liczby aktywności osiągnęły zero. Aby ułatwić analizę przeżycia, do przetwarzania plików surowych danych z systemu Trikinetics DAM wykorzystuje się Drosonex, niestandardowe oprogramowanie napisane w Microsoft Visual C++ 6.0. Oprogramowanie raportuje w postaci plików Excel, czas przeżycia każdej muchy (w godzinach), kompiluje dane dotyczące aktywności ze wszystkich monitorów w jednym arkuszu kalkulacyjnym i podaje procent much przeżywających w czasie, zgodnie z ustawieniami użytkownika. Pliki Excel są przeznaczone do integracji z innymi pakietami oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.

5. Pomiar aktywności NFκB podczas infekcji za pomocą testu reporterowego lucyferazy

Transgeniczne muchy κB-luc użyte w tym teście zostały wcześniej wygenerowane, jak opisano w Kuo et al., 20102. Krótko mówiąc, reporter κB-luc zawiera 8 powtórzeń sekwencji wiązania NFκB, które zostały wstawione do promotora przed otwartą ramką odczytu lucyferazy.

  1. Dostosuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetleniowych, jak opisano w sekcji 1.2. W tym przykładzie 1-4-dniowe muchy κB-luc są umieszczane w fiolkach zawierających 5% sacharozy, 2% agaru i umieszczane w stałym świetle (LL) przez 2 dni, aby osiągnąć ten sam wiek, co inne muchy podczas infekcji.
  2. Przygotuj 96-dołkową mikropłytkę dla much. Każda studzienka zawiera 2 warstwy podłoża spożywczego (ryc. 2); Górna warstwa zawiera lucyferynę, substrat lucyferazy. Do każdej studzienki dodać 300 μl 5% roztworu sacharozy i 2% agaru i pozostawić do zestalenia. Następnie dodaj 50 μl wierzchniej warstwy do każdej studzienki zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru i 2 mM lucyferyny (Gold BioTechnology, Inc.). Stężenia lucyferyny stosowane do pomiaru aktywności reporterowej u Drosophila różniły się w literaturze i wynosiły zaledwie 100 μM13. Wymagane stężenie można określić empirycznie. Pomiędzy dozowaniem warstw żywności przykryj talerz ściereczką o drobnej siateczce, aby ułatwić suszenie przy zachowaniu sterylności. Płytkę należy pozostawić do całkowitego wyschnięcia, do jednej godziny, aby muchy nie utknęły w kropelkach kondensatu. Ponieważ lucyferyna jest wrażliwa na światło, unikaj wystawiania płytek na działanie światła bardziej niż to konieczne.
  3. Nałożyć przezroczystą folię samoprzylepną (Top-Seal-A; Perkin Elmer) do 96-dołkowej płytki mikrodołkowej i perforować za pomocą cienkiej igły w ilości 2 otworów na studzienkę. Otwory te nie tylko umożliwią wymianę powietrza do każdej studzienki, ale także zapewnią sposób na indywidualne znieczulenie much. Za pomocą ostrego ostrza i prostej krawędzi wprowadź nacięcie między każdą kolumną. Zapewni to łatwy sposób ładowania/rozładowywania much w grupach po 8 sztuk na raz.
    Aby załadować muchy do płytki mikrodołkowej, wyjmij fiolki z inkubatora i znieczul muchy na podkładce CO2 . Załaduj muchy pojedynczo do każdej studzienki kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przypadkowo przyklei się do uszczelki samoprzylepnej, zostaw ją w spokoju, ponieważ często jest w stanie uwolnić się bez interwencji. Umieść płytkę mikrodołkową z powrotem w inkubatorze w LL na 8-24 godziny, aby dostosować się do nowego środowiska i skonsumować substrat lucyferyny.
  4. Posadź bakterie S. marcescens i przygotuj roztwór do infekcji, jak opisano powyżej.
  5. Znieczulij muchy za pomocą końcówki mikropipety podłączonej do niskociśnieniowego przewodu CO2 . Umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi wykonanymi dla każdej studzienki. Zachowaj ostrożność, aby upewnić się, że ciśnienie CO2 jest wystarczająco wysokie, aby znieczulić muchę, ale wystarczająco niskie, aby uniknąć obrażeń muchy. W grupach po osiem osób indywidualnie przenieś każdą muchę do elektrody CO2 i zainfekuj zgodnie z powyższym opisem. Po zakażeniu należy umieścić każdą muchę z powrotem w jej pierwotnym dołku i ponownie uszczelnić mikropłytkę.
  6. Pomiar luminescencji (TopCount-NXT Licznik luminescencji i scyntylacji; Perkin-Elmer). Licznik luminescencji TopCount zawiera kasetę do układania płyt, która pozwala na zaprogramowane i zautomatyzowane odczyty w sposób ciągły z żądanymi przyrostami przez dowolny czas (zwykle do pięciu dni). Ta funkcja nie jest dostępna we wszystkich instrumentach, w związku z czym zbieranie danych do eksperymentów przeprowadzanych za pomocą innych instrumentów może być rzadsze. Licznik luminescencji znajduje się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą i harmonogramem oświetlenia. Podczas ładowania płytek do kasety do układania w stosy, płytki zawierające muchy należy ułożyć między przezroczystymi ślepymi płytkami, aby zapewnić muchom dostęp światła. