Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4384

⸱

16 października 2012

 , 
1Institute of Molecular Life Sciences, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

Streszczenie

Neurony komisuralne dI1 zostały szeroko zbadane w celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas rozwoju1,2. Neurony te znajdują się w grzbietowej części rdzenia kręgowego i wysyłają swoje aksony wzdłuż stereotypowych trajektorii. Aksony komisuralne początkowo kierują się brzusznie w stronę płyty dna, a następnie przecinają ją. Po przekroczeniu linii środkowej aksony te wykonują gwałtowny zwrot w kierunku rostralnym i biegną podłużnie w stronę mózgu. Każdy z tych etapów jest regulowany przez skoordynowane działanie atraktantów i repulsantów prowadzących. Prawidłowa interpretacja tych sygnałów jest kluczowa dla prowadzenia aksonów wzdłuż ich wyznaczonej ścieżki. Zatem fizjologiczny wkład konkretnej cząsteczki w prowadzenie aksonów komisuralnych najlepiej badać w kontekście żywego embrionu. W związku z tym wyciszanie genów in vivo musi być precyzyjnie kontrolowane, aby można było starannie odróżnić aktywność genów w prowadzeniu aksonów od ich potencjalnych wielu innych ról podczas rozwoju.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wyciszania ekspresji genów w rurce nerwowej kurczaka w sposób specyficzny dla typu komórek i umożliwiający ich śledzenie. Wykorzystujemy nowatorskie wektory plazmidowe3 zawierające specyficzne dla typu komórek promotory/enhancery, które sterują ekspresją fluorescencyjnego białka markerowego, bezpośrednio po którym następuje transkrypt miR30-RNAi4 (zlokalizowany w obrębie 3'-UTR cDNA kodującego białko fluorescencyjne) (Rycina 1). Po elektroporacji do rozwijającej się rurki nerwowej wektory te wywołują wydajną regulację w dół ekspresji genów oraz ekspresję jasnych fluorescencyjnych białek markerowych, co umożliwia bezpośrednie śledzenie komórek poddanych wyciszeniu3. Mieszanie różnych wektorów RNAi przed elektroporacją pozwala na jednoczesne wyciszenie dwóch lub więcej genów w niezależnych regionach rdzenia kręgowego. Umożliwia to badanie złożonych oddziaływań komórkowych i molekularnych podczas rozwoju w sposób szybki, prosty, precyzyjny i niedrogi. W połączeniu ze śledzeniem trajektorii aksonów komisuralnych za pomocą DiI w preparatach typu open-book5, metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badań in vivo komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów komisuralnych. W zasadzie można zastosować dowolny promotor/enhancer, co potencjalnie zwiększa możliwości zastosowania tej techniki w badaniach in vivo funkcji genów podczas rozwoju6.

W niniejszym filmie zaprezentowano najpierw sposób obchodzenia się z jajami i ich okienkowania, wstrzykiwanie plazmidów DNA do rurki neuralnej oraz procedurę elektroporacji. W celu zbadania prowadzenia aksonów komisuralnych rdzeń kręgowy zostaje usunięty z zarodka w formie preparatu typu „otwarta książka” (open-book preparation), utrwalony, a następnie wstrzyknięty DiI, co pozwala na śledzenie przebiegu aksonów. Rdzeń kręgowy zostaje zamontowany między szkiełkami cover-slip i poddany wizualizacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidowego DNA RNAi do specyficznego dla typu komórek wyciszania genów

Plazmidy (Rycina 1) są syntetyzowane przy użyciu standardowych technik klonowania molekularnego, zgodnie z wcześniejszymi szczegółowymi opisami3,4.

