Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych gatunków
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powierzchnie śluzówkowe, w tym w przewodach pokarmowym, moczowo-płciowym i oddechowym, stanowią wrota wejścia dla patogenów, takich jak wirusy i bakterie 1. Błonony śluzowe są również miejscami indukcji odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko patogenom, czego przykładem są kępki Peyera w przewodzie pokarmowym oraz tkanka limfatyczna związana z jamą nosową w przewodzie oddechowym. Ta unikalna cecha sprawia, że odporność śluzówkowa odgrywa kluczową rolę w systemie obronnym organizmu. Wiele badań koncentrowało się na obszarach śluzówkowych przewodu pokarmowego i oddechowego. Jednakże miejsca śluzówkowe układu rozrodczego były badane w niewielkim stopniu. Śluzówka dróg rodnych jest głównym miejscem zakażenia w przypadku chorób przenoszonych drogą płciową (STD), w tym infekcji bakteryjnych i wirusowych. Choroby przenoszone drogą płciową stanowią jedno z najpoważniejszych wyzwań zdrowotnych współczesnego świata. Według szacunków Centers for Disease Control and Prevention w Stanach Zjednoczonych każdego roku dochodzi do 19 milionów nowych zakażeń. Choroby przenoszone drogą płciową kosztują amerykański system opieki zdrowotnej 17 miliardów dolarów rocznie 2, a dla poszczególnych osób generują jeszcze wyższe koszty w postaci bezpośrednich i dożywotnich następstw zdrowotnych. Aby stawić czoła temu wyzwaniu, konieczne jest lepsze zrozumienie odporności śluzówkowej układu rozrodczego, a izolacja limfocytów jest niezbędnym elementem tych badań. W niniejszym materiale przedstawiamy metodę powtarzalnej izolacji limfocytów z żeńskich dróg rodnych myszy do badań immunologicznych, która może zostać zmodyfikowana i dostosowana do innych gatunków. Opisana poniżej metoda została opracowana dla jednej myszy.
Protokół
1. Usunięcie dróg rodnych
- Uśmiercić mysz zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi. Wykonać niskie nacięcie w linii środkowej i odsunąć skórę.
- Wyizolować i usunąć cały układ rozrodczy, od jajowodów do ujścia pochwy.
- Rozciąć cały układ wzdłuż za pomocą nożyczek.
- Rozciąć układ rozrodczy precyzyjnymi nożyczkami chirurgicznymi na drobne kawałki (około <1 mm) w szalce Petriego z Complete RPMI-10/EDTA (patrz poniższa receptura) i mieszać tkankę w kolbie o pojemności 125 ml w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym przez 15 min. Procedurę tę powtarzać dwukrotnie, a następnie odrzucić supernatant zawierający nabłonek i pozostałe zanieczyszczenia.
- Przełożyć zawartość kolby przez sitko komórkowe (40 μm). Wypłukać pozostałości EDTA kompletny medium.
Complete RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 1M HEPES.
Complete RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (jak powyżej) z 5 μM EDTA
2. Trawienie tkanek dróg rodnych
- Przenieść fragmenty tkanki do nowej kolby z 20 ml świeżego medium RPMI-10/kolagenaza (patrz przepis poniżej) i trawić tkankę w temperaturze 37 °C przez 1 hr na mieszadle magnetycznym ustawionym na intensywne mieszanie tkanki.
Pełne medium RPMI-10/kolagenaza: Bezpośrednio przed użyciem zrekonstytuować kolagenazę typu VIII (Sigma; przechowywać w -20 °C lub zgodnie z instrukcją producenta), a następnie dodać do pełnego medium RPMI/10 do końcowego stężenia 450-500U/ml. - Po pierwszej trawieniu zebrać nadsączniki przez sitko komórkowe 100 μm; komórki przechowywać w lodzie.
- Przenieść nietrawioną tkankę do nowej kolby i powtórzyć krok 2.1 jeszcze dwa razy, używając świeżego pełnego medium RPMI-10/kolagenaza, tak aby łącznie przeprowadzić 3 oddzielne trawienia. Na tym etapie w roztworze nie powinny znajdować się widoczne fragmenty tkanki.
- Połączyć wszystkie nadsączniki z jednej próbki i zebrać je przez sitko komórkowe 100 μm. Odwirować komórki. Osady komórkowe zostaną rozdzielone przy użyciu gradientów Percoll.
