Procedury chirurgiczne w szczurzym modelu częściowego ortotopowego przeszczepu wątroby z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej

Podsumowanie

Ortotopowe przeszczepienie wątroby u szczurów jest niezbędnym modelem eksperymentalnym w badaniach biomedycznych. W niniejszym materiale przedstawiamy procedury chirurgiczne ortotopowego przeszczepienia wątroby szczura z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej z wykorzystaniem 50% częściowego graftu.

Streszczenie

Ortotopowe przeszczepienie wątroby (OLT) u szczurów z wykorzystaniem graftu całkowitego lub częściowego jest niezbędnym modelem eksperymentalnym w badaniach nad transplantologią, takich jak studia nad konserwacją graftu i urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym ^1,2, odpowiedziami immunologicznymi ^3,4, hemodynamiką ^5,6 oraz zespołem małej wątroby (small-for-size syndrome) ⁷. Szczurzy model OLT należy do najtrudniejszych modeli zwierzęcych w chirurgii eksperymentalnej i wymaga zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych, których opanowanie zajmuje dużo czasu. W konsekwencji stosowanie tego modelu było ograniczone. Ponieważ wiarygodność i powtarzalność wyników są kluczowymi elementami eksperymentów, w których wykorzystuje się tak złożone modele zwierzęce, niezbędne jest, aby chirurdzy zaangażowani w procedury OLT u szczurów zostali przeszkoleni w dobrze wystandaryzowanych i zaawansowanych metodach dla tego modelu.

Choć od czasu opisania pierwszego modelu przez Lee et al. ⁹ w 1973 roku zgłaszano różne techniki i modyfikacje OLT u szczurów ⁸, wyeliminowanie rekonstrukcji tętnicy wątrobowej ¹⁰ oraz wprowadzenie techniki anastomozy z mankietem przez Kamadę et al. ¹¹ stanowiły istotny postęp w tym modelu, ponieważ w znacznym stopniu uprościły procedury rekonstrukcji. W modelu opracowanym przez Kamadę et al. wyeliminowano również rearterializację wątroby. Ponieważ szczury mogły przeżyć bez przepływu w tętnicy wątrobowej po przeszczepieniu wątroby, istniały znaczne kontrowersje dotyczące wartości arterializacji wątrobowej. Niemniej jednak coraz częściej uznaje się przewagę fizjologiczną modelu z arterializacją, zwłaszcza w zakresie zachowania układu przewodów żółciowych ^8,12 oraz integralności wątroby ^8,13,14.

W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe procedury chirurgiczne dla szczurzego modelu OLT z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej przy użyciu 50% przeszczepu częściowego po resekcji wątroby ex vivo. Procedury rekonstrukcji każdego naczynia oraz przewodu żółciowego są wykonywane zgodnie z następującymi metodami: szwem ciągłym z polipropylenu 7-0 w przypadku żyły głównej powyżej i poniżej wątroby; techniką mankietową dla żyły wrotnej oraz techniką stentową dla tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego.

Protokół

1. Podstawowe techniki i powszechne procedury

1. Wszystkie procedury są przeprowadzane w warunkach czystych, ale niesterylnych.
2. Po otwarciu jamy brzusznej szczura wszystkie czynności wykonuje się pod mikroskopem chirurgicznym przy powiększeniu 16x. Wyjątkiem jest resekcja wątroby ex vivo, którą wykonuje się przy powiększeniu 10x, oraz następujące procedury, wykonywane przy powiększeniu 25x: wprowadzenie stentu do przewodu żółciowego i tętnicy wątrobowej oraz rekonstrukcja tętnicy wątrobowej, żyły głównej podwątrobowej (IHVC) i przewodu żółciowego.
3. Bawełniane tampony służą do delikatnej manipulacji narządami, rozwarstwiania tkanek oraz hemostazy uciskowej. Gaziki (5 x 5 cm) nasączone roztworem Ringera z mleczanami są wykorzystywane do odsuwania wątroby lub jelit oraz do utrzymywania wilgotności narządów. Kleszczyk Satinsky’ego może być użyty do odsunięcia osłoniętych gazikami jelit w kierunku lewym lub ku ogonowi szczura, aby poszerzyć pole operacyjne wokół IHVC.
4. Wszystkie podwiązania wykonuje się nicią jedwabną 6-0, z wyjątkiem szypułek płatów wątroby podczas resekcji wątroby ex vivo, gdzie stosuje się nici jedwabne 4-0. Ligaturę można odciągnąć kleszczykiem DeBakey Bulldog lub innym instrumentem, aby zapewnić odpowiednie napięcie w punkcie podwiązanym, co umożliwia wykonanie drugiej ligatury w pewnej odległości od pierwszej i prawidłowe rozcięcie między obydwoma punktami podwiązania.
5. Wszystkie iniekcje dożylne są wykonywane przez żyłę prąciową.
6. Podczas procedur rekonstrukcji żyły głównej nadwątrobowej (SHVC), żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego używa się niewielkiej grudki gliny na bazie oleju do unieruchomienia pierścienia palcowego kleszczyka naczyniowego lub kleszczyka typu mosquito w stałej pozycji.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Jako dawcy i biorcy w transplantacji wątroby wykorzystuje się samce szczurów linii Lewis o masie od 230 do 250 g. Szczury mają swobodny dostęp do wody i pokarmu aż do momentu indukcji znieczulenia.
2. Mankiet do żyły wrotnej (Ryc. 1): Mankiet do żyły wrotnej przygotowuje się poprzez przecięcie cewnika o rozmiarze 14G za pomocą ostrza skalpela nr 11 pod mikroskopem. Mankiet składa się z korpusu i przedłużenia, z których każdy ma długość 2 mm. W mankiecie wykonuje się rowki okrężne, zaciskając ściankę mankietu krok po kroku wzdłuż obwodu kleszczykami typu mosquito, tak aby nić mogła zostać ściśle zamocowana na mankiecie bez możliwości ześlizgnięcia się.
3. Stenty do przewodu żółciowego i tętnicy wątrobowej (Ryc. 1): Cewniki o rozmiarze 24G przecina się skalpelem pod mikroskopem, aby utworzyć skośne końcówki na obu końcach cewników; długość stentu do tętnicy wątrobowej powinna wynosić 4 mm, a do przewodu żółciowego 5 mm.

