W niniejszym materiale opisujemy sposób identyfikacji fazy cyklu rozrodczego myszy (proestrus, estrus, metestrus lub diestrus) poprzez prosty, nieinwazyjny pobór oraz ocenę cytologiczną wymazów z pochwy. Opisujemy również, w jaki sposób cytologia pochwy odzwierciedla poziomy krążących hormonów, które warunkują przejście przez poszczególne etapy cyklu rozrodczego myszy.
Artykuł metodologiczny
Wykonanie płukania pochwy, barwienia fioletem krystalicznym i cytologicznej oceny pochwy w celu identyfikacji fazy cyklu rujowego u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybka metoda oceny stanu rozrodczego gryzoni jest przydatna nie tylko w badaniu dysfunkcji rozrodczych, ale jest również niezbędna przy tworzeniu nowych modeli chorób u myszy oraz w badaniach nad hormonalną regulacją degeneracji (lub regeneracji) tkanek po wywołaniu stanu patologicznego. Cykl rozrodczy (estralny) myszy dzieli się na 4 fazy: proestrus, estrus, metestrus i diestrus. Wyraźne wahania poziomu krążących sterydów jajnikowych, takich jak 17-β-estradiol i progesteron, gonadotropin – hormonu luteinizującego i folikulostymulującego – oraz hormonu luteotropowego, jakim jest prolaktyna, sygnalizują przejście przez te etapy rozrodcze. Zmiany w typologii komórek w kanale pochwy myszy odzwierciedlają te podstawowe zdarzenia endokrynne. Codzienna ocena względnego stosunku jądrowych komórek nabłonkowych, zrogowaciałych komórek nabłonka płaskiego i leukocytów obecnych w mazakach z pochwy może służyć do identyfikacji faz cyklu estralnego u myszy. Jednak stopień inwazyjności metody pobierania tych próbek może zmienić stan rozrodczy i wywołać odpowiedź zapalną, która może zakłócić cytologiczną ocenę mazaków. W niniejszym protokole opisujemy prostą, nieinwazyjną metodę, która może być wykorzystana do określenia fazy cyklu estralnego samicy myszy bez wpływu na jej cykl rozrodczy. Szczegółowo opisujemy sposób różnicowania czterech faz cyklu estralnego poprzez pobieranie i analizę dominującej typologii komórek w mazakach z pochwy oraz pokazujemy, jak zmiany te można interpretować w odniesieniu do stanu endokrynnego.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- W celu przygotowania sterylnego płukania pochwy, poddać wodę dwukrotnie destylowaną (ddH2O) autoklawowaniu i przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
- Do oceny cytologicznej dodać 0,1 g proszku fioletowego krystalicznego do 100 ml ddH2O. Dobrze wymieszać. Barwnik fioletowy krystaliczny (0,1%) można przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
2. Pobieranie komórek pochwy (płukanie pochwy)
- Umieść lateksową gruszkę na końcu sterylnego 200 μl zanurzyć końcówkę i pobrać około 100 μl sterylnej wody podwójnie destylowanej (ddH2O)2wykorzystując skalę na końcówce jako wytyczną objętości.
- Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na pokrywie klatki, tak aby jej tylna część była skierowana w Twoją stronę.
- Mocno chwyć za ogon i unieś tylną część ciała. Mysz będzie teraz trzymać się zasobnika jedynie przednimi łapami. W tym momencie mysz może oddać mocz. Jeśli tak się stanie, należy poczekać do ustania micturycji. W przypadku pozostania moczu przy wejściu do kanału pochwy, należy przepłukać otwór nadmiarem ddH2O.2O używając oddzielnego końcówki (t.j., a nie końcówki do pobierania próbek).
- Umieść koniec ddH2Umieścić końcówkę wypełnioną w otworze kanału pochwy, dbając o to, aby nie wprowadzić jej do środka, ponieważ stymulacja pochwy (i szyjki macicy) może wywołać pseudociążę u szczurów.1,2Niedawne doniesienia sugerują, że myszy są mniej podatne na ten efekt, niemniej jednak należy zachować ostrożność, aby zminimalizować stopień inwazyjności podczas wielokrotnych analiz.3.
- Delikatnie naciśnij gruszkę, aby wypuścić od jednej czwartej do połowy objętości wody (~25-50 μl) przy ujściu kanału pochwy. Ciecz zostanie samoistnie zasana do kanału bez konieczności wprowadzania końcówki. Powoli zwolnić nacisk wywierany na gruszkę. Płyn cofnie się do końcówki. Należy unikać zbyt szybkiego zwalniania nacisku, aby zapobiec zasaniu płynu do gruszki. Do tego celu użyteczna może być końcówka z filtrem.
