Technika chirurgiczna podawania terapii do rdzenia kręgowego: demonstracja procedury u miniprosiaków rasy Gottingen

Thais Federici; Carl V. Hurtig; Kentrell L. Burks; Jonathan P. Riley; Vibhor Krishna; Brandon A. Miller; Eric A. Sribnick; Joseph H. Miller; Natalia Grin; Jason J. Lamanna; Nicholas M. Boulis

doi:10.3791/4371

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika chirurgiczna podawania terapii do rdzenia kręgowego: demonstracja procedury u miniprosiaków rasy Gottingen

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4371

⸱

7 grudnia 2012

Thais Federici¹ , Carl V. Hurtig¹ , Kentrell L. Burks¹ , Jonathan P. Riley¹ , Vibhor Krishna² , Brandon A. Miller¹ , Eric A. Sribnick¹ , Joseph H. Miller³ , Natalia Grin¹ , Jason J. Lamanna¹^,⁴^,⁵ , Nicholas M. Boulis¹

¹Department of Neurosurgery, Emory University, ²Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina, ³Division of Neurosurgery, University of Alabama, Birmingham, ⁴Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology , ⁵Department of Biomedical Engineering, Emory University

W tym artykule

Podsumowanie

Krótki opis wizualny techniki chirurgicznej i urządzenia wykorzystywanego do wprowadzania terapii (genowych i komórkowych) do rdzenia kręgowego. Technika ta została zademonstrowana na zwierzęciu, lecz jest w pełni możliwa do przeniesienia i jest obecnie stosowana w aplikacjach dla ludzi.

Streszczenie

Jest to zwięzły opis wizualny połączenia techniki chirurgicznej i urządzenia służącego do dostarczania terapii (genowych i komórkowych) do rdzenia kręgowego. Chociaż technika ta jest demonstrowana na zwierzętach, procedura ta posiada zatwierdzenie FDA i jest obecnie stosowana przy transplantacji komórek macierzystych do rdzenia kręgowego pacjentów z ALS. Mimo że FDA uznała dane potwierdzające zasadność (proof-of-principle) w zakresie skuteczności terapeutycznej w dobrze scharakteryzowanych modelach gryzoni, wykorzystanie dużych zwierząt uznaje się za kluczowe dla walidacji połączenia procedury chirurgicznej, urządzenia oraz bezpieczeństwa ostatecznej terapii przeznaczonej do stosowania u ludzi. Przyjmuje się, że wielkość, anatomia i ogólna podatność kręgosłupa oraz rdzenia kręgowego świń lepiej modelują anatomię ludzką. Ponadto chirurgiczny proces odsłaniania i manipulowania rdzeniem kręgowym, a także zamykania rany u świni, jest praktycznie nieodróżnialny od procedury u ludzi. Wierzymy, że model zdrowej świni stanowi krytyczny pierwszy krok w badaniu bezpieczeństwa proceduralnego.

Protokół

1. Wykorzystanie zwierząt

Procedury zaprezentowane w niniejszym materiale zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Emory. Wykorzystano samice miniprosiaków rasy Gottingen o masie ciała około 15-20 kg.

2. Znieczulenie

Zwierzęta są głodzone przez około 12 hr przed zabiegiem chirurgicznym. Sedacja i indukcja znieczulenia zwierząt polegają na podaniu domięśniowego koktajlu Ketaminy (35 mg/kg), Acepromazyny (1,1 mg/kg) oraz Atropiny (0,04 mg/kg). Następnie zwierzęta są intubowane i utrzymywane w znieczuleniu ogólnym przy użyciu tlenu oraz 1-3% izofluranu. Na tym etapie ogalane są plecy i głowa każdego zwierzęcia. Głębokość znieczulenia jest monitorowana przez personel weterynaryjny. W celu monitorowania głębokości znieczulenia wykorzystuje się brak odruchów między palcowymi, rogówkowymi i powiekowych, a także częstość akcji serca i oddechów, pulsoksymetrię, bezpośredni/pośredni pomiar ciśnienia krwi, pomiar stężenia dwutlenku węgla w powietrzu wydychanym (EtCO2) oraz napięcie mięśniowe/reakcję na bodźce bólowe.

3. Pozycjonowanie

Zwierzęta przenosi się do sali operacyjnej i układa w pozycji brzusznej na ramie zaprojektowanej specjalnie tak, aby naśladować ułożenie pacjentów na stole operacyjnym do chirurgii kręgosłupa Jacksona. Rama wykorzystuje regulowane temblaki umieszczane pod klatką piersiową i miednicą zwierzęcia, co pozwala na swobodne zwisanie brzucha, a tym samym minimalizuje ucisk na brzuch i klatkę piersiową oraz wynikające z tego krwawienie żylne z przestrzeni zewnątrzoponowej (Rycina 1). Rama zapewnia również zewnętrzną immobilizację kręgosłupa podczas procedury ¹.