3. Operacja u dawcy

Schemat usuwania wątroby od szczura dawcy przedstawiono na Rysunku 2. Procedura ta zajmuje około 30-35 min.

1. Zanurzyć szczura w znieczuleniu poprzez inhalację 4 vol% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 4 L/min w celu indukcji znieczulenia oraz 1,5 vol% przy 2 L/min w celu jego podtrzymania. Podać buprenorfinę (0,1 mg/kg) podskórnie jako środek przeciwbólowy. Umieścić szczura na podgrzewaczu i unieruchomić przedramiona za pomocą magnetycznego systemu retrakcji (Rysunek 3a). Wygoić sierść z całego obszaru brzucha szczura i wysterylizować odpowiedni obszar skóry roztworem powidonu z jodem.
2. Otworzyć jamę brzuszną poprzez nacięcie w linii pośrodkowej z dwustronnymi rozszerzeniami. Umieścić strzykawkę 5-ml pod grzbietem szczura tak, aby SHVC była uniesiona brzusznie. Za pomocą kleszczyków typu mosquito zacisnąć i pociągnąć wyrostek mieczowaty w stronę głowy, a następnie zastosować rozwieracze podżebrowe, aby otworzyć pole operacyjne (Rysunek 3a).
3. Przeprowadzić preparację więzadła okrągłego wątroby oraz lewego więzadła trójkątnego. Następnie podwiązać i przeciąć lewą żyłę przeponową.
4. Odsunąć płat środkowy i lewy płat boczny ku górze za pomocą mokrego gazika. Używając pincety bipolarnej, koagulować i przeciąć naczynia okołooesofagealne pomiędzy lewym płatem bocznym a przednim płatem ogonowym.
5. Wysunąć jelita poza jamę brzuszną na lewą stronę szczura i przykryć je mokrym gazikiem. Odsunąć prawy płat boczny ku górze za pomocą mokrego gazika. Wypreparować IHVC z tkanki zaotrzewnowej i podwiązać prawą żyłę nadnerczową, którą zostanie przeciąta później, tuż przed usunięciem przeszczepu.
6. W celu wprowadzenia stentu do przewodu żółciowego (Rysunek 3b):
   1. Podwiązać przewód żółciowy na poziomie rozgałęzienia tętnicy gastroduodenalnej. Tkanki miękkie otaczające przewód żółciowy powinny zostać zachowane w możliwie największym stopniu, a należy unikać oddzielania przewodu żółciowego od tętnicy wątrobowej, aby zapewnić wystarczające unaczynienie tętnicze przewodu żółciowego.
   2. Za pomocą prostych mikronożyczek wykonać niewielkie nacięcie w przedniej ścianie przewodu żółciowego proksymalnie względem miejsca podwiązania. Trzymając przednią ścianę nacięcia prostą mikropincetą w lewej ręce, wprowadzić stent do przewodu za pomocą zakrzywionej mikropincety w prawej ręce i zabezpieczyć go nicią jedwabną 6-0. Jeden z uciętych końców nici na przewodzie żółciowym pozostawia się o długości 4 mm, tak aby nić można było chwycić podczas późniejszej anastomozy.
7. Uwolnić żyłę wrotną od żył odżołądkowych i śledzionowej poprzez ich podwiązanie i przecięcie.
8. Podwiązać i przeciąć tętnicę gastroduodenalną, a następnie wypreparować wspólną tętnicę wątrobową (CHA) od głowy trzustki do jej odejścia. Obrócić wątrobę w prawo za pomocą tamponów bawełnianych i wypreparować więzadła wokół tylnej części wątroby i przełyku.
9. Po zakończeniu przygotowań do wycięcia wątroby usunąć rozwieracze, kleszczyki typu mosquito z wyrostka mieczowatego oraz strzykawkę 5-ml spod grzbietu szczura. Wprowadzić jelita z powrotem do jamy brzusznej.
10. Wstrzyknąć 500 IU heparyny sodowej w 2 ml roztworu soli fizjologicznej przez żyłę prątną. Około 3 min później ponownie umieścić strzykawkę 5-ml, kleszczyki typu mosquito i rozwieracze. Podwiązać CHA proksymalnie względem jej odejścia. Pozostawić jeden z uciętych końców nici podwiązującej CHA jako długi.
11. Po zacisnięciu IHVC blisko prawej żyły nerkowej kleszczykami typu mosquito, zacisnąć żyłę wrotną jednorazowym mikro clampem naczyniowym poniżej kikuta żyły śledzionowej. Naciąć przednią ścianę żyły wrotnej i wprowadzić do niej cewnik 18-gauge.
12. Przeprowadzić perfuzję wątroby in situ 60 ml zimnego roztworu histydyny-tryptofanu-ketoglutaranu (HTK) przy ciśnieniu hydrostatycznym 20 cm H₂O. Natychmiast po tym przeciąć przeponę i przetnieć żyłę główną w klatce piersiowej oraz rozciąć przednią ścianę IHVC, aby umożliwić wypłukanie roztworu perfuzyjnego z wątroby (Rysunek 3c).
13. Zacisnąć IHVC jednorazowym mikro clampem naczyniowym tuż poniżej wątroby. Wyciąć wątrobę, przecinając IHVC nieco poniżej punktu środkowego między wątrobą a prawą żyłą nerkową, żyłę wrotną poniżej kikuta żyły śledzionowej, przeponę, pozostałe więzadła z tyłu wątroby, prawą żyłę nadnerczową oraz CHA u jej odejścia. Umieścić wyciętą wątrobę w zimnym roztworze HTK w metalowym kubku umieszczonym w plastikowym pojemniku wypełnionym kruszonym lodem.

