Method Article

Identyfikacja lotnych substancji węchowych za pomocą chromatografii gazowej z zapisami wielojednostkowymi (GCMR) w płacie anteny owada owada

DOI:

10.3791/4381

⸱

February 24th, 2013

 ,  , 
1Department of Biology, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnały węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często są złożonymi mieszaninami składającymi się z dziesiątek do setek lotnych związków. Za pomocą chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem w płacie czułka owada opisano metodę identyfikacji związków bioaktywnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie organizmy zamieszkują świat pełen bodźców sensorycznych, które determinują ich behawioralną i fizjologiczną reakcję na środowisko. Węch jest szczególnie ważny u owadów, które wykorzystują swój układ węchowy do reagowania i rozróżniania między złożonymi bodźcami zapachowymi. Zapachy te wywołują zachowania, które pośredniczą w procesach takich jak rozmnażanie i selekcja siedlisk1-3. Ponadto wyczuwanie chemiczne przez owady pośredniczy w zachowaniach, które mają duże znaczenie dla rolnictwa i zdrowia ludzkiego, w tym zapylaniu4-6, roślinożerności roślin spożywczych7 i przenoszeniu chorób8,9. Identyfikacja sygnałów węchowych i ich roli w zachowaniu owadów jest zatem ważna dla zrozumienia zarówno procesów ekologicznych, jak i zasobów żywnościowych i dobrostanu ludzi.

Do tej pory identyfikacja substancji lotnych, które wpływają na zachowanie owadów, była trudna i często żmudna. Obecne techniki obejmują zapis elektroantennogramu sprzężonego z chromatografią gazową (GC-EAG) oraz zapis pojedynczego sensyllum sprzężonego z chromatografią gazową (GC-SSR)10-12. Techniki te okazały się kluczowe w identyfikacji związków bioaktywnych. Opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje chromatografię gazową sprzężoną z wielokanałowymi zapisami elektrofizjologicznymi (określanymi jako "GCMR") z neuronów w płacie antenowym (AL; główne centrum węchowe owada)13,14. Ta najnowocześniejsza technika pozwala nam zbadać, w jaki sposób informacje o zapachu są reprezentowane w mózgu owadów. Co więcej, ponieważ reakcje neuronalne na zapachy na tym poziomie przetwarzania węchowego są bardzo czułe ze względu na stopień zbieżności neuronów receptorowych anteny z neuronami AL, zapisy AL pozwolą na wykrycie aktywnych składników naturalnych zapachów skutecznie i z wysoką czułością. Tutaj opisujemy GCMR i podajemy przykład jego użycia.

Kilka ogólnych kroków jest związanych z wykrywaniem bioaktywnych substancji lotnych i reakcją owadów. Substancje lotne należy najpierw zebrać ze źródeł zainteresowania (w tym przykładzie używamy kwiatów z rodzaju Mimulus (Phyrmaceae)) i scharakteryzować w razie potrzeby przy użyciu standardowych technik GC-MS14-16. Owady przygotowuje się do badania przy użyciu minimalnej sekcji, po czym do płata antenowego wprowadza się elektrodę rejestrującą i rozpoczyna się wielokanałowy zapis neuronowy. Końcowe przetwarzanie danych neuronowych ujawnia następnie, które konkretne substancje zapachowe powodują znaczące reakcje neuronalne układu nerwowego owadów.

Chociaż przykład, który tutaj prezentujemy, jest specyficzny dla badań nad zapylaniem, GCMR może być rozszerzony na szeroki zakres badanych organizmów i źródeł niestabilności. Na przykład metoda ta może być stosowana do identyfikacji substancji zapachowych przyciągających lub odstraszających owady wektorowe i szkodniki upraw. Co więcej, GCMR może być również stosowany do identyfikacji atraktantów dla pożytecznych owadów, takich jak zapylacze. Technika ta może być również rozszerzona na obiekty niezwiązane z owadami.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zmienny Follection

