Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Podsumowanie

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u myszy. 

Streszczenie

Zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u myszy. Aby zbadać właściwości elektryczne i biologiczne melanocytów serca, opracowaliśmy procedurę ich izolacji z serc myszy, wyprowadzoną z metod zaprojektowanych do izolacji neonatalnych kardiomiocytów mysich. W celu uzyskania zdrowszych melanocytów serca, odpowiednich do bardziej rozległych badań metodą patch clamp lub badań biochemicznych, opracowaliśmy udoskonaloną procedurę izolacji i wysiewania melanocytów serca, opartą na metodach pierwotnie zaprojektowanych do izolacji melanocytów skórnych. Udoskonalona procedura jest zaprezentowana w niniejszym opracowaniu i pozwala na uzyskanie większej liczby zdrowych komórek melanocytopodobnych, które mogą być wysiewane jako czysta populacja lub wraz z kardiomiocytami.

Wprowadzenie

Niedawno zidentyfikowaliśmy w sercach myszy i ludzi nową populację komórek, które wykazują ekspresję enzymów syntezy melaniny i morfologicznie przypominają melanocyty skórne. Komórki te nazwaliśmy „melanocytami sercowymi” i stwierdziliśmy, że występują one w lokalizacjach anatomicznych, z których u ludzi często wywodzą się wyzwalacze arytmii przedsionkowej. Wykazaliśmy również, że melanocyty sercowe przyczyniają się do powstawania arytmii przedsionkowych u myszy z delecją linii zarodkowej genu Dct. Melanocyty sercowe są rzadko rozmieszczone w przedsionku myszy, gdzie stanowią mniej niż 0,1% wszystkich komórek przedsionkowych. Aby zbadać właściwości elektryczne i biologiczne melanocytów sercowych, opracowaliśmy procedurę ich izolacji z serca myszy przy użyciu specyficznych dla melanocytów markerów indukowanych przez Cre. Nasza pierwotna procedura została opracowana na podstawie metod stosowanych do izolacji noworodkowych kardiomiocytów mysich i pozwalała na uzyskanie bardzo niewielkiej liczby komórek odpowiednich do rejestracji metodą patch-clamp lub analizy PCR. Jednakże, aby poprawić stan i żywotność melanocytów sercowych na potrzeby bardziej szczegółowych analiz elektrofizjologicznych lub badań biochemicznych, opracowaliśmy udoskonaloną procedurę na podstawie metod zaprojektowanych do izolacji melanocytów skórnych. Procedura opisana i zaprezentowana w niniejszym przeglądzie ma tę zaletę, że pozwala uzyskać zdrowsze melanocyty sercowe, które mogą być wysiewane jako czysta populacja lub wraz z kardiomiocytami.

Protokół

1. Przygotowanie niezbędnych roztworów i sprzętu

1. W pierwszej kolejności należy wysterylizować narzędzia chirurgiczne (pincety proste, pincety zakrzywione, nożyczki proste i nożyczki zakrzywione), autoklawując je przez 15 min w temperaturze 121 °C. Należy przygotować 2 zestawy narzędzi, z których jeden posłuży do wycinania serc, a drugi do rozdrabniania tkanki.
2. Rozpuścić jedną saszetkę pożywki MCDB153 w 900 ml sterylnej, filtrowanej wody i mieszać powoli aż do całkowitego rozpuszczenia proszku. Dodać 1,2 g wodorowęglanu sodu lub 15,7 ml roztworu wodorowęglanu sodu [7,5% w/v] na każdy litr końcowej objętości przygotowywanej pożywki i mieszać do czasu rozpuszczenia. Dostosować pH do wartości 7,2, dodając 1 N HCl lub 1 N NaOH, a następnie przelać pożywkę przez filtr nakrętkowy o rozmiarze 0,2 μm w warunkach sterylnych w komorze laminarnej (szafce bezpieczeństwa biologicznego). Następnie zebrać pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować suplementy do dodania do pożywki hodowlanej (Lista Materiałów). Suplementy należy dodać do pożywki bezpośrednio przed jej wykorzystaniem do wysiewu komórek.
4. Przygotować DPBS z 10% FBS oraz antybiotykami (penicyliną i streptomycyną).
5. Następnie przygotować 0,25% roztwór trypsyny, dodając 0,25 g trypsyny (trzustka bydlęca, aktywność > 2 500 jednostek USP/mg, ultrapure; USB) do 100 ml DPBS z antybiotykami (penicyliną i streptomycyną).
6. Pozostały sprzęt niezbędny do wykonania tej procedury obejmuje stereomikroskop, szalki Petriego (10 cm), probówki stożkowe 50 ml, sita komórkowe 40 μm, DPBS z antybiotykami, naczynia hodowlane 60 mm oraz naczynia hodowlane 35 mm.