4. Przygotowanie przeszczepu ex vivo

Wszystkie procedury dotyczące przeszczepu wątroby są wykonywane w metalowym naczyniu wypełnionym lodowatym roztworem HTK. Przygotowanie przeszczepu ex vivo zajmuje około 30 min.

1. W celu przymocowania mankietu do żyły wrotnej (Rysunek 4):
   Zaklemuj pień żyły wrotnej za pomocą klemą DeBakey Bulldog. Umieść klemę w pozycji mostkowej nad kielichem (Rysunek 4a, b). Przeciągnij żyłę wrotną przez mankiet i ponownie zaklemuj żyłę wrotną wraz z przedłużeniem mankietu w pozycji godziny 12:00 (Rysunek 4c). Wywiń ścianę żyły wrotnej na mankiet, aby umieścić kikut żyły śledzionowej na zewnątrz mankietu w pozycji godziny 7:00 (Rysunek 4d), a następnie zabezpiecz żyłę wrotną nicią jedwabną 6-0 (Rysunek 4e).
2. Aby wprowadzić stent do tętnicy wątrobowej (Rysunek 5):
   Ustabilizuj wątrobę, zaklemowując oba brzegi przepony pęsetami, i naciągnij CHA, trzymając podwiązaną nić klemą DeBakey Bulldog (Rysunek 5a). Za pomocą prostych mikronozycyc wykonaj niewielkie nacięcie w przedniej ścianie CHA. Lewą ręką przytrzymaj przednią ścianę nacięcia prostą mikropęsetą, a prawą ręką wprowadź stent do CHA za pomocą zakrzywionej mikropęsety. Stent należy wcześniej wypłukać roztworem heparyny sodowej (100 IU/ml) (Rysunek 5b-d). Zabezpiecz stent nicią jedwabną 6-0, pozostawiając jeden z przeciętych końców nici o długości 4 mm. Przepłucz wątrobę przez cewnik tętniczy 5 ml zimnego roztworu HTK.
3. W celu resekcji 50% wątroby (Rysunek 6):
   1. Zaklemuj tylny płat ogona wątroby pęsetą typu mosquito, aby go unieruchomić. Wyresekuj płat po podwiązaniu jego szypuły nicią jedwabną 4-0 (Rysunek 7a). W ten sam sposób usuń przedni płat ogona wątroby.
   2. Obróć plastikowe pudełko o 90 stopni. Zaklemuj prawy brzeg przepony oraz lewą część płata środkowego. Wykonaj niewielkie nacięcie na górnej krawędzi granicy obu części płata środkowego, a następnie usuń część lewą po podwiązaniu (Rysunek 7b). Usuń lewy płat boczny po podwiązaniu szypuły nicią jedwabną 4-0. Ostrożnie kauteryzuj powierzchnię resekowanej wątroby pęsetą bipolarną. W rezultacie masa wątroby zostaje zredukowana o około 50% ¹⁵ (Rysunek 7c, d).
4. W celu plastyki SHVC (Rysunek 8):
   Ustabilizuj położenie wątroby, zaklemowując oba brzegi przepony pęsetą typu mosquito (Rysunek 8a). Przytnij przednią ścianę SHVC, usuwając odpowiadający jej fragment przepony. Za pomocą dwóch szwów z polipropylenu 7-0 wykonaj szwy stabilizujące od zewnątrz do wewnątrz w obu rogach na potrzeby późniejszego zespolenia (Rysunek 8b). Następnie przytnij tylną ścianę SHVC.
5. Przechowuj przeszczep wątroby w temperaturze 4 °C w roztworze HTK w kąpieli wodnej z lodem.

5. Operacja u biorcy

Schemat implantacji przeszczepu u szczura biorcy przedstawiono na Rysunku 9. Operacja biorcy trwa 60-70 min, co obejmuje 10-11 min czasu anhepatycznego oraz około 23-24 min czasu zaklemowania IHVC.