- Powtórz poprzedni krok 4–5 razy, używając tego samego końcówki, gruszki i cieczy, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek w pojedynczej próbce.
- Nanieść płyn na szkiełko przedmiotowe i pozostawić rozmaz całkowicie do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu rozmazy z cyklu rujowego można barwić natychmiast lub przechowywać i barwić w późniejszym terminie.
3. Barwienie cytologiczne fioletem krystalicznym*4
- Umieść wysuszone szkło w naczyniu Coplina (lub innym porównywalnym naczyniu do barwienia) zawierającym barwnik fiolet krystaliczny na 1 min.
- Przenieś szkło do drugiego naczynia Coplina zawierającego ddH2O. Płucz preparat ddH2O przez 1 min. Powtórz czynność.
- Usuń nadmiar ddH2O z krawędzi szkła za pomocą delikatnego ręcznika papierowego, unikając kontaktu z zabarwionym maząkiem.
- Nanieś pipetą około 15 μl glicerolu na maząk i nakryj go szkiełkiem cover-slip. Alternatywnie można zastosować inne odczynniki do montowania histologicznego w celu uzyskania trwalszego, niedyfundującego zabarwienia.
* Opisana tutaj metoda barwienia jest najprostszą procedurą, którą można przeprowadzić w każdym laboratorium. Inne metody mogą dostarczyć dodatkowych szczegółów. Na przykład, stosując barwienie Papanicolaou, można rozróżnić stopień dojrzałości jądrzastych komórek nabłonkowych, gdzie komórki mniej dojrzałe barwią się na turkusowo, a bardziej dojrzałe na różowo lub pomarańczowo. Różnice te mogą być wykorzystane do określenia wczesnej lub późnej fazy proestrusu.4
4. Cytologia pochwy
- Zbadaj rozmaz pod mikroskopem świetlnym, aby określić obecne typy komórek. Badanie mikroskopowe należy przeprowadzić niezwłocznie po barwieniu, ponieważ fiolet krystaliczny z czasem dyfunduje z komórek w przypadku zastosowania glicerolu do przykrywek. W momencie analizy należy wykonać mikrofotografie w celu udokumentowania cytologii.
- Zacznij od zbadania całego rozmazu przy mniejszym powiększeniu. Wybierz reprezentatywny obszar i przejdź na większe powiększenie. Zobaczysz rogowane komórki nabłonka płaskiego, leukocyty i/lub jądrowe komórki nabłonkowe (wyniki reprezentatywne, Rysunek 1A-C). Stosunek obecnych komórek pozwoli określić fazę cyklu rujowego myszy w momencie pobrania próbki (wyniki reprezentatywne, Rysunek 1D-G) oraz jej aktualny stan hormonalny (dyskusja, Rysunek 2).
5. Reprezentatywne wyniki
Cytologia: W próbkach z rozmazów pochwowych można wykryć trzy główne typy komórek: (1) jądrowe komórki nabłonkowe (Rysunek 1A), (2) zrogowaciałe komórki nabłonka płaskiego (Rysunek 1B) oraz (3) leukocyty (Rysunek 1C). Komórki nabłonkowe z jądrem charakteryzują się słabo barwiącą się cytoplazmą, ciemniej barwiącą się błoną komórkową i owalnym jądrem (Rysunek 1A). Zrogowaciałe komórki nabłonka płaskiego są jednorodnie zabarwione, mają kształt bardziej wielokątny niż ich jądrowe poprzedniczki i nie posiadają jądra (Rysunek 1B). Wielojądrzaste leukocyty można odróżnić od komórek nabłonkowych po ich nieregularnym kształcie, ciemno barwiących się polimorficznych jądrach oraz niewielkich rozmiarach (Rysunek 1C, czarne strzałki). W przypadku zanieczyszczenia rozmazu moczem, kryształy kwasu moczowego są łatwo wykrywalne dzięki ich krystalicznym strukturom, które różnią się od wszystkich oczekiwanych typów komórek (Rysunek 3). Jeśli tak się stanie i uniemożliwi to wykrycie dominującego typu komórek, rozmaz należy odrzucić i nie używać go do określania stadium cyklu.
