Artykuł metodologiczny

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4377

⸱

23 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Streszczenie

Proces, w którym przedni obszar płytki nerwowej powoduje powstanie siatkówki kręgowców, nadal jest głównym przedmiotem zarówno badań klinicznych, jak i podstawowych. Oprócz oczywistego znaczenia medycznego dla zrozumienia i leczenia chorób siatkówki, rozwój siatkówki kręgowców nadal służy jako ważny i elegancki system modelowy do zrozumienia określania i różnicowania typów komórek neuronalnych1-16. Siatkówka nerwowa składa się z sześciu odrębnych typów komórek (ganglion, amakryna, poziome, fotoreceptory, komórki dwubiegunowe i komórki glejowe Müllera) ułożonych w stereotypowe warstwy, wzorzec, który jest w dużej mierze konserwatywny wśród wszystkich kręgowców 12,14-18.

Podczas gdy badanie siatkówki w nienaruszonym rozwijającym się zarodku jest wyraźnie potrzebne do zrozumienia, jak ten złożony organ rozwija się z wystającego foreliation przodomózgowia w warstwową strukturę, istnieje wiele pytań, które korzystają z zastosowania metod wykorzystujących pierwotną hodowlę komórek przypuszczalnych komórek siatkówki 7,19-23. Na przykład analiza komórek z tkanek usuniętych i zdysocjowanych na różnych etapach pozwala dostrzec stan specyfikacji poszczególnych komórek na różnych etapach rozwoju, czyli los komórek przy braku interakcji z sąsiednimi tkankami 8,19-22,24-33. Pierwotna hodowla komórkowa pozwala również badaczowi na potraktowanie kultury określonymi odczynnikami i przeanalizowanie wyników na poziomie pojedynczej komórki 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, klasyczny system modelowy do badania wczesnego rozwoju neuronalnego 19,27,29,31-32,40-42, służy jako szczególnie odpowiedni system do hodowli pierwotnych komórek siatkówki 10,38,43-45.

Przypuszczalna tkanka siatkówki jest dostępna od najwcześniejszych etapów rozwoju, bezpośrednio po indukcji neuronalnej 25,38,43. Ponadto, biorąc pod uwagę, że każda komórka w zarodku zawiera zapas żółtka, komórki siatkówki mogą być hodowane w bardzo prostym, zdefiniowanym pożywce składającej się z buforowanego roztworu soli, usuwając w ten sposób zakłócające efekty inkubacji lub innych produktów na bazie surowic 10,24,44-45.

Jednak izolacja tkanki siatkówki od otaczających tkanek i późniejsze przetwarzanie jest wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy metodę preparacji i dysocjacji komórek siatkówki u Xenopus laevis, która zostanie wykorzystana do przygotowania pierwotnych kultur komórkowych, które z kolei będą analizowane pod kątem aktywności wapnia i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych komórek. Chociaż tematem przedstawionym w tej pracy jest analiza spontanicznych stanów przejściowych wapnia, technika ta ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie pytań i podejść badawczych (ryc. 1).

Protokół

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w College of William and Mary. Etapy rozwoju, o których mowa w tym protokole, są według Nieuwkoopa i Fabera 46.