1. Wykonaj te same procedury, co w operacji dawcy (od 3.1 do 3.4), z wyjątkiem otwarcia jamy brzusznej poprzez cięcie pośrodkowe, bez rozszerzeń bocznych (Rysunek 10a).
2. Umieść wilgotną gazą nad prawą stroną dwunastnicy i całością jelit, aby uzyskać pole operacyjne wokół IHVC. Przesuń lewy płat boczny i środkowy do lewej jamy podprzeponowej, a prawy płat boczny odsunie w górę za pomocą wilgotnej gazy. Wyizoluj IHVC z tkanki zaotrzewnowej. Podwiąż i przetnij prawą żyłę nadnerczową (Rysunek 10b). Za pomocą wilgotnej gazy i tamponów bawełnianych obróć wątrobę w lewo i roz剖 wiązadło z tyłu wątroby.
3. Przywróć prawy płat boczny do pozycji anatomicznej. Umieść wilgotną gazą, aby przykryć i odsunąć płat środkowy i lewy płat boczny w górę. Przetnij przewód żółciowy tuż poniżej odgałęzienia z płata ogonowego. Tkanki miękkie otaczające przewód żółciowy powinny zostać zachowane w maksymalnym możliwym stopniu. Pozostaw jeden z przeciętych końców nici użytej do podwiązania przewodu żółciowego o długości 4 mm.
4. Podwiąż i przetnij tętnicę gastroduodenalną oraz tętnicę wątrobową właściwą w odległości 3 mm od odgałęzienia z CHA. Następnie uformuj strukturę w kształcie litery Y z tętnicy na końcu CHA. Pozostaw jeden z przeciętych końców nici użytej do podwiązania tętnicy wątrobowej właściwej o długości 4 mm. Obróć wątrobę w prawo za pomocą tamponów bawełnianych i roz剖 wiązadło z tyłu wątroby od strony lewej.
5. Po dożylnym wstrzyknięciu 2 ml roztworu Ringera z mleczanami, zaklemuj IHVC za pomocą metalowego mikro clampa naczyniowego tuż powyżej prawej żyły nerkowej. Zaklemuj żyłę wrotną na poziomie jej rozwidlenia w wrocie wątroby za pomocą kleszczyków typu mosquito z lewej strony szczura. Zaklemuj SHVC wraz z przeponą z prawej strony za pomocą clampa naczyniowego obwodowego i przymocuj pierścień kleszczyka w grudce glinki na bazie oleju.
6. Zredukuj anestezję izofluranem do 0,4 vol% w czasie anhepatycznym (czas trwania przeklemowania żyły wrotnej). Wy Excise natywną wątrobę biorcy poprzez roz剖 SHVC, żyły wrotnej i IHVC na następujących poziomach: SHVC na granicy między SHVC a wątrobą; żyły wrotnej tuż powyżej szczęk kleszczyków mosquito; oraz IHVC nieco poniżej punktu środkowego między wątrobą a prawą żyłą nerkową (Rysunek 10c). Umieść graft wątroby ortotopowo.
7. W celu wykonania anastomozy SHVC szwem ciągłym (Rysunek 11):
   1. Podczas szycia używaj zakrzywionych mikropincet w lewej ręce do chwytania ściany naczynia lub trzymania igły chirurgicznej. Najpierw załóż szew stabilizujący na SHVC biorcy od wewnątrz na zewnątrz, używając dołączonego polipropylenu 7-0 w prawym rogu graftu, a następnie zawiąż węzeł (lub można go zawiązać po zakończeniu wszystkich procedur szycia). Następnie w ten sam sposób załóż drugi szew stabilizujący w lewym rogu, który będzie pierwszym ściegiem szwu ciągłego. Aby poszerzyć anastomozę, chwyć i utrzymuj szwy za pomocą clampów DeBakey bulldog w obu rogach, stosując delikatną trakcję w kierunku górno-bocznym (Rysunek 11a, b).
   2. Przebij szew w lewym rogu przez ścianę po stronie graftu od zewnątrz do wewnątrz, blisko węzła na zewnątrz, i zaszyj tylny rząd SHVC wewnątrzświatowo, wykonując od 7 do 8 szwów w kierunku prawego rogu (Rysunek 11c). Wykonaj pierwsze kilka szwów ostrożnie, tak aby światła wewnętrzne były zwrócone ku sobie. W prawym rogu przebij polipropylen 7-0 przez naczynie po stronie graftu na zewnątrz.
   3. Następnie zaszyj rząd przedni od zewnątrz, od prawej do lewej, wykonując około 10 szwów (Rysunek 11d). Przed zakończeniem rzędu przedniego przemyj wnętrze roztworem Ringera z mleczanami, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wykonaj ostatni szew w rzędzie przednim jak najbliżej szwu stabilizującego w lewym rogu, a następnie zwiąż je ze sobą.
8. W celu rekonstrukcji żyły wrotnej techniką mankietową (Rysunek 12):
   1. Odsunie płat środkowy i lewy płat boczny w górę za pomocą wilgotnej gazy. Zaklemuj żyłę wrotną biorcy w miejscu jej połączenia z żyłą odyniczą, używając jednorazowego mikro clampa naczyniowego z prawej strony. Przymocuj kleszczyki mosquito zaklemowujące żyłę wrotną w glince i pociągnij końcówkę kleszczyków w stronę wrot wątroby (Rysunek 12a, b).
   2. Nacinaj ścianę przednią żyły wrotnej tuż poniżej szczęk kleszczyków mosquito. Przemyj wnętrze żyły wrotnej biorcy oraz mankiet roztworem Ringera z mleczanami. Przytrzymaj ścianę przednią nacięcia prostą mikropincetą w lewej ręce, a przedłużenie mankietu zakrzywioną mikropincetą w prawej ręce. Wprowadź mankiet głęboko do żyły wrotnej biorcy i zabezpiecz go okrężną nicią jedwabną 6-0 (Rysunek 12c-f).
   3. Zdejmij clampy z żyły wrotnej i SHVC, a następnie reperfunduj wątrobę. Usuń strzykawkę 5-ml z tyłu szczura i zwiększ stężenie izofluranu do 0,8 vol%.
9. W celu rekonstrukcji tętnicy wątrobowej techniką stentową ¹⁶ (Rysunek 13):
   1. Najpierw chwyć nić tętnicy wątrobowej właściwej biorcy kleszczykami mosquito z lewej strony i pociągnij ją w stronę wrot wątroby, a następnie zaklemuj CHA biorcy z prawej strony blisko trzustki (Rysunek 13a).
   2. Za pomocą prostej mikropincety wykonaj małe nacięcie w rozwidleniu struktury Y na końcu CHA biorcy, aby stworzyć otwór w kształcie lejka. Przytrzymaj stent umieszczony w CHA graftu zakrzywioną mikropincetą. Po przemyciu każdego światła roztworem Heparyny sodowej (100 IU/ml), wsuń stent do CHA biorcy i zabezpiecz go nicią jedwabną 6-0. Zwiąż jeden koniec tej nici na CHA biorcy z 4-mm nicią na CHA graftu, tak aby oba naczynia CHA zbliżyły się do siebie, co zmniejszy napięcie w miejscu anastomozy (Rysunek 13b). Następnie zdejmij clamp.
10. W celu wykonania anastomozy IHVC szwem ciągłym (Rysunek 14):
    Wykonaj anastomozę w ten sam sposób, co w przypadku SHVC, ale użyj większej liczby szwów z mniejszymi prześwitami (Rysunek 14a-d). Można zrezygnować z wiązania szwów przy ostatnim ściegu lub wykonać wiązanie z uwzględnieniem czynnika wzrostu, aby uniknąć zwężenia anastomozy spowodowanego zbyt mocnym zaciśnięciem. Po zdjęciu clampów zwiększ stężenie anestetyku do 1,0 vol%. Jeśli anastomoza wydaje się zwężona, rozszerz miejsce anastomozy poprzez pociągnięcie dwustronnych szwów stabilizujących lub delikatne rozszerzenie rzędu przedniego, aby poszerzyć anastomozę.
11. Podaj dożylnie 0,5 ml 8,4% roztworu wodorowęglanu sodu wraz z 1,0 ml roztworu Ringera z mleczanami.
12. Nałóż małe fragmenty Tachisilu, aby uszczelnić powierzchnię wyciętej wątroby, co zapobiegnie krwawieniu i wyciekowi żółci.
13. W celu rekonstrukcji przewodu żółciowego techniką stentową:
    1. Chwyć nić przewodu żółciowego biorcy kleszczykami mosquito z lewej strony. Przymocuj kleszczyki mosquito w glince i pociągnij końcówkę kleszczyków w stronę wrot wątroby.
    2. Wykonaj małe nacięcie w przewodzie żółciowym na odpowiednim poziomie, tak aby zrekonstruowany przewód żółciowy nie był zbyt długi. Wprowadź stent umieszczony w przewodzie żółciowym graftu do przewodu biorcy, uważając, aby nie doszło do skręcenia, i zabezpiecz go nicią jedwabną 6-0. Zwiąż tę nić na przewodzie biorcy z 4-mm nicią na przewodzie graftu, tak aby oba przewody zbliżyły się do siebie, co zmniejszy napięcie w miejscu anastomozy.
14. Po zakończeniu procedur rekonstrukcyjnych wstrzyknij dożylnie 1 ml 5% roztworu glukozy (Rysunek 15).
15. Potwierdź odpowiednią hemostazę, a następnie zamknij nacięcie brzuszne szwem ciągłym 4-0 Vicryl w dwóch warstwach.