1.1 Klonowanie do wektorów: projektowanie oligonukleotydów

  1. Stosujemy te same uniwersalne oligonukleotydy i protokoły klonowania, które opisano w informacjach o produkcie dołączonych do wektora pRFPRNAiC4 (ARK-Genomics).
    1. Do klonowania w pierwszym miejscu spinki (hairpin site):
      starter 5' HP1:
      5'-GGCGGGGCTAGCTGGAGAAGATGCCTTCCGGAGAGGTGCTGCTGAGCG
      starter 3' HP1:
      5'-GGGTGGACGCGTAAGAGGGGAAGAAAGCTTCTAACCCCGCTATTCACCACCACTAGGCA
    2. Do klonowania w drugim miejscu spinki (hairpin site):
      starter 5' HP2:
      5'-GGCGGGACGCGTGCTGTGAAGATCCGAAGATGCCTTGCGCTGGTTCCTCCGTGAGCG
      starter 3' HP2:
    3. 5'-CGCCGCGCATGCACCAAGCAGAGCAGCCTGAAGACCAGTAGGCA
  2. Do wyboru genospecyficznych sekwencji docelowych wykorzystujemy narzędzie siRNA Target Finder firmy Genscript: https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai.
  3. Startery do klonowania genospecyficznego miRNA w pierwszym miejscu spinki:

Poniżej przedstawiono przykład wyciszania GFP.
Sekwencja docelowa (22nt): 5'-GGCACAAGCTGGAGTACAACTA
GFP Forward HP1 = 59mer
Schemat wyniku sekwencjonowania DNA przedstawiający sekwencję nukleotydową dla analizy genu.
GFP Reverse HP1 = 58mer
Sekwencja nici DNA, proces edycji genów, symbol, badania, genomika, biotechnologia.
W tych oligonukleotydach występują wspólne sekwencje, które stanowią część sekwencji flankujących miRNA (specyficznych dla kurczaka), a także wspólne sekwencje pętli/trzonu (pochodzące z ludzkiego miRNA30). Specyficzne dla genu sekwencje docelowe są podkreślone. Należy zauważyć, że na pozycji 5' nici forward występuje niedopasowanie (zaznaczone pogrubieniem; G→A w tym przykładzie), aby odwzorować naturalne niedopasowanie w miRNA30 w tej pozycji.

  1. Startery do klonowania specyficznego dla genu miRNA w drugim miejscu spinki:

Poniżej przedstawiono przykład wyciszania LacZ.
Sekwencja docelowa (22nt): 5'-CGCGCTGTATCGCTGGATCAAA
LacZ Forward HP2:
Sekwencja genetyczna, zasady DNA, format tekstowy; analiza sekwencji, badania genomu, bioinformatyka.
LacZ Reverse HP2:
Sekwencja nukleotydowa DNA, 5'-CCTGAAGACCAGTAGGCACGC, koncepcja genetyki molekularnej, dane badawcze.
Należy zauważyć, że ponownie zmieniono zasadę 5' sekwencji docelowej w nici forward (zaznaczono pogrubieniem; w tym przykładzie C→A), aby nie była ona komplementarna do sekwencji antysensownej, co naśladuje miRNA30.

1.2 Reakcja PCR i subklonowanie

  1. Oligonukleotydy specyficzne dla genu stosuje się wraz z oligonukleotydami uniwersalnymi w reakcji PCR w celu wygenerowania spinki typu miRNA30 z flankującymi sekwencjami miRNA kurczaka.
Klonowanie do pierwszej witryny spinki (hairpin):
1 μl - 10 ng GFP Forward primer HP1
1 μl - 100 ng 5' primer HP1
1 μl - 100 ng 3' primer HP1
1 μl dNTPs (10 mM)
5 μl 10x Pfu reaction buffer
1 μl Pfu DNA Polymerase (Promega)
39 μl woda klasy PCR		LUBKlonowanie do drugiej witryny spinki (hairpin):
1 μl - 10 ng LacZ Forward primer HP2
1 μl - 100 ng 5' primer HP2
1 μl - 100 ng 3' primer HP2
1 μl dNTPs (10 mM)
5 μl 10x Pfu reaction buffer
1 μl Pfu DNA Polymerase (Promega)
39 μl woda klasy PCR

Cykle:

94 °C94 °C55 °C72 °C72 °C4 °C
1 min30 sec30 sec1 min9 minpodtrzymanie
 30 cykli  
  1. Oczyść produkt PCR, poddaj go trawieniu enzymami restrykcyjnymi i podklonuj do wektora:
    1. Pierwsza sekwencja spinki: użyj NheI i MluI
    2. Druga sekwencja spinki: użyj MluI i SphI
  2. Zastosuj standardowe techniki transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych. Wysiej komórki na agar LB (zawierający ampicylinę) i wyizoluj DNA za pomocą midi-preparatyki plazmidowej (np. zestaw Nucleobond Xtra Midi, Machery-Nagel).
  3. Zawieś skoncentrowane plazmidowe DNA w sterylnej ddH20, zmierz stężenie metodą spektrofotometryczną i przechowuj w temperaturze -20 °C.