1. Sekcja

  1. Pozwól, aby pożywka do hodowli komórkowych i pożywka wolna od wapnia i magnezu (CMF) osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej. Będziesz także potrzebował 0,1X pH zmodyfikowanego Pierścienia Marca (MMR) 7,4-7,6.
  2. Wysterylizuj następujące elementy, stosując światło UV przez 30 minut w okapie z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych. (Spryskaj każdy przedmiot 70% etanolem przed umieszczeniem w okapie.)
    • Plastikowe szalki Petriego 35 mm.
    • Plastikowe szalki Petriego o średnicy 60 mm.
    • Talerze o powierzchni nunclon 35 mm.
    • Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    • Mikropipeta P1000 (mikropipeta 1 000 μl).
    • Końcówki p1000 odporne na działanie aerozoli (końcówki odporne na aerozole 1 000 μl do mikropipet).
    • Długopis odporny na działanie alkoholu.
    • Cienkie kleszcze preparacyjne.
    • *Probówki stożkowe 15 ml (tylko do obrazowania aktywności wapnia).
    • *Tylko do obrazowania aktywności wapnia.
  3. Po wysterylizowaniu okapu promieniami UV i zrównoważeniu roztworów do temperatury pokojowej włącz laminarny przepływ powietrza w okapie, spryskaj rękawice i butelki z mediami 70% etanolem i umieść butelki z mediami w okapie.
  4. Wewnątrz kaptura przygotuj następujące elementy za pomocą mikropipety p1000 dla każdej płytki komórek, zapewniając odpowiednie etykietowanie.
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 60 mm zawierająca 10 ml pożywki do hodowli komórkowych - płytki rozwarstwiającej.
    • Jedno naczynie o powierzchni nunclon o średnicy 35 mm zawierające 2 ml pożywki do hodowli komórkowych - płytki hodowlanej. (Plastikowe naczynia nunclon nie są dalej traktowane żadnymi klejami.)
    • Jedna pusta probówka do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml - probówka dysocjacyjna.
    • *Jedna stożkowa probówka sokoła o pojemności 15 ml zawierająca 15 ml pożywki do hodowli komórkowych. Do wypłukiwania nadmiaru Fluo4-AM podczas obrazowania aktywności wapnia.
  5. Wewnątrz kaptura przygotuj następujące elementy za pomocą mikropipety p1000 dla każdej sesji preparacyjnej (podczas jednej sesji można wyciąć więcej niż jedną siatkówkę).
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 35 mm zawierająca 2 ml CMF - płytki płuczącej eksplantat.
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 35 mm zawierająca 2 ml CMF - Płytki dysocjacyjnej eksplantatów.
  6. Na zewnątrz okapu przygotuj następujące elementy:
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 60 mm na każdą płytkę komórkową zawierającą 10 ml 0,1X MMR - Płytka do trzymania.
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 60 mm na każdą płytkę komórkową zawierającą 10 ml 0,1X MMR - Płytka dla rodzeństwa.
    • Jedna plastikowa szalka Petriego o średnicy 60 mm na sesję preparacyjną zawierająca 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (trikaina) - Płytka anestezjologiczna.
  7. Dodaj 40 μl 5% trypsyny w CMF do płytki dysocjacyjnej eksplantatu (otrzymując 0,1% roztwór trypsyny), zamieszaj do wymieszania i odstaw na bok.
  8. W przypadku preparacji zarodka, który jest młodszy niż stadium 30, dodaj 10 mg kolagenazy B do płytki rozwarstwiającej (w wyniku otrzymano 1 mg/ml roztworu kolagenazy B), zamieszaj do rozpuszczenia i odstaw na bok.
  9. Wybierz zarodek w pożądanym stadium, przenieś do płytki podtrzymującej za pomocą niesterylnej pipety transferowej i usuń błonę witeliny (jeśli zarodek jeszcze się nie wykluł) za pomocą cienkich kleszczy.
  10. Przenieś kilka zarodków w identycznym stadium do płytki rodzeństwa za pomocą niesterylnej pipety transferowej.
  11. Jeśli zarodek jest w stadium 25 lub wcześniejszym, należy przeprowadzić bezpośrednią sekcję, w przeciwnym razie przenieść zarodek do płytki anestezjologicznej za pomocą niesterylnej pipety transferowej i pozostawić zarodek do siedzenia do momentu ustania ruchu i reakcji na bodźce. Może to potrwać do minuty.
  12. Kontynuuj sekcję (rysunek 2) pod lunetą sekcyjną (obiektyw 4X, okular 10X).