6. Leczenie pooperacyjne i obserwacja

Bezpośrednio po operacji podaj szczurowi biorcy podskórnie cefuroksym sodowy (16 mg/kg) oraz buprenorfinę (0,1 mg/kg) w łącznej objętości 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej. Pozostaw szczura na 60 min w celu rekonwalescencji w specjalnej klatce oddziału intensywnej opieki z ogrzanym powietrzem (30-35 °C) i dopływem tlenu. Przez 3 dni co 12 godzin podawaj podskórnie buprenorfinę (0,1 mg/kg) jako środek przeciwbólowy. Następnie przenieś szczura do zwykłej klatki, zapewniając mu swobodny dostęp do wody i pokarmu.

Wyniki

Wszystkie szczury biorcy (n = 20) przeżyły bez widocznych powikłań do czasu planowanej eutanazji w celu pobrania krwi w 1., 3., 24. i 168. godzinie (7 dni) po reperfuzji wrotnej (n = 5 w każdym punkcie czasowym). Próbki krwi pobrano z IHVC poprzez bezpośrednie nakłucie igłą 27G. Po wirowaniu przy 5,340 x g przez 10 min uzyskano próbki surowicy, w których oznaczono poziomy aminotransferazy alaninowej (ALT), odzwierciedlające stopień uszkodzenia hepatocytów po transplantacji. Przebieg zmian poziomów ALT w surowicy przedstawiono na Ryc. 16. Poziomy ALT osiągnęły szczyt w 24. godzinie (średnia ± odchylenie standardowe: 212,6 ± 67,9 IU/L), a następnie spadły do poziomu normy w 168. godzinie (33,6 ± 6,8 IU/L).