  1. W tym przykładzie używamy lotnych próbek z M. kwiaty lewisii - dziki kwiat alpejski pochodzący z Kalifornii. Substancje lotne są zbierane przy użyciu metod sorpcji dynamicznej zgodnie z Riffellem i wsp.14. Krótko mówiąc, metoda ta wykorzystuje system pułapkowania w zamkniętej pętli, w którym kwiaty są zamknięte w teflonowej torbie. Za pomocą obojętnej pompy próżniowej powietrze wokół kwiatów jest zasysane przez "pułapkę" składającą się z pipety Pasteura wypełnionej matrycą Porapak Q. Powietrze powrotne z pompy jest filtrowane przez węgiel aktywny. Po określonym czasie, w naszym przypadku 24 godzinach, matrycę Porapak Q eluuje się rozpuszczalnikiem niepolarnym, zwykle heksanem, w celu zebrania skoncentrowanego ekstraktu. Ekstrakt jest następnie przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu analizy. W razie potrzeby próbki można zagęścić przed analizą pod strumieniem azotu gazowego. O ile próbka nie jest już dobrze scharakteryzowana, należy przepuścić jej podwielokrotność przez chromatograf gazowy ze spektrometrem masowym (GC-MS) w celu zidentyfikowania składników lotnych przed użyciem próbki.

2. Przygotowanie elektrofizjologiczne

  1. Odciąć około 1 cm od końca końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Umieść trzmiela (Bombus impatiens) u podstawy końcówki pipety i delikatnie popchnij w kierunku przeciwległego końca końcówki, aż odsłonięta zostanie tylko główka.
  2. Rozpuść wosk dentystyczny i uformuj go wokół odsłoniętej głowy, upewniając się, że wosk przylega do oczu złożonych dla bezpieczeństwa i całkowitego unieruchomienia głowy pszczoły. Uważaj, aby nie dostać wosku na antenę pszczoły.
  3. Gdy głowa jest już zabezpieczona, wykonaj kwadratowe, przypominające okienko nacięcie w torebce głowy za pomocą żyletki lub skalpela o odpowiedniej wielkości, aby przeciąć naskórek. Używając łamacza ostrzy, zacznij od grzbietowej strony kapsuły głowy, bezpośrednio za anteną i w sąsiedztwie jednego z oczu złożonych. Wytnij linię prostą, od jednego oka złożonego do przeciwległego oka złożonego. Po przecięciu linii prostej do przeciwległego oka złożonego, rozpocznij wykonywanie nacięcia grzbietowo, aż torebka głowy zakrzywi się i zakończy w pobliżu klatki piersiowej. W tym momencie zacznij ciąć w kierunku przeciwległego końca torebki głowy. Na koniec, gdy linia zostanie przecięta na przeciwległy koniec, przytnij linię z powrotem do pozycji początkowej początkowego nacięcia. Ważne jest, aby usunąć naskórek przylegający do anteny, ponieważ utrudni to wprowadzenie elektrody.
  4. Po przecięciu naskórka użyj kleszczy, aby usunąć naskórek pszczoły, który powinien następnie odsłonić mózg pszczoły i, co ważniejsze, płaty czułków. Natychmiast rozpocznij przepełnianie mózgu solą fizjologiczną z owadów, aby mózg nie uległ wysuszeniu. Po odsłonięciu mózgu ostrożnie użyj pary bardzo cienkich kleszczy, aby usunąć osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami czułków. Uważaj, aby nie przebić mózgu pszczoły kleszczami.