1.3 Sekwencjonowanie plazmidów miRNA

W standardowych warunkach reakcja sekwencjonowania często nie powodzi się ze względu na silną strukturę drugorzędową spinek. Aby to poprawić7:

  1. Przeprowadź reakcję sekwencjonowania w 10 mM Tris-Cl z 0,01 mM EDTA (pH 8,0) zamiast w wodzie. Zwiększa to konwersję superzwiniętego DNA do ssDNA, które jest bardziej podatne na sekwencjonowanie.
  2. Dodaj etap denaturacji termicznej (98 °C, 5 min) przed sekwencjonowaniem. Przekształca to superzwinięte DNA plazmidowe w ssDNA.

2. Elektroporacja

2.1 Obsługa jaj

  1. Umieść jaja w inkubatorze ustawionym na 38.5 °C i ok. 45% wilgotności.
  2. Inkubuj jaja, aż embriony osiągną pożądany stopień rozwoju. Aby badać prowadzenie aksonów neuronów komisuralnych, zazwyczaj przeprowadzamy elektroporację embrionów, gdy osiągną one stadium 17-18 według skali Hamburgera i Hamiltona (HH) (po około 3 dniach inkubacji)8. Jednakże iniekcję i elektroporację należy przeprowadzić przed nagromadzeniem się badanego białka, aby zapewnić wysoką wydajność wyciszenia genu (knockdown).
  3. Wyjmij jaja z inkubatora i pozostaw je w stabilnej pozycji poziomej na 20 min, aby embrion przemieścił się na górną stronę jaja, ponad żółtko. W tym czasie przechowuj jaja w inkubatorze.

2.2 Przygotowanie odczynników i sprzętu

  1. Przygotować sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i wysterylizować ją poprzez autoklawowanie lub przepuszczenie roztworu przez filtr 0,2 μm.
  2. Wykonać szklane mikropipety poprzez wyciąganie kapilar (World Precision Instruments 1B120F-4; 1,2 / 0,68 OD/ID (mm)) w odpowiednim urządzeniu do wyciągania (np. Narishige PC-10). Odłamać końcówkę mikropipety, aby uzyskać średnicę wierzchołka wynoszącą ~5 μm, a następnie podłączyć ją do fragmentu rurki o odpowiedniej średnicy.
  3. Mocno zamocować elektrody platynowe (o długości 0,5 cm) w ramce trzymanej w dłoni, zachowując odległość międzyelektrodową 0,5 cm. Podłączyć elektrody do generatora impulsów prostokątnych (BTX ECM 830).
  4. Ustawić generator impulsów zgodnie z następującymi parametrami:
    1. Dla elektroporacji jednostronnej: napięcie: 25 V, liczba impulsów: 5, czas trwania impulsu: 50 msec, odstęp między impulsami: 1 sec
    2. Dla elektroporacji obustronnej: napięcie: 18 V, liczba impulsów: 5, czas trwania impulsu: 50 msec, odstęp między impulsami: 1 sec
  5. Przygotować strzykawkę z igłą 18 G, skalpel, butelkę z atomizerem zawierającą 70% etanol oraz taśmę.
  6. Roztopić wosk parafinowy w zlewce na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C.

2.3 Okienkowanie

  1. Przetrzyj jaja chusteczką nasączoną 70% etanolem.
  2. Przyklej pasek taśmy wzdłuż długiej osi jaja.
  3. Za pomocą skalpela wykonaj dwa małe otwory w skorupce jaja: jeden na tępym końcu jaja, a drugi w narożniku obszaru, który ma zostać wycięty.
  4. Używając strzykawki, usuń ok. 3 ml białka z każdego jaja, wprowadzając igłę pod kątem 45° do otworu na tępym końcu jaja. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić żółtka.
  5. Wytnij okno w skorupce jaja za pomocą małych nożyczek, trzymanych poziomo, aby uniknąć uszkodzenia zarodka. W razie potrzeby pozycję zarodka można zweryfikować i zaznaczyć ołówkiem, przyświetlając mocnym światłem tępy koniec jaja. Do większości zastosowań wystarczające jest okno o wymiarach 1,5 do 2 cm kwadratu.
  6. Uszczelnij otwór na tępym końcu jaja oraz wszelkie pęknięcia w skorupce za pomocą roztopionego wosku parafinowego, nakładanego pędzelkiem.
  7. Zabezpiecz okno za pomocą przezroczystej taśmy (np. Scotch Magic).
  8. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze.

