Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Podsumowanie

Przedstawiamy nowatorską metodę utrzymywania ludzkiej błony śluzowej jelita w kulturze oraz monitorowania odpowiedzi na różne rodzaje bodźców przez co najmniej 24 hrs. Dzięki zastosowaniu naszej metody zachowana zostaje polarność tkanki, co umożliwia fizjologiczną stymulację drogą apikalną.

Streszczenie

Obecnie istnieje niewiele modeli pozwalających na realistyczne symulowanie złożonego mikrośrodowiska ludzkiego jelita, w którym zachodzi szereg interakcji. Prawidłowa homeostaza zależy bezpośrednio od tych oddziaływań, ponieważ kształtują one całą odpowiedź immunologiczną, indukując tolerancję na antygeny pokarmowe, przy jednoczesnym generowaniu skutecznych reakcji odpornościowych przeciwko drobnoustrojom patogennym, które zostały przypadkowo przyjęte wraz z pożywieniem.

Homeostaza jelitowa jest utrzymywana również poprzez różnorodne, złożone interakcje między mikrobiotą (w tym korzystnymi szczepami bakterii związanymi z pożywieniem) a organizmem gospodarza, które regulują przyleganie/degradację śluzu, produkcję peptydów przeciwdrobnoustrojowych przez barierę nabłonkową oraz „edukację” komórek nabłonka, kontrolującą fenotyp tolerogenny lub immunogenny specyficznych populacji komórek limfoidalnych rezydujących w jelitach. Interakcje te były dotychczas bardzo trudne do odtworzenia w testach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych lub mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Ponadto modele mysie znacznie różnią się pod względem składników błony śluzowej jelit (organizacja warstwy śluzu, społeczność bakterii komensalnych) w stosunku do jelit ludzkich. W związku z tym trudne było prowadzenie badań nad różnymi terapiami, które mają zostać wprowadzone do praktyki klinicznej w przypadku istotnych schorzeń związanych ze stresem lub stanami patologicznymi, takich jak zespół jelita drażliwego, niespecyficzne zapalne schorzenia jelit czy rak jelita grubego.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nowatorski system umożliwiający polaryzowaną stymulację eksplantatów ludzkiej błony śluzowej jelit, które zachowują swoje uwarunkowanie in situ wynikające z oddziaływań mikrobioty gospodarza i odpowiedzi immunologicznej. Polaryzowana stymulacja apikalna ma kluczowe znaczenie dla wyniku wywołanej odpowiedzi odpornościowej. Wielokrotnie wykazano, że te same bodźce mogą wywołać całkowicie odmienne reakcje, gdy omijają powierzchnię apikalną nabłonka jelitowego, stymulując komórki nabłonkowe basolateralnie lub wchodząc w bezpośredni kontakt z komponentami blaszki właściwej, co zmienia fenotyp z tolerogennego na immunogenny i powoduje niepotrzebny oraz nadmierny stan zapalny w tym obszarze.

Osiągnęliśmy polaryzację stymulacji poprzez przyklejenie cylindra ograniczającego obszar stymulacji na powierzchni apikalnej śluzówki, zgodnie z opisem w protokole. Wykorzystaliśmy ten model do zbadania między innymi różnic w działaniu trzech różnych szczepów Lactobacilli. Wykazujemy, że system modelowy ten jest bardzo skutecznym narzędziem do oceny właściwości immunomodulujących probiotyków w warunkach zdrowia oraz choroby.

Protokół

1. Pozyskiwanie i przygotowanie tkanki

1. Tkankę (zdrową błonę śluzową lub błonę śluzową z IBD) pobiera się podczas operacji. Po wycięciu preparatu należy go jak najszybciej przenieść do laboratorium, przechowując go w buforze HBSS wolnym od Ca⁺⁺/Mg⁺⁺, uzupełnionym o Pen/Strep, w temperaturze 4 °C lub w lodzie.

*Wielkość preparatu zależy od dostępności tkanki: pobrana część tkanki jest ściśle tym, co nie jest wymagane do postawienia diagnozy, i może znacznie różnić się u osób zdrowych oraz pacjentów z IBD. Tkanka zdrowa jest wycinana u pacjentów poddawanych operacjom z powodu raka jelita grubego.

2. Delikatnie opłucz tkankę i oczyść ją ze wszystkich materiałów krezkowych. Oddziel warstwę błony śluzowej od błony podśluzowej za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety, utrzymując tkankę w buforze HBSS w szalce Petriego (niekoniecznie w pełnym zanurzeniu). Unikaj częstego dotykania pęsetą powierzchni śluzówki.
3. Potnij błonę śluzową w pasy o szerokości co najmniej 1 cm i możliwie największej długości. Użyj dwóch sterylnych skalpeli, prowadząc cięcie w sposób analogiczny do krojenia pokarmu.
4. Delikatnie opłucz oczyszczoną błonę śluzową w buforze HBSS i rozłóż ją w szalce Petriego stroną apikalną do góry.

2. Montowanie tkanki

1. Przygotować świeżą pożywkę (tisDMEM). Należy użyć DMEM uzupełnionego o glutaminę (2 mM) i NaPyr (1 mM), a w momencie użycia dodać 15% FBS-Na (płodowa surowica bydlęca – Ameryka Północna), 1% ITS-X oraz 200 ng/ml EGF.
2. Napełnić 10 cm płytkę Petri pozostałą częścią FBS-Na (użyć około 30 ml, tak aby siatki metalowe były całkowicie zanurzone) i zanurzyć w niej siatki metalowe. Pozostawić płytkę otwartą i oprzeć na jej brzegu plastikowe cylindry.

