Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4381

⸱

24 lutego 2013

 ,  , 
1Department of Biology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Streszczenie

Wszystkie organizmy zamieszkują świat pełen bodźców sensorycznych, które determinują ich reakcje behawioralne i fizjologiczne na otoczenie. Węch jest szczególnie istotny u owadów, które wykorzystują swoje systemy olfaktoryczne do reagowania na złożone bodźce zapachowe i odróżniania ich od siebie. Zapachy te wywołują zachowania pośredniczące w takich procesach jak reprodukcja i dobór siedlisk1-3. Ponadto chemorecepcja u owadów pośredniczy w zachowaniach o dużym znaczeniu dla rolnictwa i zdrowia ludzi, w tym w zapylaniu4-6, żerowaniu na uprawach roślin spożywczych7 oraz transmisji chorób8,9. Identyfikacja sygnałów olfaktorycznych i ich roli w zachowaniu owadów jest zatem kluczowa dla zrozumienia zarówno procesów ekologicznych, jak i zasobów żywnościowych oraz dobrostanu ludzi.

Do tej pory identyfikacja lotnych związków sterujących zachowaniem owadów była trudna i często żmudna. Obecne techniki obejmują rejestrację elektroantenogramu sprzężoną z chromatografią gazową (GC-EAG) oraz rejestrację z pojedynczego sensillum sprzężoną z chromatografią gazową (GC-SSR)10-12. Techniki te okazały się kluczowe w identyfikacji związków bioaktywnych. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą chromatografię gazową sprzężoną z wielokanałowymi rejestracjami elektrofizjologicznymi (nazwaną „GCMR”) z neuronów w płacie antennym (AL; głównym ośrodku węchowym owada)13,14. Ta nowoczesna technika pozwala nam badać, w jaki sposób informacje zapachowe są reprezentowane w mózgu owada. Co więcej, ponieważ odpowiedzi neuronalne na zapachy na tym poziomie przetwarzania węchowego są bardzo czułe ze względu na stopień konwergencji neuronów receptorowych anteny do neuronów AL, rejestracje z AL pozwolą na wydajne i czułe wykrywanie aktywnych składników naturalnych zapachów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę GCMR i przedstawiamy przykład jej zastosowania.

Wykrywanie lotnych substancji bioaktywnych oraz analiza reakcji owadów obejmują kilka ogólnych etapów. W pierwszej kolejności należy zebrać substancje lotne z wybranych źródeł (w tym przykładzie wykorzystujemy kwiaty z rodzaju Mimulus (Phyrmaceae)), a następnie scharakteryzować je w razie potrzeby, stosując standardowe techniki GC-MS14-16. Owady przygotowuje się do badań poprzez minimalną dyssekcję, po której elektrodę rejestrującą wprowadza się do płata antenalnego i rozpoczyna wielokanałowy zapis aktywności neuronalnej. Następnie post-processing danych neuronalnych pozwala ustalić, które konkretne substancje zapachowe wywołują istotne odpowiedzi neuronalne w układzie nerwowym owada.

Choć przedstawiony tutaj przykład dotyczy konkretnie badań nad zapylaniem, metodę GCMR można rozszerzyć na szeroki zakres organizmów badawczych i źródeł substancji lotnych. Przykładowo, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji substancji zapachowych przyciągających lub odstraszających owady będące wektorami chorób oraz szkodniki upraw. Co więcej, GCMR może służyć do identyfikacji atraktantów dla owadów pożytecznych, takich jak zapylacze. Technikę tę można rozszerzyć również na obiekty inne niż owady.

Protokół

1. Zbieranie substancji lotnych

  1. W tym przykładzie wykorzystujemy próbki substancji lotnych z kwiatów M. lewisii – alpejskiego kwiatu pochodzącego z Kalifornii. Substancje lotne są zbierane przy użyciu metod dynamicznej sorpcji zgodnie z opisem Riffell et al.14. W skrócie, metoda ta wykorzystuje układ pułapek w obiegu zamkniętym, w którym kwiaty są zamknięte w torbie teflonowej. Za pomocą obojętnej pompy próżniowej powietrze wokół kwiatów jest zasysane przez „pułapkę” składającą się z pipety Pasteura wypełnionej macierzą Porapak Q. Powietrze powrotne z pompy jest filtrowane przez węgiel aktywny. Po określonym czasie, w naszym przypadku 24 h, macierz Porapak Q jest eluowana niepolarnym rozpuszczalnikiem, zazwyczaj heksanem, w celu zebrania skoncentrowanego ekstraktu. Ekstrakt jest następnie przechowywany w -80 °C do czasu analizy. W razie potrzeby próbki można skoncentrować przed analizą w strumieniu gazu azotowego. Jeśli próbka nie jest wcześniej dobrze scharakteryzowana, należy poddać jej alikwot analizie za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas (GC-MS), aby zidentyfikować składniki lotne przed właściwym użyciem próbki.