Dla embrionów w stadium 25 lub młodszych:

  1. Przenieś zarodek na płytkę separacyjną za pomocą niesterylnej pipety transferowej.
  2. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczy wykonaj nacięcie śródstrzałkowe po brzusznej stronie zarodka, zaczynając od tylnego końca i kontynuując przez gruczoł cementowy w przedniej części zarodka.
  3. Ostrożnie otwórz zarodek, chwytając dowolną krawędź nacięcia i rozprowadzając w lewo i w prawo. Powoduje to, że zarodek jest skierowany stroną grzbietową do płytki rozwarstwiającej, a ektoderma brzuszna jest rozłożona, odsłaniając endodermę i mezodermę w środku.
  4. Rozpocznij usuwanie endodermy i mezodermy (ryc. 2A i 2B). Pierwsza i największa warstwa tej tkanki jest bardzo "puszysta" z wyglądu, z dużymi komórkami i mało wyraźną organizacją.
  5. Po usunięciu tej warstwy somity i struna grzbietowa staną się widoczne. Aby uzyskać lepszy kontrast, przenieś zarodek na oddzielną plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 10 ml pożywki do hodowli komórkowych i 100 μl 1% roztworu siarczanu błękitu nilowego (w wodzie) na 2-3 minuty przed ponownym przeniesieniem na płytkę separacyjną. Spowoduje to zabarwienie ektodermy, somitów i struny grzbietowej w celu łatwiejszej identyfikacji i orientacji.
  6. Skupiając się na przedniej części zarodka, ostrożnie usuń strunę grzbietową i pozostałą mezodermę, odsłaniając mózg i pęcherzyki wzrokowe (ryc. 2C).
  7. Gdy mózg i pęcherzyki wzrokowe zostaną całkowicie odsłonięte, użyj kleszczy, aby przeciąć cewę nerwową i leżącą pod nią ektodermę tuż za mózgiem.
  8. Odwróć tę część (mózg i pęcherzyki wzrokowe) tak, aby ektoderma znalazła się na górze.
  9. Uważając, aby nie uszkodzić leżących pod spodem pęcherzyków wzrokowych, ostrożnie usuń ektodermę (ryc. 2D).
  10. Na koniec, za pomocą kleszczy, oddziel pęcherzyki wzrokowe od mózgu (ryc. 2D i 2E).

Dla embrionów starszych niż stadium 25:

  1. Gdy zarodek znajduje się w płytce anestezjologicznej, usuń brzuszną część zarodka za pomocą kleszczy.
  2. Aby uzyskać lepszy kontrast, przenieś zarodek na plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 10 ml 0,1X MMR i 100 μl 1% siarczanu błękitu nilowego przez 2-3 minuty przed przeniesieniem na płytkę rozbiorową. Spowoduje to zabarwienie ektodermy na niebiesko.
  3. Po umieszczeniu na płytce rozwarstwiającej odciągnij ektodermę pokrywającą siatkówkę (lub pęcherzyk wzrokowy w przypadku zarodków w stadium 26-30) (ryc. 2F i 2G). Jeśli zastosowano siarczan błękitu nilowego, ektoderma zostanie zabarwiona na niebiesko, ale leżąca pod nią tkanka siatkówki nie.
  4. Ostrożnie usuń siatkówkę lub pęcherzyk wzrokowy za pomocą kleszczyków (ryc. 2H, 2I i 2J). Pomocne jest trzymanie zarodka na miejscu za pomocą jednej pary kleszczy i usunięcie siatkówki lub pęcherzyka wzrokowego drugą.

2. Dysocjacja tkanek i powlekanie komórek

Ważna uwaga - Podczas przenoszenia tkanek nie pozwól, aby siatkówka lub pęcherzyk wzrokowy dotykały jakichkolwiek granic powietrze-ciecz; jeśli tak się stanie, komórki ulegną lizie.