3. Chromatografia gazowa z zapisem wielokanałowym

  1. "Preparat" pszczoły - umieszczony w rurce z odsłoniętym mózgiem - jest teraz gotowy do zapisu elektrofizjologicznego. Umieść pszczołę w zacisku, przymocowanym do podstawy magnetycznej, która znajduje się na stole powietrznym.
  2. Ułóż worek dożylny, regulator przepływu i rurkę (wypełnioną solą fizjologiczną z owadów) tak, aby sól fizjologiczna w sposób ciągły przenikała do mózgu.
  3. Za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę referencyjną, wykonaną z drutu wolframowego, do oka pszczoły.
  4. Za pomocą oddzielnego mikromanipulatora włóż elektrodę wielokanałową, taką jak tetroda z drutu zwijanego lub silikonowa elektroda wielokanałowa (Neuronexus Technologies), do płatów czułkowych pszczoły. Elektroda ta jest podłączona do przedwzmacniacza, takiego jak seria S-3 Z systemu TDT, do procesora bioamp systemu Z-bus systemu TDT. Sygnał wyjściowy z detektora chromatogramu gazowego za pośrednictwem ekranowanego BNC może być połączony ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, że zarówno sygnał neuronowy, jak i GC są zsynchronizowane.
  5. Poczekaj około 30-60 minut, aż nagrania neuronowe się ustabilizują. Gdy spontaniczna aktywność i kształt fali jednostek w kanałach rejestrujących staną się spójne, użyj strzykawki zapachowej, aby stymulować pszczołę i obserwować reakcję kanałów nagrywających na zapach.
  6. Rejestruj zewnątrzkomórkowe skoki z neuronów poprzez automatyczne progowanie kanałów nagrywania o 3,5 do 5 sigma sygnału na poszczególnych kanałach nagrywania. W przypadku niektórych kanałów może być wymagane ręczne progowanie, aby uniknąć zanieczyszczenia spowodowanego szumem elektrycznym. Potencjały czynnościowe neuronów pojawią się jako skoki napięcia w kanale rejestrującym. Gdy napięcie kanału przekroczy próg, system buforuje i oszczędza kilka milisekund przed i po przekroczeniu progu, wykonując w ten sposób szybki przebłysk przebiegu lub skoku.
  7. Bezpośrednio obok stołu powietrznego znajduje się GC. Przed wstrzyknięciem ekstraktu kwiatowego do GC należy upewnić się, że metoda rampy temperatury w przebiegu GC jest prawidłowa. W naszym przykładzie używamy metody temperatury rozpoczynającej się od 50 °C przez 4 minuty, po której następuje wzrost temperatury z 10 °C/min do 220 °C, w którym to czasie utrzymujemy GC przez dodatkowe 6 minut. Używamy kolumny DB-5 GC (J&W Scientific, Folsom, CA, USA), z helem jako gazem nośnym. Wlot jest bezdzielny, z temperaturą ustawioną na 200 °C. Temperatura detektora płomieniowo-jonizacyjnego jest ustawiona na 230 °C.
  8. Wstrzyknąć próbkę ekstraktu z przestrzeni kwiatowej do podgrzanego portu wtrysku GC w celu uwolnienia zaadsorbowanych substancji lotnych do kolumny GC. Ściek z kolumny jest rozdzielany w stosunku 1:1 pomiędzy detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) a antenę pszczół za pomocą szklanego złącza "Y" (J&W Scientific). Rozpocznij nagrywanie od elektrody podczas wstrzykiwania próbki do GC.
  9. Po zakończeniu biegu w generalce pozwól przygotowaniu odpocząć przez 5 do 15 minut. Następnie wstrzyknąć kolejną próbkę do GC lub stymulować preparat za pomocą pojedynczych lotnych związków lub mieszanin związków. W tej ostatniej metodzie stymulacji preparatu impulsy powietrza ze stałego strumienia powietrza są kierowane przez szklaną strzykawkę zawierającą kawałek bibuły filtracyjnej, na której osadzono związki. Bodziec zapachowy był pulsowany za pomocą zaworu aktywowanego elektromagnesem, sterowanego przez oprogramowanie.
  10. Jeśli aktywność urządzenia nagle usta lub zmieni się, sprawdź kroplówkę soli fizjologicznej i pozwól preparatowi odpocząć przez 15 minut. Jeśli spontaniczna aktywność nie powróci do poprzedniego poziomu, preparat należy wyrzucić i użyć innej pszczoły, jeśli jest dostępna.
  11. Po eksperymencie napraw mózg 5% formaliną na 20 minut, gdy sonda nadal znajduje się w tkance. Następnie wytnij mózg i umieść go w 2% aldehydzie glutarowym na 4 godziny, a następnie wykonaj stopniowaną serię odwodnienia etanolu i oczyść mózg za pomocą salicylanu metylu. Na podstawie utrwalenia i oczyszczenia tkanki, miejsca w AL, w których elektrody przebiły tkankę, powinny być wyraźnie widoczne w mikroskopii konfokalnej.