Rysunek 1. Mankiet do żyły wrotnej (PV) wykonany z cewnika 14G oraz stenty do tętnicy wątrobowej (HA) i przewodu żółciowego (BD) wykonane z cewników 24G.

Rysunek 2. Schemat pobrania wątroby od szczura dawcy. BD, przewód żółciowy; HA, tętnica wątrobowa; IHVC, żyła główna dolna (podwątrobowa); PV, żyła wrotna; SHVC, żyła główna dolna (nadwątrobowa).

Rycina 3. Operacja dawcy. a. Szczur zostaje umieszczony na podgrzewanej podkładce z systemem retrakcji z ustalaczem magnetycznym. Brzuch zostaje otwarty poprzez nacięcie w linii środkowej z dwustronnymi rozszerzeniami. b. Wprowadzenie stentu do przewodu żółciowego. c. Perfuzja wątroby przez żyłę wrotną. Skróty wyjaśniono na Rycynie 2.

Rysunek 4. Mocowanie mankietu do żyły wrotnej. a,b. Zacisk DeBakey Bulldog, służący do chwytania pnia żyły wrotnej, jest umieszczony nad metalowym pucharkiem. Pucharek zamontowano w plastikowym pudełku wypełnionym kruszonym lodem. c. Żyła wrotna jest prowadzona przez mankiet. d. Ściana żyły wrotnej zostaje wywinięta na mankiet, przy czym kikut żyły śledzionowej znajduje się poza mankietem na pozycji godziny 7, a przedłużenie mankietu na pozycji godziny 12. e. Żyła wrotna zostaje zabezpieczona na mankiecie obwodowym szwem z nici jedwabnej 6-0. Czarne strzałki wskazują kikut żyły śledzionowej.

Rysunek 5. Ex vivo wprowadzenie stentu do tętnicy wątrobowej. a. Wątróbę unieruchomiono poprzez zacisknięcie obu krawędzi przepony, a tętnicę wątrobową naciągnięto, trzymając nić służącą do jej podwiązania. b. Przednią ściankę niewielkiego nacięcia w tętnicy wątrobowej przytrzymano prostą mikropincetą. c, d. Stent wprowadzono do tętnicy wątrobowej i zabezpieczono nicią jedwabną 6-0.

Rycina 6. Schemat 50% resekcji wątroby ex vivo. Płaty w kolorze szarym zostają usunięte. ACL, przedni płat ogonowy; PCL, tylny płat ogonowy; LLL, lewy płat boczny; LML, lewa część płata środkowego; RML, prawa część płata środkowego; SRL, górny prawy płat boczny; IRL, dolny prawy płat boczny.

Rycina 7. 50% resekcja wątroby ex vivo. a. Podwiązanie szypuły tylnego płata ogonowego. b. Podwiązanie szypuły lewej części płata środkowego. c. Wątroba przed 50% resekcją. d. Wątroba po 50% resekcji.

Rycina 8. Plastyka ex vivo żyły głównej dolnej w odcinku nadwątrobowym. a. Wątroba zostaje unieruchomiona poprzez zaklemowanie obu krawędzi przepony kleszczykami typu mosquito. b. W obu narożnikach założone zostają szwy stabilizujące z polipropylenu 7-0.

Rysunek 9. Schemat implantacji przeszczepu u szczura biorcy. Procedury rekonstrukcyjne są wykonywane dla żyły głównej górnej i dolnej w odniesieniu do wątroby (SHVC i IHVC) za pomocą szwu ciągłego 7-0, dla żyły wrotnej (PV) techniką mankietową, a dla tętnicy wątrobowej (HA) i przewodu żółciowego (BD) techniką stentową.

Rycina 10. Operacja biorcy aż do momentu usunięcia rodzimej wątroby. a. Jamę brzuszną otwiera się poprzez nacięcie w linii pośrodkowej. b. Żyła nadnerczowa prawa zostaje podwiązana. c. Rodzima wątroba zostaje wycięta. Skróty wyjaśniono na Rycini 2.

Rycina 11. Anastomoza żyły głównej górnej w odcinku nadwątrobowym. a, b. Obwodowy zacisk naczyniowy dla żyły głównej górnej w odcinku nadwątrobowym jest unieruchomiony w bryle glinki na bazie oleju. Szwy stabilizujące w obu narożnikach są utrzymywane przy łagodnej trakcji w kierunku górno-bocznym, aby rozszerzyć anastomozę. c. W toku ciągłe szycie wewnątrzświatłowe rzędu tylnego. d. W toku ciągłe szycie rzędu przedniego.

Rycina 12. Rekonstrukcja żyły wrotnej. a, b. Kleszczyki anatomiczne zaciskające żyłę wrotną są unieruchomione w glinie na bazie oleju i odciągnięte w stronę wnęki wątroby. c-f. Wprowadzenie mankietu do żyły wrotnej.

