Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Złożona interakcja między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem gospodarza została opisana u szerokiego spektrum gatunków. Nadmierna senność, w szczególności, jest znana jako reakcja na infekcję u ssaków 1, a ostatnio opisano ją również u Drosophila melanogaster2. Powszechnie przyjmuje się, że sen jest korzystny dla gospodarza podczas infekcji i jest istotny dla utrzymania sprawnego układu odpornościowego3,4. Jednak dowody eksperymentalne wspierające tę hipotezę są ograniczone4, a funkcja nadmiernego snu podczas odpowiedzi immunologicznej pozostaje niejasna. W celu rozwiązania tego złożonego problemu zastosowaliśmy podejście multidyscyplinarne i przeprowadziliśmy badania na prostym genetycznym modelu systemowym, jakim jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. Wykorzystujemy standardowy test do pomiaru zachowań lokomotorycznych i snu u much, wykazując, w jaki sposób test ten służy do pomiaru zachowania much zainfekowanych patogennym szczepem bakterii. Test ten jest również przydatny do monitorowania czasu przeżycia poszczególnych much podczas infekcji. Dodatkowe miary funkcji immunologicznych obejmują zdolność much do eliminacji infekcji oraz aktywację NFκB, kluczowego czynnika transkrypcyjnego, który jest centralny dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u Drosophila. Zarówno przeżywalność, jak i eliminacja bakterii podczas infekcji są wspólnie wskaźnikami oporności i tolerancji na infekcję. Oporność odnosi się do zdolności much do eliminacji infekcji, podczas gdy tolerancja jest definiowana jako zdolność gospodarza do ograniczania uszkodzeń spowodowanych infekcją, a tym samym do przetrwania mimo wysokiego poziomu patogenu w organizmie5. Monitorowanie aktywności NFκB w czasie rzeczywistym podczas infekcji pozwala zrozumieć molekularny mechanizm przeżycia w trakcie infekcji. Wykorzystanie Drosophila w tych prostych testach ułatwia analizy genetyczne i molekularne snu oraz odpowiedzi immunologicznej, a także badanie wzajemnego wpływu tych dwóch złożonych systemów.
Protokół
Niniejszy protokół wykorzystuje dwa układy (Rysunek 1) do uzyskania czterech różnych odczytów pobranych od much poddanych infekcji bakteryjnej. Wyniki te obejmują: 1) zachowania związane ze snem i czuwaniem; 2) przeżywalność; 3) miano bakterii w organizmie muchy; oraz 4) pomiar aktywności reportera NFκB in vivo w czasie rzeczywistym. W połączeniu z narzędziami genetycznymi dostępnymi u Drosophila, pomiary te pozwalają na mechanistyczne zrozumienie molekularnego związku między funkcją odpornościową a zachowaniem.
1. Pomiar aktywności lokomotorycznej i snu u much
- Układ wykorzystywany do pomiaru a....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
- Infekcja sprzyja senności. W tym przykładzie muchy typu dzikiego Canton-S (CS) oraz muchy mutanty pozbawione genu NFκB, Relish (RelE20) 14, zostały umieszczone w dwóch monitorach aktywności DAM2 (n=32 dla każdego genotypu) i zainfekowane zgodnie z powyższym opisem. Muchy utrzymywano w stałym oświetleniu, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na zachowanie i infekcję2,7,8. Mutanty RelE20 zostały izogenizowane do CS zgodnie z wcześniejszym opisem11. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół opisuje podejście do badania związku między zachowaniem, w szczególności snem, a parametrami odpowiedzi immunologicznej. Parametry te obejmują obciążenie bakteryjne, przeżywalność oraz aktywność NFκB mierzoną za pomocą reportera lucyferazy in vivo. Wspólnie parametry te dostarczają informacji o tym, jak skutecznie mucha potrafi zwalczyć infekcję. Obciążenie bakteryjne i przeżywalność są parametrami odpowiedzi immunologicznej, których pomiar w przypadku Drosophila jest prosty. Mutanty .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana przez National Science Foundation w ramach grantu nr #IOS-1025627 oraz przez National Institutes of Health w ramach grantu nr #1R21NS078582-01 przyznanego J.A.W.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| Inkubatory | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 | Odpowiedni jest każdy inkubator zdolny do realizacji zaprogramowanych harmonogramów oświetlenia i temperatury. |
| Drosophila Monitory aktywności | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | Jak opisano w innym miejscu6, system ten wymaga interfejsu komputerowego, oprogramowania oraz innych akcesoriów. |
| Szklane probówki Pyrex | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Mikropłytkowy licznik scyntylacyjny i luminescencyjny | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detektorów | Do tego typu testu reporterowego można użyć każdego czytnika mikropłytek zdolnego do detekcji luminescencji. TopCount posiada wiele detektorów i automatyczny stoker; może być zaprogramowany do ciągłego odczytu z wielu płytek. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Obrazowanie kultur bakteryjnych jest opcjonalne; wystarczający jest każdy cyfrowy system obrazowania z możliwością rejestracji światła widzialnego. | |
| Wyciągacz mikropipet | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Materiały i odczynniki | |||
| Kapilary szklane borokrzemowe | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Strzykawka 3 ml | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Igły do strzykawek | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – należy odciąć końcówkę igły, aby zapobiec uszkodzeniu rurki. |
| Rurka silikonowa, i.d. (0.030") o.d. (0.065") grubość ścianki (0.018") | VWR | 60985-706 | Używana do mocowania szklanych igieł kapilarnych do strzykawki |
| Kurek trójdrożny | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Silnik bezprzewodowy do moździerza z pestkiem Kontes | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Moździerz z pestkiem Kontes | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Kulki szklane 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Mikropłytka Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Należy wybrać płytki 96-dołkowe odpowiednie do luminescencji – muszą być nieprzezroczyste. |
| TopSeal-A: mikropłytki 96-dołkowe | PerkinElmer | 6005185 | Przylepna folia uszczelniająca do mikropłytek |
| Sól potasowa D-lucyferyny | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Oprogramowanie | |||
| Insomniac2 | Dostępne na prośbę do autorów | własne; napisane przez dr Lesley Ashmore (Westminster College) | Oprogramowanie oparte na Matlabie, rutynowo używane do analizy snu2,6,11 |
| Drosonex | Dostępne na prośbę do autorów | własne; napisane przez Thomasa Coradettiego (Sidewalk Software) | Program PC MSVC6 używany do analizy przeżywalności na podstawie surowych plików danych zebranych za pomocą systemu Trikinetics |
| Photoshop CS3 | Adobe | Przydatny do wyznaczania liczby jtk/płytkę z obrazów cyfrowych (opcjonalnie) |
Bibliografia
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
