Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

Artykuł metodologiczny

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

23 listopada 2012

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Streszczenie

Mutageneza transpozonna oraz delecja pojedynczego genu to dwie metody stosowane do knockoutu genów w całym genomie bakterii ^1,2. Chociaż mutageneza transpozonna jest mniej czasochłonna, tańsza i nie wymaga pełnych informacji o genomie, metoda ta posiada dwie słabości: (1) możliwość wystąpienia zróżnicowanych mutantów w mieszanej bibliotece mutantów, co prowadzi do kontrselekcji mutantów o obniżonej konkurencyjności oraz (2) możliwość częściowej inaktywacji genów, w wyniku której geny nie tracą całkowicie swojej funkcji po insercji transpozonu. Analiza delecji pojedynczego genu może zrekompensować wady związane z mutagenezą transpoznonną. Aby zwiększyć wydajność delecji pojedynczych genów w całym genomie, podjęto próbę opracowania wysokoprzepustowej techniki delecji pojedynczych genów w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Każda konstrukcja do delecji genu w genomie S. sanguinis została zaprojektowana tak, aby obejmowała obszar 1-kb powyżej (upstream) docelowego genu, gen aphA-3 kodujący białko oporności na kanamycynę oraz obszar 1-kb poniżej (downstream) docelowego genu. Trzy zestawy starterów F1/R1, F2/R2 i F3/R3 zostały odpowiednio zaprojektowane i zsyntetyzowane w formacie płytek 96-dołkowych w celu amplifikacji PCR tych trzech komponentów każdej konstrukcji delecyjnej. Startery R1 i F3 zawierają na końcach 5' sekwencje o długości 25-bp, które są komplementarne do regionów genu aphA-3. Wielkoskalowa amplifikacja PCR genu aphA-3 jest przeprowadzana jednorazowo w celu stworzenia wszystkich konstrukcji do delecji pojedynczych genów. Promotor genu aphA-3 został początkowo pominięty, aby zminimalizować potencjalny efekt polarny kasety kanamycynowej. W celu stworzenia konstrukcji delecyjnych genów przeprowadzono wysokoprzepustową amplifikację PCR i oczyszczanie w formacie płytek 96-dołkowych. Liniowy rekombinowany amplikon PCR dla każdej delecji genu zostanie utworzony poprzez cztery reakcje PCR z wykorzystaniem polimerazy DNA o wysokiej wierności (high-fidelity). Początkowa wykładnicza faza wzrostu S. sanguinis hodowanych w pożywce Todd Hewitt uzupełnionej o 2,5% inaktywowanej surowicy końskiej jest wykorzystywana do zwiększenia kompetencji w celu transformacji rekombinowanych konstrukcji PCR. W tych warunkach do 20% komórek S. sanguinis może zostać przekształconych przy użyciu ~50 ng DNA. Dzięki temu podejściu ostatecznie uzyskano 2 048 mutantów z delecją pojedynczego genu spośród 2 270 genów w S. sanguinis, z wyłączeniem czterech otwartych ramek odczytu (ORF) genów zawartych całkowicie w innych ORF w S. sanguinis SK36 oraz 218 potencjalnych genów niezbędnych. Technika tworzenia konstrukcji do delecji genów jest wysokoprzepustowa i może być łatwo stosowana w delecjach pojedynczych genów w całym genomie dla każdych bakterii podatnych na transformację.

Protokół

1. Projektowanie starterów

Startery są projektowane przy użyciu wewnętrznych skryptów w oparciu o sekwencję genomu S. sanguinis SK36. Zaprojektowano trzy zestawy starterów: F1/R1, F2/R2 oraz F3/R3, odpowiednio do amplifikacji sekwencji 1-kb powyżej genu docelowego, genu aphA-3 kodującego białko oporności na kanamycynę (Km^r)³ oraz sekwencji 1-kb poniżej genu docelowego (Rysunek 1). Spośród tych starterów, F1 i R3 zostały zaprojektowane za pomocą ePrimer3 w pakiecie programów EMBOSS (http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html) w celu amplifikacji regionów flankujących powyżej lub poniżej genu docelowego. Startery specyficzne dla genu, R1 i F3, zaprojektowano na podstawie sekwencji 5' i 3' genu docelowego. Startery R1 i F3 zawierają na końcach 5' sekwencje adapterów o długości 25-bp, które są komplementarne do genu aphA-3. Temperatury topnienia każdego startera zostały zaplanowane tak, aby były jak najbliższe 60 °C, co umożliwia zastosowanie jednolitej temperatury przyłączania dla wszystkich reakcji PCR w formacie 96-dołkowym.
Startery F1, R1, F3 i R3 są syntetyzowane na płytkach 96-dołkowych zgodnie z zamówieniem genów. Każda płytka zawiera jeden typ starterów w tej samej kolejności genów. Rozcieńczyć startery na roboczej płytce 96-dołkowej do stężenia końcowego 10 μM do amplifikacji PCR, używając pipety wielokanałowej.