  1. Po wycięciu pęcherzyka wzrokowego lub siatkówki ostrożnie przenieść na płytkę płuczącą eksplantat za pomocą mikropipety p100 za pomocą końcówek odpornych na aerozole i pozostawić na 30 sekund.
  2. Przenieś 80 μl 0,1% trypsyny w CMF z płytki dysocjacyjnej eksplantatów do probówki dysocjacyjnej eksplantatu.
  3. Za pomocą mikropipety p100 i końcówek odpornych na aerozole przenieś siatkówkę lub pęcherzyk wzrokowy z płytki płuczącej eksplantat do probówki dysocjacyjnej eksplantatu, unikając przenoszenia roztworu do płukania eksplantatów.
  4. Pozwól tkance zdysocjować w probówce dysocjacyjnej eksplantatu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyto jednej siatkówki na płytkę, jednak zauważamy, że w razie potrzeby można użyć więcej niż jednej na płytkę, aby zwiększyć liczbę komórek na płytce.
  5. Aby pokryć komórki, najpierw powoli usuń 40 μl roztworu z probówki dysocjacyjnej eksplantatu i wyrzuć za pomocą mikropipety p100 i końcówek odpornych na aerozol. Używając p100 ustawionego na 40 μl i końcówek odpornych na aerozol, przenieś komórki (teraz, gdy tkanka uległa dysocjacji) na płytkę hodowlaną. Podczas zasysania komórek na płytkę, pipetuj powoli i utrzymuj komórki na małym obszarze na środku płytki.

Uwaga: Jeśli podczas eksperymentu ma być wykonanych wiele zdjęć komórek, przymocuj siatkę (Cellattice) do spodu płytki hodowlanej za pomocą małej kropli superglue. Umożliwi to wykonywanie obrazów identycznych komórek w identycznych orientacjach w różnych punktach procedury.

  1. Pozwól komórkom siedzieć w spokoju przez co najmniej 1 godzinę, aby przylgnęły do płytki Nunclon. Po tym czasie należy obchodzić się z nimi bardzo delikatnie, w przeciwnym razie mogą się odczepić.
  2. Hoduj komórki do pożądanego etapu, obserwując rodzeństwo zarodków, które są hodowane w tej samej temperaturze co komórki. Jeśli żywe komórki nie są używane do dalszej manipulacji, można je w tym momencie utrwalić w roztworze MEMFA.

Ważna uwaga: Większość naszych eksperymentów jest przeprowadzana w ciągu 6 godzin od posiewu komórek. Długowieczność komórek w hodowli zależy od etapu, na którym tkanka została wypreparowana i ilości żółtka nadal obecnego w komórkach; Komórki wypreparowane z młodszych stadiów (Neurula) pozostają zdrowe w hodowli przez 5-6 dni, podczas gdy komórki pozyskane ze starszych zarodków (stadia pływającej kijanki) pozostaną żywotne w hodowli przez 2-3 dni.

3. Obrazowanie wapnia 47-49

Ten protokół wykorzystuje wrażliwy na wapń Fluo4-AM i mikroskopię konfokalną do ilościowego określania stanów przejściowych wapnia w poszczególnych komórkach. Wszystkie czynności przy użyciu Fluo4-AM powinny być wykonywane z dala od światła, ponieważ Fluo4-AM jest wrażliwy na światło. Wszystkie płukania należy dodawać lub usuwać za pomocą mikropipety p1000 i końcówek odpornych na aerozole. Pipetowanie powinno odbywać się powoli i w kierunku krawędzi płytki, aby uniknąć naruszania komórek. Pożywka nie jest zmieniana, ponieważ kultury są zazwyczaj utrwalane w ciągu 6 godzin od sekcji. W przypadku kultur długoterminowych pożywki należy zmieniać codziennie.