3. Separowanie komórek dróg rodnych przy użyciu gradientów Percoll
- Przed użyciem przygotować poszczególne stężenia Percollu:
- izotoniczny Percoll 100%: zmieszać stokowy Percoll (Pharmacia Biotech) z 10x PBS w stosunku 9:1. Dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl.
- roztwór Percollu 40%: zmieszać 40 ml izotonicznego Percollu 100% i 60 ml kompletnego medium RPMI.
- roztwór Percollu 70%: zmieszać 70 ml izotonicznego Percollu 100% z 30 ml kompletnego medium RPMI.
- Każdy pellet komórkowy z kroku 6 resuspender w 40% roztworze Percollu. Do przygotowania gradientów należy użyć równą objętość 70% Percollu. Istnieją dwa sposoby przygotowania probówek z gradientem:
- Warstwa dolna: najpierw dodać do probówki z gradientem zawiesinę komórkową w 40% Percollu, a następnie ostrożnie nałożyć pod spód 70% Percoll.
- Warstwa górna: najpierw dodać do probówki 70% Percoll, a następnie ostrożnie i powoli nałożyć na wierzch 40% Percoll zawierający komórki.
- Próbki z gradientem należy wirować przy 900 x g w temperaturze pokojowej przez 20 min z wyłączonym hamulcem.
- Limfocyty znajdą się w warstwie przejściowej między warstwami 40% a 70% Percollu. Ostrożnie zebrać warstwę przejściową, przemyć medium RPMI w stosunku 1:3 i odwirować przy 740 x g. Limfocyty znajdą się w pelletcie komórkowym i będą gotowe do dalszego użycia.
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy oraz analizy cytometrii przepływowej (FACS) przedstawiono na Rysunku 1. Drogi rodne usunięto myszy zakażonej wewnątrzpochwowo Chlamydia muridarum 7 dni po zakażeniu. Dwie próbki dróg rodnych połączono, aby uzyskać odpowiednią liczbę limfocytów do badań funkcjonalnych i fenotypowych za pomocą FACS. Wypreparowane tkanki poddano etapom trawienia i izolacji opisanym powyżej. Zawiesinę pojedynczych komórek barwiono różnymi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromami przeciwko mysim CD3, CD4 i CD8. Rysunek 1 przedstawia wykres punktowy (dot-plot) komórek T CD4-dodatnich w stosunku do komórek T CD8-dodatnich, z bramkowaniem na limfocyty T CD3-dodatnie. Nasza procedura umożliwia badanie limfocytów izolowanych z dróg rodnych w różnych modelach chorób w celu oceny różnorodnych charakterystyk funkcjonalnych i fenotypowych komórek odpornościowych w różnych schorzeniach w modelu mysim. Obejmuje to różnorodne komórki odpornościowe, takie jak komórki dendrytyczne, neutrofile, makrofagi, komórki NK, NKT, limfocyty T (limfocyty T swoiste dla antygenu), limfocyty B itp.3-10.
Rysunek 1. Limfocyty wyizolowano z dróg rodnych myszy zainfekowanych Chlamydia muridarum przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Po zakończeniu procedury separacji limfocyty barwiono przeciwciałami CD3, CD4 i CD8 sprzężonymi z fluorochromami. Dane z kwadrantów wyznaczono dla limfocytów CD3+, przedstawiając zależność CD4+ względem CD8+ wraz z procentową zawartością komórek w bramce.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym protokole pokazano, jak przygotować limfocyty z dróg rodnych myszy; metoda ta jest łatwa do opanowania. Najbardziej krytycznym punktem tego procesu jest zachowanie żywotności komórek poprzez utrzymywanie ich w lodzie. Wydajność komórkowa w tej metodzie zależy od techniki, umiejętności manipulacji, stanu zakażenia myszy (naiwna lub dzień po zakażeniu), patogenu (bakteryjny, wirusowy, grzybiczy) oraz badanego odcinka układu rozrodczego myszy (przewód jajowodowy, macica, odcinek pochwy lub cały układ rodny). Na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować NIH za przyznanie grantów R01-AI026328 (KAK) oraz R01-AI079004 (KAK).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kollagenaza | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
Bibliografia
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