2.4 Elektroporacja

  1. Przygotować sterylne narzędzia i przetrzeć obszar roboczy 70% etanolem.
  2. Przygotować roztwór do iniekcji. Odpowiednie stężenie DNA musi zostać określone przez użytkownika i będzie ono zależeć od zastosowanego wzmacniacza/promotora sterującego ekspresją. Jako wytyczną przyjmujemy zazwyczaj 0,2-2,0 μg/μl (patrz sekcja Dyskusja). W całkowitej objętości 20 μl mieszanina do iniekcji powinna zawierać:
DNA plazmidowy RNAi (w H20)X μl
20x PBS1 μl
0,4% błękit trypanu2 μl
sterylna ddH20, do objętości końcowej20 μl

Używając delikatnego ssania, wprowadź mieszaninę DNA do szklanej mikrokapilary przymocowanej do rurki.

  1. Usuń taśmę z okna w jajku i określ stadium rozwoju zarodka zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona8.
  2. Za pomocą pęsety i nożyczek sprężynowych ostrożnie usuń błony pozazarodkowe z tylnej połowy zarodka. Błony można łatwo oddzielić od zarodka w obszarze, w którym główne prawe i lewe żyły pępekowe wchodzą do tułowia. Delikatnie rozerwij lub przetnij błony i odsunij je w stronę ogona. W razie potrzeby widoczność zarodka można poprawić, wstrzykując roztwór tuszu indyjskiego lub Fast Green pomiędzy tarczę zarodkową a żółtko jaja, zgodnie z instrukcją w filmie Boullanda i współpracowników9.
  3. Wstrzyknij roztwór DNA do kanału centralnego rurki nerwowej, tuż nad kończynami tylnymi. Objętość wstrzykiwanej cieczy kontroluj manualnie. Niebieski barwnik powinien rozprzestrzenić się od konca ogona aż do komory rozwijającego się mózgu.
  4. Dodaj kilka kropli sterylnego PBS na zarodek.
  5. Umieść elektrody równolegle do osi przednio-tylnej zarodka. Unikaj dotykania zarodka lub naczyń krwionośnych.
  6. Utrzymaj elektrody w stabilnej pozycji i przeprowadź elektroporację.
  7. Ostrożnie wyjmij elektrody i opłucz je sterylną wodą, aby usunąć zdenaturowane białka z białka jaja.
    1. W przypadku elektroporacji obustronnej zmień polaryzację elektrod, ustaw je ponownie równolegle do zarodka i powtórz elektroporację. Opłucz elektrody w sterylnej wodzie.
  8. Dodaj nieco więcej sterylnego PBS na zarodek. Ponownie zaklej jajo taśmą i umieść je w inkubatorze aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Prawidłowe uszczelnienie jest kluczowe, aby uniknąć odwodnienia zarodka.

3. Preparaty rdzenia kręgowego

3.1 Disekcja embrionów

  1. W stadium HH25-26 (5. dzień inkubacji) wyjąć zarodek z jaja za pomocą pęsety lub małej łyżeczki. Umieścić go w PBS w szalce Petriego powlekonej silikonem (elastomerem Sylgard).
  2. Usunąć błony pozazarodkowe i ułożyć zarodek na grzbiecie. Unieruchomić go na płytce, przypinając za pomocą szpilek entomologicznych (o średnicy 0.20 mm) w okolicy szyi i ogona, delikatnie go rozciągając.
    1. Całe zarodki (do późniejszego cięcia w sekcje) można utrwalić na tym etapie, zastępując PBS 4% paraformaldehydem (PFA) i inkubując przez 1 hr w temperaturze pokojowej. W celu przygotowania preparatów typu „open-book” kontynuować protokół z nieutrwaloną tkanką, zgodnie z poniższym opisem.