2. Przygotowanie elektrofizjologiczne

  1. Odetnij około 1 cm od końcówki końcówki do pipety 1 000 μl. Umieść trutnia (Bombus impatiens) w podstawie końcówki pipety i delikatnie pchnij go w stronę przeciwległego końca, aż pozostanie odsłonięta tylko głowa.
  2. Roztop wosk dentystyczny i uformuj go wokół odsłoniętej głowy, upewniając się, że wosk przylega do oczu złożonych dla stabilizacji i całkowitego unieruchomienia głowy pszczoły. Należy uważać, aby nie doprowadzić do kontaktu wosku z czułkami pszczoły.
  3. Po unieruchomieniu głowy wykonaj kwadratowe, okienne nacięcie w torebce głowowej, używając łamacza żyletek lub skalpela o odpowiednim rozmiarze w celu przecięcia kutykuli. Używając łamacza żyletek, zacznij od strony grzbietowej torebki głowowej, bezpośrednio za czułkami i przylegając do jednego z oczu złożonych. Przecnij linię prostą od jednego oka złożonego do przeciwległego oka złożonego. Po przecięciu linii prostej do przeciwległego oka złożonego, zacznij wykonywać nacięcie w kierunku grzbietowym, aż torebka głowowa zakrzywi się i zakończy w pobliżu tułowia. W tym momencie zacznij ciąć w stronę przeciwległego końca torebki głowowej. Na koniec, po przecięciu linii do przeciwległego końca, wykonaj nacięcie z powrotem do punktu początkowego pierwszego nacięcia. Ważne jest usunięcie kutykuli przylegającej do czułek, ponieważ będzie ona utrudniać wprowadzenie elektrody.
  4. Po przecięciu kutykuli użyj pęsety, aby usunąć kutykulę pszczoły, co powinno odsłonić mózg pszczoły, a przede wszystkim płaty antenalne. Natychmiast rozpocznij perfuzję powierzchniową mózgu solą fizjologiczną dla owadów, aby zapobiec jego wysuszeniu. Po odsłonięciu mózgu ostrożnie użyj bardzo precyzyjnej pęsety, aby usunąć osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami antenalnymi. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić mózgu pszczoły pęsetą.