2. Izolowanie serc z noworodków myszy

1. W pierwszej kolejności należy pozyskać noworodki myszy w wieku od P0 do P2 (n=6 do 8). Zaleca się użycie szczeniąt uzyskanych poprzez krzyżowanie homozygotycznych samic Dct-Cre z samcami heterozygotycznymi pod kątem allelu R26R:EYFP lub allelu Z/EG w celu oznakowania komórek melanocytopodobnych. Zarówno myszy R26R:EYFP, jak i Z/EG są dostępne w Jackson Laboratories (numery katalogowe odpowiednio 006148 i 003920).
2. Następnie należy poddać noworodki myszy eutanazji, przetrzeć ich klatki piersiowe wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie umieścić je w 10-cm czalce Petriego z DPBS.
3. Za pomocą wysterylizowanych pęset i nożyczek należy naciąć skórę nad klatką piersiową i mostkiem, a następnie ostrożnie otworzyć klatkę piersiową pod stereomikroskopem. Serca noworodków myszy są bardzo małe, dlatego należy zachować ostrożność, aby usunąć całe serce wraz z przylgniętymi przedsionkami.
4. Serca należy wypłukać w DPBS, a następnie przenieść do nowej 10-cm czalki Petriego .

3. Trawienie enzymatyczne

1. Przenieś szalkę Petriego z wyciętymi sercami do komory z laminarnym przepływem powietrza (kabiny biologicznej), a następnie wykonaj poniższe kroki, stosując wewnątrz niej techniki sterylne.
2. Najpierw trzykrotnie przemyj serca sterylnym roztworem DPBS z dodatkiem antybiotyków.
3. Umieść serca (n=6-8) w 60-mm naczyniu hodowlanym i dodaj do naczynia 6-8 ml 0,5% roztworu trypsyny.
4. Następnie pokrój serca na małe kawałki (o rozmiarze poniżej 1 mm) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 min w atmosferze 5% CO₂).
5. Po zakończeniu okresu inkubacji przelej powstały zawiesinę tkanki serca i trypsyny z naczynia do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
6. Następnie, używając sterylnej pipety 10 ml, szybko, lecz delikatnie, rozbij zawiesinę w probówce stożkowej 50 ml poprzez 30-50 krotne pipetowanie.
7. Przefiltruj otrzymany roztwór przez sitko komórkowe 40-μm do nowej, czystej probówki stożkowej 50 ml, aby zebrać filtrat.
8. Następnie odwiruj probówkę 50 ml w wirówce stołowej przy 240 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie odessij supernatant i resuspenduj pozostały osad w 6-8 ml sterylnego DPBS. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy. Ten etap pozwala na osadzenie miocytów przedsionkowych i melanocytów serca, ale nie powoduje osiadania fibroblastów, ponieważ są one mniejsze i pozostają w supernatancie.

4. Wysiewanie komórek przypominających melanocyty serca

1. Po trzecim płukaniu po wirowaniu należy ostrożnie odlać lub odessać roztwór płuczący (DPBS), a następnie zawiesić osad w 6 ml pożywki hodowlanej MCDB z dodatkiem suplementów.
2. Następnie należy pobrać zawiesinę do sterylnej pipety transferowej i przenieść komórki do naczynia o średnicy 35 mm lub do studni płytki 6-dołkowej, łącząc wyizolowane komórki serca z 3 noworodków mysich w jednym naczyniu 35 mm lub jednej studni.
3. Naczynia należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂, odessać pożywkę wraz z nieprzytwierdzonymi komórkami, a następnie raz przepłukać płytki roztworem DPBS. Następnie do płytek należy dodać świeżą pożywkę i wymieniać ją co 2 dni. Komórki wyizolowane z serc noworodków lub embrionów można utrzymywać w hodowli do 3 tygodni, natomiast komórki wyizolowane z serc dorosłych osobników można utrzymywać w hodowli do 10 dni.