4. Analiza danych

  1. Przeanalizuj zebrane dane po eksperymencie, aby oddzielić i zidentyfikować zarejestrowane jednostki neuronowe. Użyj typowych programów (Offline Sorter, MClust i SClust), aby oddzielić przebiegi lub "skoki" na podstawie kształtów szczytów, takich jak amplituda szczytowa lub dolinowa, połowa szerokości piku itp., lub zredukowanych miar (główne składniki)17,18 (Rysunek 2). Używaj tylko tych skupisk kolców, które rozdzieliły się w przestrzeni trójwymiarowej (PC1-PC3) i statystycznie różnią się od siebie (wielowymiarowa ANOVA; p < 0,05) (Rysunek 2) w celu dalszej analizy. Proszę zapoznać się z cytatem #s 17-19, aby uzyskać pełny opis metodologii nagrywania tetrod i sortowania kolców.
  2. Oznacz skoki czasowe w każdym klastrze i wyeksportuj te dane do analizy za pomocą MATLAB lub Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) w celu utworzenia wykresów rastrowych i odpowiedzi na szybkość wyzwalania (rysunki 2, 3A).
  3. Zidentyfikuj czasy retencji substancji lotnych za pomocą jednocześnie zarejestrowanych danych GC. Wykorzystać czasy retencji substancji lotnych, określone przez wierzchołek piku z chromatogramu, w celu zbadania reakcji jednostek w tych punktach czasowych.
  4. Aby zbadać reakcje poszczególnych jednostek w przebiegu GC, należy przegrupować liczbę skoków w odstępach 100 ms i zbadać przebieg czasowy reakcji szybkości wystrzeliwania w odniesieniu do czasu retencji substancji lotnych eluujących. Binningowanie skoków w odstępach 100 ms dostarcza wystarczających szczegółów lub sygnału na temat przebiegu w czasie odpowiedzi neuronalnej na uwalniający się zapach z GC.
  5. Aby zbadać reakcje populacji na różne eluujące substancje lotne, należy zintegrować reakcje poszczególnych jednostek na szybkość wypalania w 3-sekundowym oknie próbkowania, 1,5 sekundy przed i 1,5 sekundy po czasie retencji substancji lotnych (Rysunek 3). Ten okres czasu jest typowy dla czasu trwania elucji substancji niestabilnej z GC. Pokazujemy reakcje jednostek na szybkość wypalania, kodując je kolorami (czerwony to reakcja o wysokiej szybkości wypalania; niebieski to niska reakcja) i układając je jako macierz aktywności, przy czym każdy wiersz reprezentuje odpowiedź zespołu na ścieki GC (kolumny) (rysunek 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W teście GCMR z użyciem kwiatowego zapachu M. lewisii, wstrzykujemy 3 μl ekstraktu do GC. Całkowita liczba substancji lotnych uwalniających się przez GC wynosi zwykle 60-70 substancji lotnych. Zapach M. lewisii składa się głównie z monoterpenoidów, w tym β-mircenu (acyklicznego) i α-pinenu, a pozostała część zapachu składa się z sześciowęglowych substancji lotnych, takich jak 2-heksanol, i seskwiterpenoidów, które stanowią < 1% przestrzeni nad głową.

GCM...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowania węchowe owadów napędzają wiele różnych procesów, w tym rozmnażanie, wybór miejsca żywiciela i identyfikację odpowiednich zasobów pokarmowych. Badanie tych procesów wymaga umiejętności identyfikacji substancji lotnych emitowanych ze źródła, a także zdolności do identyfikacji tych związków, które pośredniczą w zachowaniach. Sprawę komplikuje fakt, że zapachy składają się z dziesiątek do setek pojedynczych związków, które razem tworzą niepowtarzalny zapach, który jest odbierany inaczej niż poszczególne składniki<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NSF IOS 1121692, oraz przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Porapak Typ Q 80-100 siatkaWodyWAT027060
Reynolds Worki do piekarnikaReynolds
GCAgilent7820A GC kolumna
J& W Scientific, Folsom, Kalifornia, USADB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 μ m)
Analityczny hel nośnygaz PraxairHE K1 cc/min
16-kanałowa elektroda krzemowaNeuronexus Technologiesa4x4-3mm50-177
Cienki drut NiCr, średnica 0,012 mm) Sandvik Kanthal HP ReidPX000004Do wykonywania niestandardowych tetrod i stereotrod
PrzedwzmacniaczTucker-Davis SystemPZ-2
Wzmacniacz Tucker-Davis SystemRZ-2
System akwizycji danych - Pakiet OpenExSystem Tucker-Davis Oprogramowanie
do sortowania impulsów online - SpikePacTucker-Davis System
Oprogramowanie do sortowania spajków w trybie offline - Zestaw narzędzi do sortowania kolców Mclust David Redish, Wydział Neuronauki, Uniwersytet MinnesotyBezpłatne pobieranie na stronie http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.htmlMATLAB toolbox

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570(1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725(2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440(2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098(2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282(2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382(2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory VolatilesGas ChromatographyMulti unit RecordingsInsect Antennal LobeBumblebee BrainNeural RecordingsFloral HeadspaceElectrodes InsertionGCMR TechniqueVolatile Detection

Related Articles