3. Chromatografia gazowa z rejestracją wielokanałową

  1. Przygotowany preparat pszczoły – unieruchomiony w probówce z odsłoniętym mózgiem – jest gotowy do rejestracji elektrofizjologicznej. Umieść pszczołę w uchwycie zamocowanym do podstawy magnetycznej, która znajduje się na stole pneumatycznym.
  2. Przygotuj worek z płynem, kontroler przepływu i przewody (wypełnione solą fizjologiczną dla owadów) w taki sposób, aby sól fizjologiczna stale przepłukiwała mózg.
  3. Za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę referencyjną, wykonaną z drutu wolframowego, do oka pszczoły.
  4. Za pomocą oddzielnego mikromanipulatora wprowadź elektrodę wielokanałową, taką jak tetroda z drutu spiralnego lub krzemowa elektroda wielokanałowa (Neuronexus Technologies), do płatów antennych pszczoły. Elektroda ta jest podłączona do przedwzmacniacza, np. z serii S-3 Z systemu TDT, a następnie do procesora bioamp Z-bus systemu TDT. Sygnał wyjściowy z detektora chromatografu gazowego (GC) poprzez ekranowany kabel BNC może zostać zinterfejsowany ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, aby sygnał neuronalny i sygnał GC były zsynchronizowane.
  5. Odczekaj około 30-60 minut, aż rejestracje neuronalne się ustabilizują. Gdy aktywność spontaniczna i kształt przebiegu jednostek w kanałach rejestracji staną się spójne, użyj strzykawki z odorem, aby stymulować pszczołę i zaobserwować odpowiedź kanałów rejestracji na zapach.
  6. Rejestruj potencjały zewnątrzkomórkowe z neuronów, stosując automatyczne progowanie kanałów rejestracji na poziomie od 3,5 do 5 sigma sygnału w poszczególnych kanałach. W przypadku niektórych kanałów może być wymagane ręczne progowanie, aby uniknąć zanieczyszczenia szumem elektrycznym. Potencjały czynnościowe neuronów będą widoczne jako skoki napięcia w kanale rejestracji. Gdy napięcie w kanale przekroczy próg, system buforuje i zapisuje kilka milisekund przed i po przekroczeniu progu, wykonując w ten sposób migawkę przebiegu, czyli spike'a.
  7. Bezpośrednio obok stołu pneumatycznego znajduje się GC. Przed wstrzyknięciem ekstraktu kwiatowego do GC upewnij się, że metoda rampy temperaturowej analizy GC jest poprawna. W naszym przykładzie stosujemy metodę temperaturową rozpoczynającą się od 50 °C przez 4 min, a następnie wzrost temperatury w tempie 10 °C/min do 220 °C, przy czym utrzymujemy tę temperaturę w GC przez dodatkowe 6 min. Używamy kolumny GC DB-5 (J&W Scientific, Folsom, CA, USA) z helem jako gazem nośnym. Wlot jest bezpodziałowy (splitless), z temperaturą ustawioną na 200 °C. Temperatura detektora jonizacji płomieniowej jest ustawiona na 230 °C.
  8. Wstrzyknij próbkę ekstraktu z przestrzeni nad kwiatami do podgrzewanego portu wtryskowego GC, aby uwolnić zaadsorbowane substancje lotne do kolumny GC. Eluent z kolumny jest dzielony w stosunku 1:1 między detektor jonizacji płomieniowej (FID) a antenę pszczoły za pomocą szklanego łącznika w kształcie litery „Y” (J&W Scientific). Rozpocznij rejestrację z elektrody w momencie wstrzykiwania próbki do GC.
  9. Po zakończeniu analizy GC pozostaw preparat do odpoczynku na 5 do 15 min. Następnie wstrzyknij kolejną próbkę do GC lub stymuluj preparat za pomocą pojedynczych związków lotnych lub ich mieszanin. W tej drugiej metodzie stymulacji preparatu impulsy powietrza z ciągłego strumienia są kierowane przez szklaną strzykawkę zawierającą kawałek papieru filtracyjnego, na którym naniesiono związki. Bodziec zapachowy był podawany impulsowo za pomocą zaworu elektromagnetycznego sterowanego przez oprogramowanie.
  10. Jeśli aktywność jednostek nagle ustanie lub ulegnie zmianie, sprawdź kroplownik z solą fizjologiczną i pozostaw preparat do odpoczynku na 15 min. Jeśli aktywność spontaniczna nie powróci do poprzedniego poziomu, preparat należy odrzucić i, jeśli jest dostępna, użyć kolejnej pszczoły.
  11. Po zakończeniu eksperymentu utrwal mózg w 5% formalinie przez 20 min, pozostawiając sondę w tkance. Następnie wyizoluj mózg i umieść go w 2% glutaraldehydzie na 4 h, a następnie przeprowadź stopniową serię odwodnienia w etanolu i przejaśnij mózg za pomocą salicylanu metylu. Na podstawie utrwalenia i przejaśnienia tkanki miejsca w AL, w których elektrody przebiły tkankę, powinny być wyraźnie widoczne w mikroskopii konfokalnej.