3.2 Izolacja rdzeni kręgowych z embrionów

  1. Przymocuj kończyny szpilkami, upewniając się, że są one wbijane pod kątem oddalonym od zarodka, aby nie przeszkadzały w sekcji. Zarodek powinien być oświetlony od dołu, co umożliwi ocenę gęstości tkanek w kolejnych krokach.
  2. Usuń serce i organy wewnętrzne, używając nożyczek sprężynowych i delikatnie skrobiąc pęsetą. Jeśli wszystkie organy zostaną całkowicie usunięte, widoczne powinny być segmentowe kręgi oraz rdzeń kręgowy.
  3. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj płytkie cięcie przez kręgi nad rdzeniem kręgowym w obrębie szyi. Obróć zarodek o 180° i wykonaj dwa krótkie cięcia podłużne przez kręgi po obu stronach rdzenia kręgowego, od szyi w kierunku ogona. Użyj pęsety, aby unieść płat kręgów znad rdzenia kręgowego i oddzielić tkankę (zawierającą wszystkie kręgi) w jednym pasie w kierunku ogona.
  4. Delikatnie rozciągnij i ponownie przymocuj szpilkami zarodek za pomocą ogona i kończyn.
  5. Użyj precyzyjnego skalpela mikrochirurgicznego (np. Grieshaber 68101) lub igły wolframowej, aby wyciąć opony nad rdzeniem kręgowym. Poszukaj ciemnej, gęstej linii tkanki między rurką neuralną a zwojami korzeni grzbietowych. W razie potrzeby dostosuj kąt oświetlenia. Delikatnie wykonaj cięcie podłużne wzdłuż tej linii po każdej stronie rdzenia kręgowego, od szyi do ogona. Opony powinny oddzielić się od rdzenia kręgowego dzięki delikatnemu rozciągnięciu przymocowanego zarodka.
  6. Przetnij rdzeń kręgowy na poziomie pąka skrzydłowego oraz gudałnie w stosunku do pąka kończyny i wyjmij cały rdzeń kręgowy z zarodka jednym płynnym ruchem od strony rostralnej do kaudalnej, używając pęsety. Wyizolowany rdzeń kręgowy powinien w tym kroku pozostawać zanurzony w PBS. Nie wyjmuj go z naczynia.

3.3 Fixacja preparatów typu open-book

  1. Rozłożyć wyizolowany rdzeń kręgowy na szpatułce i przenieść go do nowej szalki Petriego wyłożonej silikonem, zawierającej 4% paraformaldehyd w PBS.
  2. Przygotować preparat typu flat-mount, ostrożnie przypinając rdzeń kręgowy w sześciu punktach (rostralnie, przyśrodkowo i kaudalnie po każdej stronie, używając szpilek entomologicznych 0,10 mm). Każdy preparat oznakowujemy małą „flagą”, która nie tylko identyfikuje embrion, ale także wskazuje koniec przedni preparatu w układzie rozkwitniętej książki.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej od 30 min do 1 h. Preparaty w układzie rozkwitniętej książki nie powinny być nadmiernie utrwalone, ponieważ zmniejsza to wydajność dyfuzji DiI10 i zwiększa tło.
  4. Ostrożnie odlać 4% PFA i zastąpić go PBS. Przechowywać szalki w temperaturze 4 °C aż do momentu wstrzyknięcia DiI lub montowania.