  1. Fluo4-AM jest przechowywany w temperaturze -20 °C i sugerujemy przechowywanie w porcjach 5 μl. Przed użyciem należy rozmrozić 5 μl podwielokrotności Fluo4-AM z dala od światła i dodać 2 μl Pluronic F-127 bezpośrednio do tej podwielokrotności.
  2. Po hodowli komórek przez żądany czas (co najmniej 1 godzinę) należy usunąć 1 ml pożywki do hodowli komórkowych z płytki hodowlanej. Dodać go do Fluo4-AM i Pluronic, mieszając delikatnie pipetując.
  3. Powoli przenieś cały ten roztwór z powrotem na krawędź płytki hodowlanej komórek, które mają być obrazowane i pozostaw komórki w tym roztworze w spokoju na 1 godzinę, aby wchłonąć Fluo4-AM.
  4. Aby wypłukać nadmiar Fluo4-AM z pożywki do hodowli komórkowych, należy wykonać następującą serię płukania:
    • Wyjąć 1 ml podłoża z płytki.
    • Dodać 3 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych (z 15 ml stożkowej probówki) do płytki.
    • Wykonać dwa dodatkowe płukania, za każdym razem powoli usuwając 3 ml roztworu z płytki i dodając 3 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych.
  5. Komórki powinny teraz znajdować się w 4 ml pożywki do hodowli komórkowych i zawierać Fluo4-AM. Fluo4-AM jest enzymatycznie rozszczepiany po wejściu do komórki, zapobiegając jego dyfuzji z komórki lub do jakichkolwiek przedziałów związanych z błoną.
  6. Przed załadowaniem płytki na stolik mikroskopu konfokalnego w celu obrazowania, narysuj pionową czerwoną linię markerem permanentnym na szalce, trzymając przykrycie, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultury przez cząstki markera. Pionowa linia jest narysowana wzdłuż boku szalki Petriego (podstawy szalki Petriego, a nie pokrywy). Jego celem jest wskazanie orientacji płytki hodowlanej w stosunku do pola widzenia, tak aby można było przywrócić dokładną orientację i wyrównanie poszczególnych komórek w późniejszym czasie.
  7. Płytka jest teraz gotowa do załadowania na stolik mikroskopu konfokalnego w celu obrazowania. Wizualizuj komórki za pomocą ustawień jasnego pola w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym (obiektyw 20X). Znajdź obszar gęstych komórek, który nie zawiera grudek, najlepiej z polem widzenia, które zawiera duże numery siatki na szkiełku nakrywkowym Cellatice, aby ułatwić znalezienie tego samego pola widzenia później podczas obrazowania kultury po hybrydyzacji in situ. Przed obrazowaniem skoncentruj się na kulturze i zrób obraz w jasnym polu siatki pod komórkami, aby zarejestrować lokalizację i orientację kultury komórkowej. Pozwala to na ponowne wyrównanie komórek w celu późniejszej analizy.
  8. Podnieś płaszczyznę ogniskową i uchwyć obraz komórek w jasnym polu przed rozpoczęciem obrazowania wapnia (ryc. 3A).
  9. Gdy środkowa płaszczyzna komórek jest zogniskowana, płytka jest gotowa do obrazowania aktywności wapnia. Ustawienia będą się różnić w zależności od mikroskopu i aplikacji. Obrazujemy komórki za pomocą lasera Argon 488 nm przez 1, 2 lub 12 godzin o następujących parametrach:
    • Zdjęcia w 1 godzinie:
      • Laser Argon 488 nm skanuje przy 4% swojej maksymalnej mocy 30 mW.
      • Skanuj raz na 4 sekundy (900 skanów na godzinę).
    • Obrazy z 2 godzin:
      • Laser Argon 488 nm skanuje przy 4% swojej maksymalnej mocy 30 mW.
      • Skanuj raz na 8 sekund (450 skanów na godzinę).
    • Zdjęcia z 12 godzin:
      • Laser Argon 488 nm skanuje z prędkością 2% swojej maksymalnej mocy 30 mW.
      • Skanuj raz na 48 sekund (75 skanów na godzinę).

Te parametry spowodują zestaw 900 nieruchomych obrazów dla każdego klatki. Aktywność wapnia można następnie zarejestrować, analizując poziomy fluorescencji w czasie przepływu obrazów (ryc. 3B) za pomocą aplikacji do przetwarzania obrazu, takiej jak ImageJ 50.

4. Naprawianie komórek

  1. Po obrazowaniu komórki można utrwalić na 30 minut, usuwając 3 ml roztworu z płytki i dodając 1 ml 2X MEMFA do pozostałego 1 ml pożywki hodowlanej.
  2. Po utrwaleniu usuń MEMFA i odwodnij komórki serią 5-minutowych płukań, każde o objętości 1 ml:
    • 25% etanol w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    • 50% etanolu w 1X PBS.
    • 75% etanol w sddH2O(sterylna dejonizowana woda destylowana).
    • Zastąp ostatnie pranie 1 ml 100% etanolu i przechowuj płytkę w temperaturze -20 °C.

Uwaga: Metanol może być również używany do tych prań i do przechowywania.

5. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

Kultury mogą być testowane przy użyciu standardowego protokołu FISH dla Xenopus, jak opisano 51, z modyfikacjami dla hodowli komórkowych, jak opisano w Anderson Lab 52. Modyfikacje protokołu Anderson Lab są wymienione poniżej. Wszystkie prania przeprowadza się na płytkach Nunclon o średnicy 35 mm w objętościach około 1 ml, chyba że zaznaczono inaczej. Roztwory są zgodne z definicją w Sive i wsp. 53, chyba że zaznaczono inaczej.

Ważna uwaga: Nie używaj sond RNA znakowanych fluoresceiną podczas hybrydyzacji in situ na komórkach zobrazowanych pod kątem aktywności wapnia. Przeciwciała antyfluoresceinowe wiążą się z resztkami Fluo4-AM w komórkach i mogą powodować pozytywny sygnał we wszystkich komórkach w hodowli.

Dzień 1: Permeabilizacja i hybrydyzacja

  1. Mycie nawadniające powinno być dostosowane do rozpuszczalnika odwadniającego używanego do przechowywania. W naszych eksperymentach pranie były klasyfikowane do etanolu w 1X PBS.
  2. Po ponownym nawodnieniu umyj komórki trzy dodatkowe razy w 1X PBS przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej.
  3. Wymieszaj 25 ml 0,1 M trietanoloaminy (pH 8,0) z 62,5 μl bezwodnika octowego w probówce Falcona i szybko wymieszaj, aż do całkowitego rozproszenia, jak omówiono w protokole Anderson Lab 52. Inkubuj kultury w tej mieszaninie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po potraktowaniu bezwodnikiem octowym przemyć komórki w 1X soli cytrynianowej sodu (SSC) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń ostatnie płukanie SSC i zastąp 0,2 M HCl (w sdd H2O) na 10 minut, aby przepuszczalność komórek.
  5. Wypłukać HCl dwoma płukaniami w 1X PBS przez 5 min.
  6. Prehybrydyzuj w buforze ISH w temperaturze 60 °C w wytrząsającej łaźni wodnej przez co najmniej 6 godzin, ale nie mieszaj wstępnie przez noc, ponieważ znacznie osłabia to sygnał.
  7. Hybrydyzować przez noc w temperaturze 60 °C przez 8-14 godzin w 750 μl rozcieńczonej sondy (rozcieńczenie 1:250 z oczyszczonej sondy). Stężenie oczyszczonej sondy waha się w zakresie 1,0-1,5 μg/μl.

Dzień 2: Usunięcie niezwiązanej sondy i inkubacji przeciwciał

  1. Wyjąć sondę i płukać kultury przez 5 minut w 0,2X SSC w temperaturze 60 °C. Prać w świeżej 0,2X SSC przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.
  2. Wyjmij kultury z łaźni wodnej i pozwól im dostosować się do temperatury pokojowej przez 5 minut.
  3. Płukać w 0,2X SSC w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Prać przez 15 min w 1X PBS z 0,1% Triton-X-100 (PBT).
  5. Aby dezaktywować endogenne peroksydazy, myć przez 1 godzinę w 2% roztworze H2O2 w PBT.
  6. Spłucz 15 minutowym myciem w 1X Tris Buffered Saline z 0,1% Tween 20 (TBST).
  7. Zablokuj 2% odczynnik blokujący w buforze kwasu maleinowego (MAB) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odkryliśmy, że ta metoda blokowania zwiększa czułość w porównaniu z poprzednimi metodami blokowania w 20% surowicy owczej w PBT.
  8. Inkubować kultury w 1 ml 2% odczynnika blokującego w MAB zawierającego rozcieńczenie 1:1 000 przeciwciała sprzężonego z POD przez przez noc w temperaturze 4 °C.