2. Wysokoprzepustowa amplifikacja i puryfikacja PCR

W celu wysokoprzepustowej amplifikacji fragmentów o długości 1 kb powyżej lub poniżej docelowych genów S. sanguinis, przygotować na lodzie w 15-ml probówce stożkowej mieszaninę PCR zawierającą 1640 μl ddH₂O, 250 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 200 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 100 μl 50 mM MgSO₄, 100 μl genomic DNA S. sanguinis SK36 o stężeniu 10 ng/ μl oraz 10 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity, a następnie przenieść 23 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR za pomocą pipety wielokanałowej. Przenieść 1 μl każdego startera F1 i R1 (lub F3 i R3) z 10 μM płytek ze starterami roboczymi na płytkę PCR, używając pipety wielokanałowej. Uszczelnić płytkę PCR i przeprowadzić amplifikację w temperaturze 94 °C przez 1 min oraz 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 54 °C przez 30 s i 68 °C przez 1,5 min.
Przygotować 1% żel agarozowy zawierający bromek etydyny z 48 dołkami dopasowanymi do nakładania pipetą wielokanałową. Wymieszać 4 μl produktu PCR z 1 μl 5x DNA loading buffer na płytce 96-dołkowej i nanieść próbki na żel agarozowy za pomocą 10-μl pipety wielokanałowej. Przeprowadzić elektroforezę przy 135 V przez 30 min. Przeanalizować prążki na żelu za pomocą systemu dokumentacji i analizy UVP.
Oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu PureLink 96 PCR purification kit metodą wirowania zgodnie z instrukcją producenta. W celu elucji DNA dodać 40 μl sterylnego ddH₂O do dołka płytki wiążącej.
Losowo wybrać kilka oczyszczonych amplikonów z płytki, aby sprawdzić stężenia DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Dostosować stężenie amplikonów na płytce do poziomu ~10 ng/μl.
Plazmid zawierający kasetę Km^r poddać trawieniu enzymem EcoRI w celu uzyskania matrycy PCR. Strawiony plazmid oczyścić za pomocą zestawu QIAquick PCR purification kit i dostosować stężenie liniowego DNA plazmidowego do końcowego stężenia 10 ng/μl. Przygotować 25 μl mieszaniny do amplifikacji kasety Km^r, zawierającej 16,4 μl ddH₂O, 2,5 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 2 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 1 μl 50 mM Mg SO₄, 1 μl 10 μM F2, 1 μl 10 μM R2, 1 μl liniowego DNA plazmidowego i 0,1 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Przeprowadzić amplifikację PCR w 94 °C przez 1 min oraz 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 1 min. Przeanalizować produkt PCR za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Połączyć większą ilość amplikonów kasety Km^r z 10 indywidualnych reakcji PCR, oczyszczonych za pomocą zestawu QIAquick PCR purification kit. Dostosować stężenie amplikonu do 10 ng/μl.
Aby uzyskać końcowy liniowy rekombinowany amplikon PCR, połączyć trzy amplikony PCR w ilości 1 μl każdego (w niemal równomolarnych ilościach) w jednym dołku płytki PCR jako matrycę PCR. Dodać pozostałe komponenty PCR, w tym 14,4 μl ddH₂O, 2,5 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 2 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 1 μl 50 mM Mg SO₄, 1 μl 10 μM F1, 1 μl 10 μM R3 oraz 0,1 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Amplifikację PCR przeprowadzić w 94 °C przez 2 min, 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 3,5 min, a na koniec 68 °C przez 4 min.
Przeanalizować amplikony PCR w żelu agarozowym. Oczyścić i zmierzyć stężenie amplikonów PCR zgodnie z opisem powyżej. Zamrozić rekombinowane amplikony PCR w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie komórek kompetentnych