3.4 Iniekcja DiI do neuronów komisuralnych

  1. Obserwować preparaty rozcięte (open-books) pod mikroskopem fluorescencyjnym i wybrać odpowiednią stronę do iniekcji barwnika DiI.
  2. Przygotować Fast DiI (5 mg/ml w etanolu) i naciągnąć roztwór do szklanej mikropipety przymocowanej do plastikowej rurki. Odłamać końcówkę mikropipety tak precyzyjnie, jak to możliwe, aby uzyskać końcówkę o bardzo małej średnicy. Zanurzyć igłę w naczyniu z PBS i sprawdzić, czy DiI nie wycieka z igły. Jeśli DiI wycieka, średnica igły jest zbyt duża. W takim przypadku należy przygotować nową igłę.
  3. Oświetlić preparaty rozcięte od dołu. Odnaleźć gęstszy podłużny pas tkanki, znajdujący się w odległości około 1/5 szerokości połowy preparatu od krawędzi bocznej. Odpowiada on ciałom komórkowym neuronów komisuralnych, które znajdują się bezpośrednio brzusznie względem płytki dachowej. Wprowadzić szklaną igłę w tkankę, zaczynając od jednego końca preparatu, a następnie, podczas wycofywania igły, wpompować niewielką ilość DiI za pomocą pipety ustnej.
  4. Pracować szybko, wykonując kilka iniekcji wzdłuż długości preparatu w regularnych odstępach około 0.5 mm. W przypadku zapchania się igły, ostrożnie udrożnić ją pęsetą. Jeśli końcówka stanie się zbyt szeroka (i DiI zacznie wyciekać), należy wymienić igłę.
  5. Po zakończeniu pracy nad każdym preparatem, za pomocą pipety transferowej odessać i usunąć nadmiar wyciekającego DiI. Zaniechanie tego kroku spowoduje wysokie tło fluorescencyjne.
  6. Pozostawić preparaty na około trzy dni w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozprzestrzenienie się DiI wzdłuż aksonów.

3.5 Montowanie do obrazowania

  1. Za pomocą strzykawki z igłą 18 G nanieś cienką, nieprzerwaną obwódkę smaru próżniowego (np. Dow Corning #976V) wokół krawędzi szkiełka podstawowego o wymiarach 24 mm x 24 mm. Do dołka dodaj kilka kropli sterylnego PBS. Należy pamiętać, że medium montażowe zawierające glicerol z galianem n-propylowym może być niekompatybilne z DiI11. Podobnie, smar próżniowy o niskiej lepkości może zmieszać się z PBS, co doprowadzi do powstania wysokiego tła.
  2. Usuń piny z preparatu typu open-book i przenieś go do kropli PBS. Zanurz open-book i ustaw go na środku dołka.
  3. Ostrożnie połóż na wierzchu drugie szkiełko podstawowe 24 mm x 24 mm, upewniając się, że open-book pozostaje otwarty. W razie potrzeby szkiełko można zdjąć i ponownie ustawić open-book. Delikatnie dociśnij krawędzie preparatu, aby stworzyć szczelną warstwę smaru. Podczas tego kroku nadmiar PBS zostanie wyciśnięty. Należy unikać pęcherzyków powietrza.
  4. Przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia inspekcji i dokumentacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powinno to zostać wykonane sprawnie (w ciągu jednego tygodnia), aby zapobiec wyschnięciu preparatów.

4. Reprezentatywne wyniki

Elektroporacja i ekspresja plazmidów

W warunkach opisanych powyżej białko fluorescencyjne powinno być wyraźnie wykrywalne w odpowiednim typie komórek bez konieczności dodatkowej amplifikacji sygnału poprzez znakowanie przeciwciałami. Białko fluorescencyjne powinno być wykrywalne wyłącznie w pożądanym typie/typach komórek. Reprezentatywne przykłady preparatów w układzie otwartym oraz przekrojów poprzecznych embrionów elektroporowanych różnymi plazmidami przedstawiono na Rysunku 2.

Wydajność sztucznych miRNA

Sztuczne cząsteczki miRNA przeciwko nowemu genowi zainteresowania muszą zostać najpierw przetestowane pod kątem wydajności i specyficzności ich efektów wyciszania (knockdown). Stwierdziliśmy, że konstrukty pod kontrolą promotora β-aktyny, wprowadzane drogą elektroporacji w stężeniu 0,25 μg/μl, są do tego celu odpowiednie3. Wyciszanie in vivo można badać za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Znakowanie DiI

Odpowiednio ukierunkowane iniekcje DiI do embrionów typu dzikiego powinny skutkować uzyskaniem idealnych, archetypowych trajektorii w ponad 80% miejsc iniekcji3, co przedstawiono na Ryc. 3. Zmienność międzyosobnicza powinna być niska.