4. Analiza danych

  1. Po zakończeniu eksperymentu przeanalizować zgromadzone dane w celu wyizolowania i zidentyfikowania zarejestrowanych jednostek neuronalnych. Użyć typowych programów komputerowych (Offline Sorter, MClust i SClust) do rozdzielenia kształtów fal, tzw. „spikes” (wyładowań), w oparciu o ich morfologię, np. amplitudę szczytu lub doliny, szerokość połówkową szczytu itp., lub miary zredukowane (analiza głównych składowych)17,18 (Rysunek 2). Do dalszej analizy wykorzystać wyłącznie te klastry wyładowań, które zostały rozdzielone w przestrzeni trójwymiarowej (PC1-PC3) i różnią się od siebie statystycznie (wielowymiarowa ANOVA; p < 0,05) (Rysunek 2). Pełny opis metodologii rejestracji tetrodowej oraz sortowania wyładowań znajduje się w cytowaniach 17-19.
  2. Przypisać znaczniki czasu do wyładowań w każdym klastrze, a następnie wyeksportować te dane do analizy w programie MATLAB lub Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) w celu utworzenia wykresów rastrowych oraz odpowiedzi częstotliwości wyładowań (Rysunki 2, 3A).
  3. Zidentyfikować czasy retencji substancji lotnych, korzystając z jednocześnie zarejestrowanych danych GC. Wykorzystać czasy retencji tych substancji, określone przez wierzchołek piku na chromatogramie, aby zbadać odpowiedzi jednostek w tych punktach czasowych.
  4. Aby zbadać odpowiedzi poszczególnych jednostek podczas przebiegu GC, pogrupować liczbę wyładowań w przedziałach 100 msec i przeanalizować przebieg czasowy odpowiedzi częstotliwości wyładowań w odniesieniu do czasu retencji eluowanych substancji lotnych. Grupowanie wyładowań w przedziałach 100 msec zapewnia wystarczającą szczegółowość sygnału dotyczącą przebiegu czasowego odpowiedzi neuronalnej na substancję zapachową eluowaną z GC.
  5. Aby zbadać odpowiedzi populacyjne na różne eluowane substancje lotne, zintegrować odpowiedzi częstotliwości wyładowań poszczególnych jednostek w 3 s oknie próbkowania (1,5 s przed i 1,5 s po czasie retencji substancji lotnej) (Rysunek 3). Okres ten jest typowy dla czasu elucji substancji lotnej z GC. Odpowiedzi częstotliwości wyładowań jednostek przedstawiono za pomocą kodowania kolorami (kolor czerwony oznacza wysoką częstotliwość wyładowań, niebieski – niską) i ułożono w formie macierzy aktywności, w której każdy wiersz reprezentuje odpowiedź zespołu na efluent GC (kolumny) (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W teście GCMR z wykorzystaniem zapachu kwiatowego M. lewisii wstrzykujemy 3 μl ekstraktu do GC. Całkowita liczba substancji lotnych eluujących z GC wynosi zazwyczaj 60-70. Zapach M. lewisii składa się głównie z monoterpenoidów, w tym z β-myrcenu (acyklicznego) i α-pinenu, natomiast resztę zapachu stanowią substancje lotne sześciowęglowe, takie jak 2-heksanol, oraz seskwiterpenoidy, które stanowią < 1% przestrzeni nadpróbkowej.

GCMR wykorzystuje czułość n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zachowania owadów sterowane węchem napędzają wiele różnych procesów, w tym rozród, wybór miejsca gospodarza oraz identyfikację odpowiednich zasobów pokarmowych. Badanie tych procesów wymaga umiejętności identyfikacji substancji lotnych emitowanych przez źródło, a także zdolności do rozpoznania związków, które pośredniczą w tych zachowaniach. Sytuację komplikuje fakt, że zapachy składają się z dziesiątek lub setek poszczególnych związków, które wspólnie tworzą unikalny aromat, postrzegany inaczej niż jego poszczególne skł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant NSF IOS 1121692 oraz przez Research Foundation Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Porapak Type Q 80-100 meshWatersWAT027060
Worki do piekarnika ReynoldsReynolds
GCAgilent7820A
Kolumna GCJ&W Scientific, Folsom, CA, USADB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analityczny hel jako gaz nośnyPraxairHE K1 cc/min
16-kanałowa elektroda krzemowaNeuronexus Technologiesa4x4-3mm50-177
Cienki drut NiCr, średnica 0.012 mm) Sandvik Kanthal HP ReidPX000004Do wykonania niestandardowych tetrod i steretrod
PrzedwzmacniaczTucker-Davis SystemPZ-2
Wzmacniacz Tucker-Davis SystemRZ-2
System akwizycji danych - pakiet OpenExTucker-Davis System
Oprogramowanie do sortowania impulsów online - SpikePacTucker-Davis System
Oprogramowanie do sortowania impulsów offline - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of MinnesotaBezpłatne pobieranie ze strony http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.htmlNarzędzia MATLAB

Bibliografia

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570(1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725(2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440(2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098(2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282(2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382(2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mózg trutniarejestracja aktywności neuronalnejprzestrzeń nadkwiatowawprowadzanie elektrodtechnika GCMRdetekcja substancji lotnych
Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.