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta, aby zbierał odczyty co godzinę przez co najmniej 24 godziny. W tym przykładzie detektory są zaprogramowane tak, aby odczytywały każdy dołek przez 10 sekund i wyrażały wynik w postaci liczb (dowolnych jednostek) na sekundę. Wartość ta jest uśredniana z 3 odczytów na studzienkę. Wyeksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i wykonaj standardową analizę, przedstawiając wyniki luminescencji na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Infekcja sprzyja zasypianiu. W tym przykładzie muchy typu dzikiego Canton-S (CS) i zmutowane muchy bez genu NFκB, Relish (RelE20) 14, zostały załadowane do dwóch monitorów aktywności DAM2 (n=32 dla każdego genotypu) i zakażone, jak opisano powyżej. Muchy utrzymywano w stałym świetle, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na zachowanie i infekcję2,7,8. Mutanty RelE20 zostały zogenizowane do CS, jak opisano wcześniej11. Obie grupy much zostały zakażo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia podejście do zbadania, w jaki sposób zachowanie, w szczególności sen, jest powiązane z parametrami odpowiedzi immunologicznej. Parametry te obejmują obciążenie bakteryjne, wynik przeżycia i aktywność NFκB mierzoną za pomocą reportera lucyferazy in vivo. Razem te parametry dostarczają informacji o tym, jak dobrze mucha może zwalczyć infekcję. Obciążenie bakteryjne i wynik przeżycia to parametry odpowiedzi immunologicznej, które wymagają prostego pomiaru u Drosophila. Mutanty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation w ramach grantu #IOS-1025627 oraz przez National Institutes of Health w ramach grantu #1R21NS078582-01 dla J.A.W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
InkubatoryPercival Scientific, Inc.I30BLLC8
I36VLC8		Każdy inkubator zdolny do pracy z zaprogramowanymi harmonogramami światła/temperatury jest odpowiedni.
Drosophila Activitiy MonitorsTrikinetics Inc., Waltham, MADAM2Jak opisano w innym miejscu6, ten system wymaga interfejsu komputerowego, oprogramowania i innych akcesoriów.
Pyrex Glass TubesTrikinetics Inc., Waltham, MAPGT-5x65
Licznik scyntylacyjny i luminescencyjny mikropłytekPerkin ElmerTopCount NXT
12 Do		tego typu testu reporterowego można użyć dowolnego czytnika mikropłytek zdolnego do wykrywania luminescencji. TopCount zawiera wiele detektorów i automatyczną sztaplarkę; Można go zaprogramować do ciągłego odczytu z wielu płyt.
FluorChem 8900Alpha InnotechObrazowanie kultur bakteryjnych jest opcjonalne; wystarczy dowolny cyfrowy system obrazowania z funkcją światła widzialnego.
Ściągacz do mikropipetTritech Research, Inc.Narishige PC-10
Supplies
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instrument Inc.1B100F-4
3 ml StrzykawkaFisher ScientificBD 305482
Igły do strzykawekFisher ScientificBD 30519618 G - odciąć końcówkę igły, aby zapobiec uszkodzeniu rurki.
Rurka silikonowa, ID (0,030") Średnica zewnętrzna (0,065") Grubość ścianki (0,018")VWR60985-706Służy do mocowania szklanych igieł kapilarnych do strzykawki
3-drożny kranPharmaseal CompanyK75
Kontes Pellet Pestle Silnik akumulatorowyFisher ScientificK749540-0000
Tłuczek do pelletu Kontes Fisher ScientificK749521-1590
Kulki szklane 3mmVWR26396-630
Microplate Microlite 1+Thermo Scientific7571Wybierz płytki 96-dołkowe, które są odpowiednie do luminescencji - muszą być nieprzezroczyste.
TopSeal-A: 96-dołkowe mikropłytkiPerkinElmer6005185Samoprzylepna folia uszczelniająca do mikropłytek
D-Lucyferyna, sól potasowaGold BioTechnology, Inc.LUCNA
Software
Insomniac2Dostępne na życzenie do autorówniestandardowych; napisane przez Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College)Oprogramowanie oparte na Matlabie, które było rutynowo używane do analizy snu2,6,11
DrosonexDostępne na życzenie autorówniestandardowe; napisane przez Thomasa Coradettiego (Sidewalk Software)Program komputerowy MSVC6 używany do analizy przeżycia z plików danych surowych zebranych za pomocą systemu Trikinetics
Photoshop CS3AdobePrzydatne do uzyskiwania liczb jtk/płytki z obrazów cyfrowych (opcjonalnie)
American

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
  2. Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7(2009).
  4. Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
  5. Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305(2008).
  6. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).
  7. Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
  8. Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).
  9. Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
  10. Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
  11. Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
  12. Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
  13. Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
  14. Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
  15. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
  16. Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
  17. Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
  18. Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
  19. Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
  20. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
  21. Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  22. Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
  23. Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
  24. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1(2002).
  25. Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150(2009).
  26. Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
  27. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
  28. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  29. Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
  30. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  31. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drosophila Immune ResponseSleep MeasurementBacterial ClearanceNF Kappa B ActivityLocomotor Activity MonitoringSurvival AssayColony Forming UnitsLucifer Reporter TechniqueConstant Light ConditionsFly Infection Protocol

Powiązane artykuły