Rysunek 13. Rekonstrukcja tętnicy wątrobowej. a, b. Wprowadzenie stentu do wspólnej tętnicy wątrobowej (CHA) biorcy na poziomie rozgałęzienia tętnicy właściwej wątrobowej (PHA) i tętnicy żołądkowo-dwunastniczej (GDA).

Rysunek 14. Anastomoza podwątrobowej żyły głównej. a. Szwy stabilizujące w obu narożnikach. b. Ciągły szew rzędu tylnego. c. Ciągły szew rzędu przedniego. d. Reperfuzja podwątrobowej żyły głównej. Skróty wyjaśniono na Rysunku 2.

Rycina 15. Wszystkie procedury rekonstrukcyjne zostały zakończone. Skróty wyjaśniono na Rycini 2.

Rycina 16. Pooperacyjny przebieg zmian poziomu aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy (n = 20; n = 5 w każdym punkcie czasowym). Dane przedstawiono jako średnie, a słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. Poziom ALT osiągnął szczyt w 24 hr (212,6 ± 67,9 IU/L), a następnie spadł do granic normy w 168 hr (33,6 ± 6,8 IU/L).

Dyskusja

Pierwszy model przeszczepienia wątroby (OLT) u szczurów został opisany przez Lee et al. w 1973 roku ⁹, w którym wszystkie naczynia, w tym tętnica wątrobowa, zostały zrekonstruowane metodą szycia ręcznego z zastosowaniem pozacieleśnego przeciągu portosystemicznego. Model ten był skomplikowany technicznie i trudny do wykonania. Kolejny model, opracowany przez tych samych autorów w 1975 roku ¹⁰, nie obejmował rekonstrukcji tętnicy wątrobowej ani przeciągu pozacieleśnego. Następnie, w 1979 roku, Kamada et al. wprowadzili technikę anastomozy z użyciem mankietu dla modelu bez rearterializacji wątroby ¹¹. Dzięki tym modyfikacjom procedura OLT u szczurów została uproszczona, co skróciło czas anhepatyczny w operacjach biorców, i stała się powszechnie stosowanym, uznanym modelem eksperymentalnym.

Od tego czasu narosło jednak wiele kontrowersji dotyczących znaczenia arteryzacji wątroby w modelu OLT u szczurów ⁸, ponieważ arteryzacja była zadaniem wymagającym, a nie wpływała na przeżywalność po transplantacji. Opisano liczne badania nad arteryzacją wątroby z wykorzystaniem różnych technik rekonstrukcji ⁸, takich jak anastomoza segmentu aorty do aorty ^3,9,17, technika anastomozy z mankietem ^18,19,20, technika teleskopowa ⁵, technika ze stentem ^13,16 oraz technika anastomozy typu sleeve ^12,21-23. Choć technika OLT u szczurów nie jest obecnie ustandaryzowana, model z arteryzacją jest coraz częściej preferowany ze względu na jego przewagę fizjologiczną ^8,12,13,14. spośród wyżej wymienionych technik, Lehmann et al. ¹⁶ opisali w 2005 roku technikę ze stentem, która była prosta i szybka w wykonaniu. Badanie wykazało doskonałe wyniki: nie zaobserwowano wskaźnika niedrożności w zrekonstruowanej tętnicy wątrobowej w 8. godzinie, 24. godzinie oraz po 6 miesiącach od reperfuzji. Dlatego przyjęliśmy tę technikę do przeprowadzenia arteryzacji wątroby.

Wykonujemy ręcznie szytą anastomozę w celu rekonstrukcji SHVC i IHVC. Metoda ta zapewnia optymalne warunki fizjologiczne w miejscu zespolenia, co prowadzi do zmniejszenia częstości występowania zakrzepicy ⁸, oraz stanowi najlepszą symulację i trening mikrochirurgiczny dla chirurgów. Ponadto anastomoza jest możliwa do przeprowadzenia nawet w przypadku krótkich kikutów naczyń. W odniesieniu do anastomozy IHVC, metoda ta nie wymaga długiej IHVC po stronie przeszczepu w porównaniu z techniką anastomozy mankietowej. Zatem w sytuacjach, gdy żyła nerkowa dawcy jest preparowana w celu wydłużenia IHVC przeszczepu, metoda ta znajduje zastosowanie przy transplantacji małych fragmentów wymagających długiej IHVC, takich jak przeszczep 30% składający się z prawego płata bocznego i płata ogonowego z krótką wewnątrzwątrobową żyłą główną bez SHVC ².

W odniesieniu do technik resekcji wątroby u szczurów, do tej pory opisano kilka metod; dwiema głównymi technikami są klasyczna metoda podwiązania masy tkankowej oraz technika zorientowana na naczynia ²⁴. W celu wykonania resekcji 50% wątroby stosujemy klasyczną technikę podwiązania¹⁵, jednak z wykorzystaniem mikroskopu chirurgicznego, aby zwiększyć precyzję zabiegu oraz uniknąć uszkodzenia pozostałych płatów i struktur.

Opisano reprezentatywne wyniki uzyskane u szczurów biorców w naszym modelu; zwierzęta przeżyły 7-dniowy okres obserwacji bez widocznych powikłań. Model można modyfikować w zależności od celu eksperymentu, dobierając różne parametry, takie jak przedłużone przechowywanie w niskiej temperaturze, przedłużone niedokrwienie na ciepło (w tym donację po zgonie krążeniowym) oraz zastosowanie mniejszych przeszczepów wątroby lub przeszczepów z eksperymentalnych modeli uszkodzeń lub chorób wątroby.