Wyznaczanie fazy: Względna proporcja typów komórek obserwowanych w rozmazach może służyć do zidentyfikowania fazy cyklu rujowego myszy w dniu pobrania próbki (Rycina 1D-G). W czasie proestrus komórki stanowią niemal wyłącznie skupiska okrągłych, dobrze uformowanych komórek nabłonkowych z jądrem (Rycina 1D, reprezentatywna komórka wskazana białą strzałką). W czasie estrus przeważają rogowacone komórki nabłonka płaskiego, występujące w gęsto upakowanych skupiskach (Rycina 1E, reprezentatywna komórka wskazana grotem strzałki). W czasie metestrus dominują małe, ciemno barwiące się leukocyty (Rycina 1F, reprezentatywna komórka wskazana czarną strzałką). Można zaobserwować rogowacone komórki nabłonka płaskiego, często w postaci fragmentów (Rycina 1F, reprezentatywna komórka wskazana czarnym grotem strzałki). W czasie diestrus nadal mogą występować rzadkie rogowacone komórki nabłonka płaskiego (Rycina 1G, reprezentatywna komórka wskazana czarnym grotem strzałki), jednak nadal przeważają leukocyty (Rycina 1G, reprezentatywna komórka wskazana czarną strzałką). Metestrus można odróżnić od diestrus po pojawieniu się komórek nabłonkowych z jądrem w fazie diestrus (Rycina 1G, reprezentatywna komórka wskazana białą strzałką).
Rycina 1. Ocena cytologiczna wymazów z pochwy może służyć do identyfikacji fazy cyklu rujowego. W próbkach wymazów z pochwy wykrywa się trzy główne typy komórek: (A) jądrowe komórki nabłonkowe, (B) zrogowaciałe płaskie komórki nabłonkowe oraz (C) leukocyty. Stosunek tych typów komórek obecnych w wymazie może posłużyć do zidentyfikowania myszy w fazie (D) proestrus, (E) estrus, (F) metestrus lub (G) diestrus, zgodnie z opisem w reprezentatywnych wynikach. Czarne groty strzałek w E, F i G wskazują reprezentatywne zrogowaciałe płaskie komórki nabłonkowe. Czarne strzałki w C, F i G wskazują reprezentatywne leukocyty. Białe strzałki w D i G wyróżniają reprezentatywne jądrowe komórki nabłonkowe.
Rycina 2. Cytologia rozmazu z pochwy odzwierciedla przebieg zdarzeń endokrynnych. Szczegółowe informacje znajdują się również w sekcji Dyskusja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 3. Kryształy kwasu moczowego mogą być obecne po barwieniu fioletem krystalicznym próbek zanieczyszczonych moczem. (A) Kryształy są przezroczyste i mogą mieć różne rozmiary (strzałki oraz obszar w ramce powiększony na (B)). W tym polu nie występują komórki. W przypadku wystąpienia zanieczyszczenia kryształami kwasu moczowego w polach wykorzystywanych do barwienia cytologicznego, dokładna identyfikacja obecnych typów komórek może być utrudniona, a rozmaz należy odrzucić. Paski skali = 50 μm.
Dyskusja
Zmiany te w typologii komórek wskazują na zachodzące procesy endokrynne. Faza proestrus cyklu rujniczego odpowiada ludzkiej fazie folikularnej cyklu menstruacyjnego5 i charakteryzuje się przedowulacyjnym wzrostem poziomu krążącego 17-β-estradiolu6 oraz niewielkim wzrostem poziomu prolaktyny7 (Rycina 2, Proestrus, panel lewy). Wzrost stężenia 17-β-estradiolu pośrednio stymuluje neurony wydzielające hormon uwalniający gonadotropiny w podwzgórzu i przegrodzie, które z kolei aktywują komórki odpowiedzi w przednim płacie przysadki do uwalniania hormonu lutenizującego i hormonu folikulotropowego do krwiobiegu8,9 (Rycina 2, Proestrus, panel lewy). W rozmazach pochwy pobranych od zwierząt w fazie proestrus obecne są niemal wyłącznie owalne, jądrowe komórki nabłonka (Rycina 1D, Rycina 2, Proestrus, panel prawy). Szczyt poziomu hormonu folikulotropowego sygnalizuje owulację i przejście w fazę estrus10,11. Podczas estrus poziomy 17-β-estradiolu spadają, a poziomy prolaktyny osiągają maksimum6,7 (Rycina 2, Estrus, panel lewy). Rozmazy pochwy charakteryzują się niemal wyłączną obecnością nieregularnych, zrogowaciałych komórek nabłonka wielowarstwowego płaskiego, często występujących w skupiskach (Rycina 1E, Rycina 2, Estrus, panel prawy). Przejście w fazę metestrus zbiega się z ciągłym wzrostem poziomu progesteronu6 i odpowiada początkowi ludzkiej fazy lutealnej12 (Rycina 2, Metestrus, panel lewy). Poziomy progesteronu zaczynają rosnąć, a w odpowiedzi