Dodatkowo zwierzęta umieszcza się na ogrzewanej macie z obiegiem wody w celu utrzymania temperatury ciała, a w brzegową żyłę ucha wprowadza się cewnik do podawania płynów oraz wszelkich niezbędnych leków podczas operacji. Na koniec pole operacyjne przygotowuje się za pomocą alkoholu oraz roztworu chlorheksydyny lub betadyny, a następnie na polu operacyjnym rozkłada się chusty chirurgiczne.

4. Laminektomia

Wykonuje się nacięcie skóry o długości około 10-15 cm, a następnie obustronnie odsuwa się mięśnie przykręgosłupowe od kręgosłupa. Następnie przeprowadza się wielopoziomową laminektomię grzbietową. Blaszki łukowe i wyrostki kolczyste trzech kręgów nad segmentami C3-C5 lub L2-L4 usuwa się za pomocą kleszczyków korygujących i wiertarki chirurgicznej.

5. Ustawienie statywu do stabilizacji kręgosłupa

Urządzenie zaprojektowane do dostarczania terapii (genowych i komórkowych) do rdzenia kręgowego nazywamy Spinal Derrick ^2-5. Szczegółową dyskusję na temat konstrukcji i ewolucji tego urządzenia można znaleźć w pracy Riley et al., 2011. ⁴

Aby przymocować urządzenie do pacjenta, przez 1cm nacięcia skóry powyżej i poniżej nacięcia głównego wprowadza się trzpienie przezskórne, które następnie montuje się do łuków kręgów powyżej i poniżej nacięcia głównego.

Następnie dwa zintegrowane retraktory mocuje się do czterech powyższych i poniższych od miejsca nacięcia trzpieni przezskórnych, aby odsłonić obszar kręgosłupa, w którym wykonano laminektomię.

6. Otwarcie twardówki

Przy pomocy narzędzia stomatologicznego Woodsona i ostrza nr 11 wykonuje się nacięcie o długości 2,5 cm przez oponę twardą, odsłaniając rdzeń kręgowy. Oponę twardą odchyla się od warstwy opony miękkiej, używając szwu 4-0 Nurolon, i mocuje do głębokiej muskulatury przykręgosłupowej.

W przedniej i tylnej części otworu umieszcza się gaziki chirurgiczne. Stanowią one częściową barierę dla przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego i umożliwiają chirurgom bezpieczne rozmieszczenie ssaków bez uszkodzenia rdzenia. U ludzi, przy użyciu powiększenia mikroskopu chirurgicznego, w tym punkcie wykonuje się preparację powierzchni opon opiłkowatych. Ze względu na ograniczenia techniczne procedura ta nie jest wymagana ani możliwa do przeprowadzenia u zwierząt.

7. Iniekcje do rdzenia kręgowego i przemieszczenie boczne statywu stabilizującego kręgosłup w celu wykonania dodatkowych iniekcji

Bezpośrednio przed wstrzyknięciami podaje się dawkę Methylprednisolone (125 mg, IV), aby zapobiec obrzękowi rdzenia kręgowego.

Na tym etapie montuje się system szyn platformy, a szyny boczne dostosowuje się do odpowiedniej długości. Gondolę umieszcza się od góry na 2 prętach, a napęd osi Z montuje się na przegubie uniwersalnym. Następnie załadowaną kaniulę umieszcza się w mikro-napędzie. Za pomocą przegubu uniwersalnego na platformie do mikroiniekcji reguluje się kąty czołowy i strzałkowy, aby zapewnić trajektorię prostopadłą do powierzchni rdzenia kręgowego. Iniekcje wykonuje się po umieszczeniu kaniuli. Igłę pozycjonuje się odpowiednio przyśrodkowo względem strefy wejścia korzeni grzbietowych (DREZ). Strefę DREZ identyfikuje się przy użyciu lup chirurgicznych z powiększeniem 3,5X i przebija w trajektorii prostopadłej do powierzchni rdzenia w punkcie <1 mm przyśrodkowo.

U ludzi przedoperacyjne badanie MRI umożliwia wstępną ocenę wymiarów rdzenia kręgowego na potrzeby planowania operacyjnego. Ponadto mierzy się grubość rdzenia kręgowego, aby określić docelową głębokość rogu przedniego.

Suspensję wstrzykuje się na głębokość 4 mm od kontaktu z oponą miękką. Kołnierz wykonany z tworzywa ultem służy jako ogranicznik na powierzchni opony miękkiej, aby zapobiec przesunięciu igły głębiej niż zamierzono. Po ustawieniu końcówki igły w miejscu docelowym, sztywna metalowa zewnętrzna tuleja jest przesuwana do góry, odsłaniając elastyczną rurkę. Po zakończeniu wtryskiwania igłę pozostawia się w miejscu przez dodatkową 1 min, aby zapobiec cofaniu się komórek wzdłuż kanału wstrzyknięcia.