W naszym doświadczeniu istnieją trzy kluczowe czynniki w trakcie procedur, które mogą wpłynąć na przeżywalność po transplantacji, będącej najwiarygodniejszym parametrem wyników OLT u szczura: ilość utraconej krwi; czas operacji, zwłaszcza czas zaciskania żyły wrotnej oraz dolnej żyły głównej (IHVC); oraz poprawność rekonstrukcji każdego naczynia, co może skutkować stenozą, zakrzepicą lub krwawieniem. W okresie szkolenia w tym modelu większość niepowodzeń prawdopodobnie wynikała z tych czynników. W niniejszym artykule wideo przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące procedur chirurgicznych dla naszego szczurego modelu częściowej OLT z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej. Choć szczury model OLT jest skomplikowany i wymaga zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych, artykuł ten dostarcza wielu praktycznych informacji, które powinny służyć jako dobry przewodnik w treningu i nauce tego modelu. Efektywna nauka tego modelu jest szczególnie istotna dla skrócenia okresu szkolenia, zmniejszenia liczby zwierząt i kosztów potrzebnych do ćwiczeń, a w późniejszym etapie dla powtarzalności wiarygodnych wyników w eksperymentach. Jest to zgodne z koncepcją 3R (replacement, reduction, and refinement) w eksperymentach na zwierzętach, postulowaną przez Russella i Burcha w 1959 roku ²⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop chirurgiczny	Leica	M651
Źródło światła	Schott	KL1500LCD
Patyczki bawełniane	NOBA Verbandmittel	974202
Gaziki (5x5 cm)	Fuhrmann	10002
Roztwór powidonu z jodem	Mundipharma	6108022.00.01
Plastyczna masa modelarska na bazie oleju	Debika corporation	090148
TachoSil	Takeda Pharmaceuticals International GmbH	EU/1/04/277/001-004	Nakładany na powierzchnię resekcji wątroby
Ostrze skalpela nr 11	Pfm medical	200130011	Przygotowanie mankietu i stentów
Kaniula 14G	B. Braun	4268210S	Mankiet dla PV
Kaniula 18G	B. Braun	4268130S	Perfuzja przez PV
Kaniula 24G	B. Braun	4269071S	Stent dla BD i HA
Sznur jedwabny 4-0	Resorba	H3F	Resekcja wątroby
Sznur jedwabny 6-0	Resorba	H1F
Sznur Prolene (polipropylenowy) 7-0	Ethicon	8701H	SHVC i IHVC
Sznur Vicryl 4-0	Ethicon	V304H	Zamknięcie jamy brzusznej
Strzykawka 5 ml	Terumo	SS+T05ES1	Poduszka pod plecy
Mata grzewcza	Thermo	190 x 260 mm
Magnetyczny systemy retrakcji fixator	Fine Science Tools Inc.	18200-01 18200-02 18200-03 18200-12
Łaźnia wodna z chłodzeniem	Huber	740.000X	Przechowywanie przeszczepu
Kleszczyki bipolarne	Söring	MBC-200
Kleszczyki typu Mosquito	BONIMED	451-476-03	Użyte dwie pary
Mikrokleszczyki Adsona	Dimeda	10.176.12
Zakrzywione mikrokleszczyki	AESCULAP	FD281R
Proste mikrokleszczyki	Bonimed	451-476-03
Zakrzywione mikronożyczki	Medicon	05.15.83
Proste mikronożyczki	AESCULAP	FD12	Precyzyjne nacięcie
Nożyczki	AESCULAP	BC211W
Mikroigłotrzymacz	AESCULAP	FD241R	Rekonstrukcja
Igłotrzymacz Mayo-Hegara	Mizuho Ikakogyo	06-798-00	Zamknięcie jamy brzusznej
Klem Bulldog DeBakeya (prosty)	ULRICH	CV3054
Klem Bulldog DeBakeya (zakrzywiony)	CODMAN	37-1062
Klem Satinsky'ego	Mizuhoika	09-230-24
Klem naczyniowy obwodowy	Teleflex Medical	353494	Biorca SHVC
Mikroklem naczyniowy (jednorazowy)	AROSurgical Instruments Corporation	TKM-1-60 g	PV, przeszczep IHVC i biorca HA
Mikroklem naczyniowy (metalowy)	Fine Science Tools Inc.	18052-01	Biorca IHVC
Roztwór Ringera z mleczanami	Fresenius Kabi	6150917.00.00
Sól fizjologiczna	DeltaSelect	1299.99.99
Roztwór HTK	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH	31268.00.00	Roztwór do konserwacji
Heparyna sodowa	Ratiopharm	5394.02.00	500 IU przed perfuzją przeszczepu
8,4% wodorowęglan sodu	Fresenius Kabi	4399.97.99	0,5 ml po reperfuzji
5% roztwór glukozy	B. Braun	6714567.06.00	1,0 ml po reperfuzji
Cefuroksym sodowy	Fresenius Kabi	38985.01.00	Antybiotyk, 16 mg/kg
Buprenorfina	Essex Pharma	997.00.00	Lek przeciwbólowy, 0,1 mg/kg
Klatka do oddziału intensywnej terapii	Brinsea Products Ltd.	Vetario S10	Opieka pooperacyjna