Schemat plazmidu z promotorem RNA Pol II i reporterem fluorescencyjnym; schemat klonowania miRNA.
Rycina 1. Ogólny schemat wektorów plazmidowych wykazujących ekspresję miRNA. Zastosowanie różnych promotorów/enhancerów polimerazy RNA II umożliwia ekspresję specyficzną dla danego typu komórek. Komórki przetransfekowane można zidentyfikować dzięki ekspresji reportera fluorescencyjnego, który jest bezpośrednio powiązany (w obrębie jednego transkryptu) z jednym lub dwoma sztucznymi cząsteczkami miRNA, które wyciszają ekspresję genów. Pogrubiony tekst oznacza nić sensowną sztucznego miRNA przeciwko LacZ, zgodnie z opisem w tekście.

Mikroskopia fluorescencyjna neuronów; βactin, Math1, Hoxa1; przekrój poprzeczny; metoda electroporacji bilateralnej.
Rycina 2. Reprezentatywne przykłady wzorców ekspresji białek fluorescencyjnych uzyskanych po electroporacji wskazanych wektorów plazmidowych. Przekroje poprzeczne i preparaty w układzie otwartej książki pochodzą z embrionów kurzych w stadium HH25-26, które poddano electroporacji w stadium HH18. Promotor β-actin steruje ekspresją powszechną, enhancer Math1 steruje ekspresją w neuronach dI1, a enhancer Hoxa1 steruje ekspresją specyficznie w płytce dna. CN, neuron komisuralny; FP, płytka dna.

Wstrzykiwanie DiI w preparacie otwarta książka, obrazowanie GFP i DiI, schemat analizy wad prowadzenia aksonów.
Rycina 3. Aplikacja i analiza miejsc wstrzykiwania DiI w preparatach typu otwarta książka. DiI należy wstrzykiwać punktowo, blisko bocznej krawędzi otwartej książki, po stronie poddanej elektroporacji (zidentyfikowanej na podstawie ekspresji białka fluorescencyjnego). Po 3 dniach dyfuzji trajektorie aksonów komisuralnych powinny być widoczne w mikroskopii fluorescencyjnej. Normalne trajektorie aksonów będą rosły w kierunku płyty dna, przejdą przez płytę dna, a następnie skręcą i będą rosły w kierunku rostralnym. Nieprawidłowe fenotypy wynikające z wyciszenia genu można porównać z tą archetypową trajektorią. Na przykładzie widać, że niektóre aksony zatrzymują się w płycie dna lub podejmują błędne decyzje dotyczące skrętu po stronie przeciwległej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ta prosta, oparta na wektorach strategia ekspresji sztucznego miRNA może być wykorzystana do wyciszenia endogennej ekspresji genów w cewie nerwowej kurczaka. Te funkcjonalne narzędzia umożliwiają jednoczesne wyciszanie wielu genów, kontrolę czasową oraz specyficzność komórkową, co ułatwia wyjaśnianie złożonych ścieżek rozwojowych. W szczególności wykazaliśmy użyteczność tych plazmidów w badaniu prowadzenia aksonów komisuralnych, ponieważ plazmidy te mogą być wykorzystane do wyciszenia różnych genów w neuronach komisuraln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium E.S. jest wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową. Chcielibyśmy podziękować dr. Beat Kunza za pomoc w filmowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilary szklane 0.5 mmWorld Precision Instruments1B120F-4
Wytwornica elektrod szklanychNarishigePC-10
ElektroporatorBTXECM 830
Elastomer silikonowy SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184
Drut wolframowy, 0.075 mmWorld Precision InstrumentsTGW0325
Szpilki entomologiczne, 0.20 mmFine Science Tools26002-20
Szpilki entomologiczne, 0.10 mmFine Science Tools26002-10
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15003-08
Pinceta Dumont #5Fine Science Tools11252-20
Pinceta Dumont #55Fine Science Tools11255-20
Fast DiIMolecular ProbesD-7756
Mikroskopy fluorescencyjneOlympusSZX12, BX51

Bibliografia

  1. Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
  2. Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21(2009).
  3. Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).
  4. Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).
  5. Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
  6. Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
  7. Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  9. Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).
  10. Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
  11. Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
  14. Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
  15. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
  16. Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neural Tube DevelopmentCommissural Axon GuidanceDiI TracingOpen Book PreparationFluorescent MicroscopyPlasmid InjectionGene KnockdownCell Type SpecificHamburger Hamilton Staging
In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.