*Siatki metalowe są wykonane z żelaza. Oczka są kwadratowe o boku 0.5 mm.

3. Pobierz 3 μl kleju chirurgicznego za pomocą pipety 10 lub 20 μl. Nanieś go ostrożnie na jedną z krawędzi plastikowego cylindra, trzymając go stabilnie pęsetą.
4. Delikatnie umieść cylinder na stronie apikalnej błony śluzowej, jak najbliżej jednej z krawędzi paska.
5. Aby klej zdążył trwale przytwierdzić cylinder do tkanki, przygotuj płytkę do hodowli organów z centralną studnią: wlej 850 μl-1 ml pożywki do środkowej studni i oprzyj metalową siatkę na krawędziach centralnej studni płytki.
6. Odetnij nadmiar tkanki z krawędzi cylindra, używając dwóch sterylnych skalpeli, analogicznie jak poprzednio.
7. Delikatnie unieś cylinder z przytwierdzoną tkanką i umieść stronę bazolateralną na metalowej siatce w centrum płytki.

3. Stymulacja

1. Użyć wybranych bodźców w preferowanym stężeniu.
2. Nanieść odpowiednią objętość na środek plastikowego cylindra, nie dotykając pipetą cylindra ani powierzchni błony śluzowej. Upewnić się, że wybrana objętość równomiernie pokrywa powierzchnię wewnątrz cylindra. Wskazane objętości:
   Duży plastikowy cylinder: 200 μl
   Średni plastikowy cylinder: 100 μl
   Mały plastikowy cylinder: 50 μl
3. Inkubować do 3 hr w konwencjonalnym inkubatorze.

*Jeśli chcesz inkubować przez dłuższy czas, upewnij się, że używasz znacznie mniejszej objętości stymulatorów (10-20 μl) i umieść tkankę bezpośrednio w atmosferze 100% O₂ pod ciśnieniem 1 Atm (patrz 3.5).

4. Usunąć medium ze stymulantami z powierzchni apikalnej tkanki i NIE ZASTĘPOWAĆ go świeżym medium, ponieważ tkanka nie otrzyma wystarczającej ilości O₂, jeśli gruba warstwa medium na powierzchni apikalnej będzie uniemożliwiać wymianę gazową. Przykryć płytkę.
5. Umieścić tkankę w atmosferze 100% O₂ pod ciśnieniem 1 Atm.

4. Pozyskiwanie

1. Po 24 h całkowitego czasu hodowli (± 2,5 h) ostrożnie usuń cylinder z tkanki za pomocą skalpela, delikatnie zeskrobując klej, a następnie przechowuj go w zależności od planowanej analizy (utrwal do badań immunohistochemicznych i/lub immunofluorescencji lub zamroź błyskawicznie w ciekłym N2 w celu oczyszczania RNA i profilowania ekspresji genów lub oczyszczania białek i analiz Western blot).
2. Zabierz medium z komory bazolateralnej do profilowania sekrecji cytokin. Wirować z prędkością 8,000 rpm przez 7 min w celu osadzenia zanieczyszczeń, przenieś nadsącz do probówki Eppendorf (alternatywnie podziel na alykwoyty) i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 °C.

*jeśli chcesz przechowywać nadnadłoża przez dłuższy czas, przechowuj je w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Udało nam się utrzymać w kulturze zdrową błonę śluzową jelita człowieka oraz błonę śluzową z chorobą IBD przez co najmniej 24 hr, zachowując żywotność tkanki. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami ¹, było to możliwe tylko wtedy, gdy większość czasu hodowli (co najmniej 85% całkowitego czasu) odbywała się w O₂, ponieważ tkanka nie przetrwała 24 hr w konwencjonalnych inkubatorach (Rysunek 2). Wykazaliśmy również, że w tym modelu można obserwować różne reakcje eksplantów w zależności o...

Dyskusja

Od dawna podkreśla się potrzebę opracowania fizjologicznie istotnych modeli, na których można byłoby rzetelnie testować metody leczenia błony śluzowej jelita u ludzi. Wielu badaczy zidentyfikowało potencjalne artefakty i wady w modelach komórkowych ⁵ oraz mysich ⁶, stosowanych dotychczas w tym celu. Rzeczywiście, mimo że często uzyskuje się obiecujące dane przedkliniczne, rzadko przekładają się one na istotne korzyści kliniczne.

Metoda opisana w niniejszej pracy stanowi s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
10X HBSS	Eurocalne	ECM4006XL
Peni/Strepto	Lonza	DE17602E
Gentamycyna	Gibco	15750-037
DMEM	Lonza	BE12614
FBS-Na	Gibco	16000-044
100X ITS-X	Gibco	51500-056
EGF	Tebu-bio	100-15
L-glutamina	Lonza	BE17605E
Aminokwasy nieessentialne 100X	Gibco	11140-035
NaPyr	Gibco	11360-039
Materiały
Cylindry do klonowania 6x8 mm	BellCo	2090-00608
Cylindry do klonowania 8x8 mm	BellCo	2090-0080
Cylindry do klonowania 10x10 mm	BellCo	2090-01010
Siatki metalowe	Własnej produkcji
Płytka do hodowli organów z centralną studnią	BD Falcon	353037
Klej chirurgiczny (Vetbond)	3M	1469SB
Słoje tlenowe	Własnej roboty
Butle z tlenem	Air Liquid Sanità