na aktywację ciałażółtego następuje niewielki wzrost poziomu 17-β-estradiolu6,13,14 (Rycina 2, Metestrus, panel lewy). Typy komórek obecne w rozmazach pochwy na tym etapie to pofragmentowane, zrogowaciałe komórki nabłonka oraz mniejsze, ciemniej barwiące się leukocyty (Rycina 1F, Rycina 2, Metestrus, panel prawy). Na koniec u myszy następuje przejście w fazę diestrus, a poziom krążącego progesteronu osiąga szczyt6, co odpowiada późnej fazie lutealnej u ludzi12. Regresja ciałażółtego prowadzi do późniejszego gwałtownego spadku poziomu progesteronu15,16 (Rycina 2, Diestrus, panel lewy). W rozmazach podczas diestrus przeważają leukocyty. Częstość występowania zrogowaciałych komórek nabłonka jest zmniejszona, a jądrowe komórki nabłonka zaczynają pojawiać się tuż przed przejściem w fazę proestrus (Rycina 1G, Rycina 2, Diestrus, panel prawy).
Podsumowując, ten prosty, rutynowy protokół może być wykorzystany do szacowania codziennych wahań hormonalnych i określania fazy cyklu rujowego u myszy doświadczalnych bez zmiany stanu rozrodczego, pod warunkiem zachowania następujących środków ostrożności. Pobieranie próbek powinno być wykonywane nie częściej niż raz dziennie z wykorzystaniem opisanego tutaj nieinwazyjnego protokołu, w przeciwieństwie do wielokrotnego wprowadzania wymazu do kanału pochwy, aspiracji i agitacji. Może to powodować podrażnienie pochwy prowadzące do odpowiedzi zapalnej17, w wyniku której w rozmazach pojawiają się leukocyty i inne typy komórek, co może utrudnić ocenę cytologiczną. Ponadto, nawet u samic utrzymywanych w koloniach, normalne jest występowanie przedłużonych faz diestrus i estrus u różnych myszy, a także indukcja anestrusu18; identyfikacja ta jest przydatna w interpretacji wpływu hormonalnego w badaniach nad rozrodczością, płcią i chorobami. Zmienność długości cyklu pojawia się również wraz z wiekiem oraz wynika z różnic w warunkach utrzymywania samic w koloniach (zakwaterowanie indywidualne lub grupowe)7,19-21. Samice utrzymywane w koloniach składających się wyłącznie z samic mogą przestać cyklować i wejść w stan przedłużonego diestrusu18,22,23, choć cykliczność można przywrócić poprzez ekspozycję na klatki uprzednio potraktowane moczem samców w celu wywołania cyklu24,25. Zatem, aby ustalić indywidualną długość cyklu dla danej myszy, zaleca się, aby opisane tutaj nieinwazyjne oceny były wykonywane codziennie i z należytą starannością, aż do zaobserwowania dwóch pełnych cykli.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie oraz Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Marcowi Leonardowi z Carleton Immersive Media Studio za fachową pomoc techniczną w produkcji i montażu wideo oraz dr. Martinowi Bertrandowi z Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratory za pomoc w opracowaniu modeli wizualnych. Autorzy z wdzięcznością dziękują za eksperckie porady dr Marilyn Keaney oraz całemu jej oddanemu personelowi w University of Ottawa Animal Care and Veterinary Services. Praca ta została sfinansowana przez Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) dla SALB, CIHR Institute of Aging and Strategic Training Initiative in Health Research/CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96121) dla SALB i SF, Canadian Foundation for Innovation dla SF, Ontario Innovation Trust dla SF oraz Autodesk Research dla SF. ACM otrzymał stypendium doktoranckie CIHR Banting and Best. NV otrzymał stypendium podoktorskie z Institute of Aging oraz CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylne końcówki do pipet 200 μl | Diamed | E340901 | |
| Gruszka lateksowa (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Szklane szkiełka przedmiotowe | Fisher | 12-550-15 | |
| Barwnik fiolet kryształowy (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Ręczniki przemysłowe lekkie | VWR | 82003-820 | |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | |
| Szkiełka nakrywki do mikroskopu (22x30) | Fisher | 12-544A |
Bibliografia
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922(2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
Przedruki i uprawnienia