5. Izolowanie komórek podobnych do melanocytów serca z serca dorosłej myszy

1. W pierwszej kolejności, po podaniu myszom 100 U heparyny drogą doszpikową i ich eutanazji, należy wyciąć serca z dojrzałych myszy (wiek 3-4 tygodnie, n=3) poprzez sternotomię w linii środkowej. Do eutanazji myszy w tej procedurze zaleca się stosowanie pentobarbitalu, jednak lek ten nie jest dostępny we wszystkich lokalizacjach.
2. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium mikrobiologicznym), należy przemyć wycięte serca w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków. Serca należy lekko ścisnąć zakrzywioną pęsetą chirurgiczną, aby usunąć z nich resztki krwi, a następnie raz jeszcze opłukać je w DPBS.
3. Należy usunąć z serc przedsionki oraz pierścień przedsionkowo-komorowy (struktury te zawierają komórki podobne do melanocytów), a wycięte próbki tkanki umieścić w szalce o średnicy 35 mm.
4. Serca należy pociąć na małe kawałki za pomocą zakrzywionych nożyczek i pęsety, a następnie dodać do szalki 6-8 ml 0,5% roztworu trypsyny. Następnie szalki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 45-60 min.
5. Teraz należy postępować zgodnie z krokami opisanej powyżej procedury, zaczynając od punktu 3.6.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym artykule jest ulepszoną techniką w porównaniu do wcześniej opublikowanej przez nas metody izolacji melanocytów serca z serca mysiego. Procedura ta wykorzystuje markery fluorescencyjne sterowane specyficzną dla enzymów syntezy melaniny rekombinazą Cre w celu znakowania komórek przypominających melanocyty serca. Podczas pracy ze świeżo izolowanymi komórkami zarodkowymi lub noworodkowymi istotne jest zastosowanie markera do znakowania melanocytów serca, ponieważ różnice morfologiczne odróżniają...

Dyskusja

Melanocyty serca występują w obszarach anatomicznych serca, które powszechnie stanowią źródła wyzwalające arytmię przedsionkową. Regiony te obejmują żyły płucne, pierścień przedsionkowo-komorowy, tylną ścianę lewego przedsionka oraz otwór owalny (Rycyna 4). Aby zrozumieć rolę tych komórek w arytmogenezie, opracowujemy techniki ich izolacji oraz badania nad ich fizjologią. Uznaliśmy jednak, że udoskonalenie tej metody w celu uzyskania zdrowszych i większych ilości melanocytów serca pozwoli na dalsze badan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Rozpuścić w wodzie
DPBS, bez wapnia i magnezu	Invitrogen	14190136	Stężenie zapasu: 1x Stężenie robocze: 1x
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140163	Stężenie zapasu: 100x Stężenie robocze: 1x
Płodowa surowica bydlęca	Life Technology	Certyfikowana	Stężenie robocze: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Rozpuścić w DMSO Stężenie zapasu: 3.2 μM Stężenie robocze: 32 nM
Transferryna	Sigma-Aldrich	T8158	Rozpuścić w DPBS Stężenie zapasu: 0.1 mg/ml Stężenie robocze: 1 μg/ml
Dibutyrylowy cykliczny AMP	Sigma-Aldrich	D0627	Rozpuścić w DPBS Stężenie zapasu: 0.5 mM Stężenie robocze: 5 μM
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Rozpuścić w 10 mM kwasie octowym Stężenie zapasu: 1 mg/ml Stężenie robocze: 5 μg/ml
Podstawowy FGF	BD Biosciences	354060	Rozpuścić w wodzie Stężenie zapasu: 4 ng/μl Stężenie robocze: 4 ng/ml