Przygotowuje się bulion Todda-Hewitta, dostosowując pH do 7,6 za pomocą 10 N NaOH, podgrzewając do wrzenia, a następnie schładzając do temperatury pokojowej i sterylizując za pomocą filtra polistyrenowego 0,22 μm⁴. Do 11,7 ml bulionu Todda-Hewitta w stożkowej probówce 15-ml dodaje się 300 μl inaktywowanej termicznie surowicy koni (stężenie końcowe 2,5%), aby przygotować medium TH+HS. Medium TH+HS rozdziela się na aalikwoty po 2 ml i 10 ml w probówkach.
Do 2 ml medium TH+HS szczepia się 5 μl mrożonego w -80 °C szczepu S. sanguinis SK36 i inkubuje kulturę przez noc w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze 37 °C, jednocześnie przeprowadzonej wstępną inkubację probówki z 10 ml medium TH+HS.
Po inkubacji nocnej przenosi się 50 μl kultury do 10 ml medium TH+HS i inkubuje probówkę w 37 °C przez 3 h (do uzyskania OD₆₆₀ na poziomie 0,07-0,08), a następnie niezwłocznie wykorzystuje do transformacji.

4. Transformacja komórek i selekcja antybiotykowa

Do probówek Eppendorf umieszczonych w bloku 96-dołkowym dodać 2 μl peptydu stymulującego kompetencję (CSP) szczepu S. sanguinis SK36 (70 ng) oraz 2 μl liniowego rekombinowanego amplikonu PCR (~50 ng), a następnie podgrzać je do 37 °C. Do każdej probówki przenieść 330 μl kultury SK36 inkubowanej przez 3 h. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. W próbce kontrolnej DNA zastąpić sterylną wodą destylowaną ddH₂O.
Umieścić blok na lodzie i rozsiać po 100 μl każdej transformacji na płytki z agarem BHI (brain heart infusion) z dodatkiem 500 μg/ml kanamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 d w warunkach mikroaerobowych.

5. Potwierdzenie mutacji i przechowywanie

Dla każdego mutanta zastępującego należy losowo wybrać 2 pojedyncze kolonie, zaszczepić kolonię do 5 ml pożywki BHI zawierającej 500 μg/ml kanamycyny i inkubować szczepionkę w warunkach mikroaerobowych przez noc w temperaturze 37 °C. Każdą kulturę należy krio konserwować w 30% glicerolu w temperaturze -80 °C
Aby sprawdzić, czy mutant zawiera oczekiwaną wymianę genu, należy przeprowadzić PCR kolonii dla każdego mutanta z użyciem starterów F1 i R3 w 96-dołkowej płytce PCR. Jako matryca DNA w 25-μl reakcji amplifikacji PCR stosuje się około 1-μl nocnej kultury z pojedynczej kolonii. PCR przeprowadza się w 94 °C przez 5 min, następnie 35 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 3,5 min, a na koniec 68 °C przez 4 min.
Aby precyzyjnie zidentyfikować mutanty z podwójnym prążkiem lub zanieczyszczone amplikony PCR, należy poddać amplikony PCR elektroforezie przez 4 h na żelu agarozowym 2% o długości >12 cm z barwieniem bromkiem etydyny. W tych warunkach elektroforezy na żelu agarozowym wyraźnie identyfikowano wszystkie amplikony różniące się o ≥ 100 bp. W przypadku gdy przewiduje się, że prążki powstałe z amplifikacji kasety Km^r i genu typu dzikiego będą różnić się o < 100 bp, stosuje się wewnętrzny starter T1, aby ustalić, czy gen typu dzikiego jest wykrywalny za pomocą PCR.
W celu dalszego potwierdzenia delecji amplikony są oczyszczane za pomocą zestawu PureLink 96 PCR purification kit i sekwencjonowane z użyciem startera P1, który wiąże się z kasetą Km^r. Należy zachować tylko poprawne mutanty potwierdzone sekwencjonowaniem.