Dzień 3: Usunięcie niezwiązanego przeciwciała i rozwój fluorescencji

  1. Usunąć roztwór przeciwciał i płukać 3 razy w TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Prać 4 razy w TBST przez 15 minut w temperaturze pokojowej, ciągle kołysząc na niskich obrotach.
  3. Prać dwukrotnie w PBT w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  4. Zastosować 750 μl tyramidu fluoresceiny w skali 1:200 lub tyramidu Cy3 w stosunku 1:25 rozcieńczonego w PBT. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dodać 2,5 μl 0,3% H2O2 . Kołysz przez 40 minut, aby sygnał się rozwinął.
  5. Prać co najmniej 4 razy po 15 minut w TBST w temperaturze pokojowej z bujaniem.
  6. Gdy sygnał w pełni się rozwinie, prać przez 5 minut w 1X PBT.
  7. Utrwalić w 1X MEMFA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać w 1X PBS w temperaturze 4 °C.

6. Wyniki obrazowania FISH i współrejestruj z danymi obrazowania wapnia

  1. Po zakończeniu badania FISH obrazuje się płytki do hodowli komórkowych w celu określenia, które komórki wykazują dodatni sygnał fluorescencyjny dla danej sondy. Użyj szkiełka nakrywkowego Cellattice, aby znaleźć dokładne pole widzenia badane podczas obrazowania wapnia i wyrównać płytkę do orientacji ramek obrazu wapnia.
  2. Ustaw ostrość na środkowej płaszczyźnie komórek i wykonaj pojedynczy obraz o wysokiej rozdzielczości za pomocą lasera Helium-Neon HeNe 543 nm przy 15% jego maksymalnej mocy 1 mW (rysunek 3C).
  3. W oryginalnym zestawie 900 klatek obrazów wykonanych za pomocą protokołu obrazowania wapnia zidentyfikuj poszczególne komórki jako obszary zainteresowania (ROI) za pomocą programu do przetwarzania obrazu (takiego jak ImageJ 50). Wyodrębnij dane fluorescencji ROI jako zestaw punktów danych reprezentujących wartości par czas-fluorescencja (rysunek 4).
  4. Nałóż obraz wyników FISH na zidentyfikowane zwroty z inwestycji na obrazach wapnia (rysunek 3D).
  5. Rejestruj każdy zwrot z inwestycji jako dodatni dla sondy, ujemny dla sondy lub nieznany - w przypadku, gdy komórka odpowiadająca zwrotowi akcji nie może już znajdować się w polu view obrazu FISH.
  6. Przetwarzaj dane fluorescencji ROI za pomocą skryptów analizy statystycznej (zaprojektowanych przez MATLAB lub inny język programowania) w celu porównania poziomów aktywności wapnia między różnymi wypreparowanymi etapami (Figura 5A i 5C) lub komórek dodatnich dla różnych sond FISH (Figura 5B i 5D). Wszystkie skrypty używane w naszym laboratorium są dostępne bezpłatnie na żądanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykłady pomyślnie wypreparowanych pęcherzyków optycznych (stadium 25) i siatkówek (stadium 35) przedstawiono na rysunkach 2E i 2J. Choć niniejszy protokół można stosować na różnych etapach rozwoju, kluczowe jest uzyskanie wyłącznie tkanki siatkówki, aby zapewnić dokładność dalszych eksperymentów. Na każdym etapie należy ostrożnie usunąć naskórek i dopilnować, aby pęseta nie przebiła tkanki siatkówki. W stadium 35 lub późniejszych soczewka jest widoczna jako przezroczysta warstwa na powierzchni siatkówk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki dobrze scharakteryzowanym typom komórek, które są konserwatywne u wszystkich kręgowców, siatkówka stanowi użyteczny model do badania procesów molekularno-komórkowych rządzących specyfikacją i różnicowaniem typów komórek. Pierwotna hodowla komórkowa stanowi potężną metodę badania szerokiego zakresu procesów, w tym ekspresji genów, dynamiki białek oraz aktywności wapniowej i elektrycznej na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy prostą technikę pierwotnej hodowli komórek z wypreparo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Uprzejmie dziękujemy dr Johnowi Hayesowi za scenariusze; doktorom Ericowi Bradleyowi i Christopherowi Del Negro za pomoc w mikroskopii konfokalnej; Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden i Liz MacMurray za ich pracę nad rozwojem projektu i dostarczenie wstępnych danych; Dr. Gregowi Smithowi za pomocne sugestie dotyczące analizy statystycznej. Praca ta była wspierana przez grant NIH (NINDS IR15N5067566-01) dla MSS oraz grant na edukację naukową Instytutu Medycznego Howarda Hughesa dla College of William and Mary.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do sekcji i hodowli
BD Falcon Easy Grip Naczynia do hodowli tkankowych, 35 mmFisher08-772A
Jednorazowe polistyrenowe szalki Petriego, 60 x 15 mmFisher0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri (z Airventem)Fisher12-565-91
Cienkie kleszcze Dumont (Dumostar #55)FisherNC9341917
Cellattice Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznego w mikrokratki, 25 mmFisher50-313-17
Sól metanosulfonianu etylu m-aminobenzoesanu (MS-222)MP Biomedicals, LLC103106
Siarczan gentamycynyEnzo Life Sciences380-003-G025
Trypsyna Gibco (1:250) ProszekLife Technologies27250-018
Kolagenaza B z Clostridium histolyticumRoche11088831001
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Niebieski siarczan Nilu (opcjonalnie)Pfaltz BauerN05550
500 ml System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 0,22 μ m Pore 33,2 cm2 Membrana CNCorning430758
do obrazowania wapnia
Fluo-4 AM 1 mM Roztwór w DMSO, Cell PermanentLife TechnologiesF-14217
Pluronic F-127 10% roztwór w Water Life TechnologiesP-6866
LSM 510 System mikroskopu konfokalnego Model Zeiss Wycofany
odczynnik blokującyRoche11096176001
Do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab FragmentsRoche11207733910
Przeciwciało anty-DNP-HRP Perkin-ElmerNEL747A
Cy3 NHS esterGE Healthcare
NHS-Fluorescein Thermo Scientific46409
Formamid, DejonizowanyAmresco0606-950ML
Torula RNA, Typ IXSigma-AldrichR3629
Heparyna Sól sodowa, z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3393-250KU
CHAPSSigma-AldrichC3023