Należy zachować ostrożność, aby uniknąć naczyń krwionośnych powierzchniowych, delikatnie korygując położenie mikronapędu w płaszczyźnie bocznej lub wzdłuż osi przednio-tylnej. Może dojść do niewielkiego krwawienia w miejscach nakłucia. W przypadku wystąpienia krwawienia, w miejscu punkcji umieszcza się mikro tampony, a następnie stosuje odsysanie, aby odprowadzić krew z miejsca wprowadzenia kaniuli i zapobiec jej gromadzeniu się w rdzeniu. Pozwala to na skuteczne ścięcie krwi. Unika się stosowania kauteryzacji oraz bezpośredniego ucisku.

Po wyjęciu igły aparat stereotaksyczny przesuwa się do kolejnego miejsca docelowego wzdłuż osi rostralno-kaudalnej, w odstępach 2 lub 4 mm lub według potrzeb, aby uniknąć widocznych naczyń krwionośnych na powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego. Proces ten powtarza się tyle razy, ile przewidziano w danym badaniu.

8. Kaniula pływająca

Do iniekcji wykorzystuje się specjalnie wykonaną kaniulę infuzyjną o wąskiej średnicy. Kaniula składa się z igły skośnej o rozmiarze 30 G i stałej długości, połączonej z elastyczną rurką silastykową o rozmiarze 30 G i zmiennej długości. Dalszy koniec jest wyposażony w złączkę Hamilton luer lock, która jest podłączona do mikroinjektora. Proksymalna rurka silastykowa jest osłonięta sztywną kaniulą zewnętrzną o rozmiarze 24 G, która opiera się na proksymalnym końcu kołnierza igły iniekcyjnej. Kołnierz ten stabilizuje kaniulę zewnętrzną i służy jako ogranicznik głębokości dla igły iniekcyjnej. Przy każdej iniekcji odpowiednia objętość zawiesiny terapeutycznej jest podawana przy użyciu wcześniej skalibrowanej pompy mikroinjektora MINJ-PD (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) z prędkością 5 μl na minutę.

9. Zamknięcie

Po wykonaniu wszystkich wstrzyknięć ostrożnie usuwa się derrick rdzeniowy, a nacięcia zamyka się w czterech warstwach. Oponę twardą zamyka się szwem Nurolon 4.0 w sposób wodoszczelny. Do głębokiej warstwy mięśniowej stosuje się szew Vicryl 0. Następnie powięź zamyka się również w sposób wodoszczelny za pomocą szwu Vicryl 0. Warstwę skórną zamyka się na koniec szwem Vicryl 2.0, stosując szew ciągły. Zamknięcie skóry kończy się za pomocą szwu Nylon 3-0.

10. Rekonwalescencja i leczenie bólu

Zwierzęta są ekstubowane i monitorowane przez 2 hr po wybudzeniu z narkozy. Następnie zwierzęta są przenoszone do oddzielnych klatek i monitorowane co najmniej raz dziennie pod kątem spożycia pokarmu, defekacji oraz mickcji.

W celu uśmierzenia bólu, na grzbiet zwierząt przypina się zszywkami transdermльный plaster z Fentanylem (75 mcg), zapewniający trwającą trzy dni analgezję pooperacyjną. Dodatkowo, do trzech dni po operacji można podawać Buprenorfinę (0,05 mg/kg, BID, IM).

11. Wyniki i reprezentatywne rezultaty

Obserwacje kliniczne i behawioralne są przeprowadzane przed operacją, a następnie rejestrowane od 1. do 7. dnia oraz co tydzień aż do punktu końcowego, zgodnie z planem badania. Dane behawioralne są zbierane w celu oceny zachorowalności neurologicznej, zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶. Funkcje sensoryczne ocenia się na podstawie obecności lub braku odruchu wycofania w odpowiedzi na bodziec mechaniczny przyłożony do palców kończyn przednich i tylnych. Funkcje motoryczne ocenia się według skali Tarlova (Tabela 1): 0 – Paraliż, brak ruchu; 1 – Wyczuwalny tonus w kończynach tylnych, lekki ruch; 2 – Ruch w kończynach tylnych, ale brak zdolności do siedzenia lub stania; 3 – Zdolność do stania i chodzenia, lecz z ataksją i przez krótkie okresy; 4 – Całkowity powrót do zdrowia, prawidłowa funkcja motoryczna.

Bezpieczeństwo procedury określa się na podstawie zdolności zwierzęcia do powrotu do stanu wyjściowego sprzed operacji. Przejściowe deficyty neurologiczne powinny w większości ustąpić między 1. a 7. dniem po operacji, z pewnymi różnicami zależnymi od ras zwierząt oraz rodzaju procedury (m.in. liczby iniekcji). Trwała zachorowalność definiowana jest jako utrzymujące się deficyty neurologiczne, które nie ustępują do momentu, gdy zwierzęta osiągną domyślny punkt końcowy zgodny z wytycznymi IACUC (Rysunek 2).