Tabela 2. Konkretne odczynniki i sprzęt.

Solution ReferenceContents
Podłoże do hodowli komórkowychChang i Spitzer , 200954116 mM NaCl
0,67 mM KCl
2 mM CaCl2
1,31 mM MgSO4
4,6 mM Tris
1 % (v:v) Penicylina/Streptomycyna
Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą HCl.
Filtr sterylizować, przechodząc przez 0,22 μ m Filtr CN.
Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Podłoże wolne od wapnia i magnezu (CMF)Gu et al., 199442; Gu i Spitzer, 199555116 mM NaCl
0,67 mM KCl
4,6 mM Tris
0,4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicylina/Streptomycyna
Dostosuj pH do 7,8 za pomocą HCl.
Filtruj sterylizować, przechodząc przez 0,22 μ m CN filter.
Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Bufor kwasu maleinowego (MAB)Sive et al., 200053 100 mM kwas maleinowy
150 mM NaCl (pH 7,5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10XSive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH dostosowane do 7,4 z NaOH
0,1X MMR zawiera również 50 mg/ml siarczanu gentamycyny, a pH dostosowuje się do 7,4 za pomocą roztworu NaOH.
MEMFA, 10XSive et al., 2000530,1 M MOPS (Ph 7,4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3,7% formaldehydu
Roztwór 10X, bez formaldehydu, można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Formaldehyd dodaje się świeży (1/10 objętości standardowego 37% bulionu).
In situ Bufor hybrydyzacyjnySive et al., 20005350% Formamid
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparyna
1X Roztwór Denharta
0,1% Tween 20
0,1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamycyna, antybiotyk, jest stosowana w naszych roztworach MMR, podczas gdy penicylina i streptomycyna są stosowane w naszych pożywkach hodowlanych.

PA13101

Bibliografia

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka siatk wki Xenopussekcja siatk wkihodowla kom rek siatk wkiobrazowanie wapniamikroskopia konfokalnadysocjacja tkankipierwotna hodowla kom rekrozw j embrionalnymetody neurobiologiczneanaliza kom rkowa

Powiązane artykuły