Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

1. Usunięcie dróg rodnych

1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi. Wykonaj niskie nacięcie w linii środkowej i cofnij skórę.
2. Wyizoluj i usuń całe drogi rodne, od jajowodu do ujścia pochwy.
3. Otwórz cały przewód wzdłużnie nożyczkami.
4. Pociąć drogi rodne cienkimi nożyczkami chirurgicznymi na drobne kawałki (około <1 mm) na szalce Petriego z Complete RPMI-10/EDTA (patrz wzór poniżej) i mieszać tkankę w kolbie o pojemności 125 ml w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym ustawionym przez 15 minut. Procedurę tę powtarza się dwukrotnie, a następnie supernatant, który zawiera nabłonek i inne zanieczyszczenia, jest odrzucany.
5. Zawartość kolby przelać przez sitko do komórek (40 μm). Zmyj pozostałości EDTA kompletnym podłożem.
   Complete RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 1M HEPES.
   Pełne RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (jak wyżej) z 5 μM EDTA

2. Trawienie tkanek dróg rodnych

1. Przenieść kawałki tkanek do nowej kolby z 20 ml świeżego RPMI-10/kolagenazy (patrz przepis poniżej) i trawić tkankę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na mieszadle magnetycznym ustawionym do energicznego mieszania tkanki.
   Complete RPMI-10/collagenase: Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić kolagenazę typu VIII (Sigma; przechowywać w temperaturze -20 °C lub zgodnie z instrukcjami producenta.), dodać do pełnego RPMI/10 do końcowego stężenia 450-500U/ml.
2. Po pierwszym roztwarzaniu zebrać supernatanty przez sitko komórkowe o wielkości 100 μm, utrzymać komórki na lodzie.
3. Przenieś niestrawioną tkankę do nowej kolby i powtórz krok 2.1 jeszcze dwa razy, używając świeżego, kompletnego RPMI-10/kolagenazy, co daje w sumie 3 oddzielne trawienia. W tym momencie w roztworze nie powinny znajdować się żadne widoczne kawałki tkanki.
4. Zebrać wszystkie supernatanty z próbki i pobrać przez sitko o wielkości 100 μm. Zakręć komórkami w dół. Granulki komórek zostaną oddzielone za pomocą gradientów Percoll.

3. Oddzielanie komórek dróg rodnych za pomocą gradientów Percoll

1. Przygotuj każde stężenie Percollu przed użyciem:
   • 100% izotoniczny Percoll: wymieszaj 9:1 zapas Percoll (Pharmacia Biotech) vs. 10x PBS. pH do 7,4 za pomocą HCl.
   • 40% roztwór Percoll: wymieszaj 40 ml 100% izotonicznego Percollu i 60 ml pełnego RPMI.
   • 70% roztwór Percollu: wymieszaj 70 ml 100% izotonicznego Percollu z 30 ml kompletnego RPMI.
2. Ponownie zawiesić każdą komórkę z kroku 6 w 40% roztworach Percoll. Do wykonania gradientów zostanie użyta równa objętość 70% Percollu. Rurki gradientowe można skonfigurować na dwa sposoby:
   1. Warstwa spodnia: najpierw dodaj zawiesinę komórek z 40% Percoll do rurki gradientowej, a następnie ostrożnie podwarstwij 70% Percoll.
   2. Warstwa: najpierw dodaj 70% Percoll do tuby, a następnie ostrożnie i powoli załaduj 40% Percoll zawierający komórki na górze.
3. Próbki gradientowe odwirowuje się w temperaturze pokojowej 900 x g przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu.
4. Limfocyty będą znajdować się w warstwie granicy między 40% a 70% warstwami Percollu. Ostrożnie zbierz warstwę interfejsu, umyj RPMI 1:3 i odwiruj przy 740 x g. Limfocyty znajdą się w osadzie komórkowej i są gotowe do dalszego użycia.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład izolacji limfocytów z mysich dróg rodnych i analizy cytometrii przepływowej (FACS) pokazano na rysunku 1. Drogi rodne zostały usunięte z Chlamydia muridarum dopochwowo zakażonej myszy 7 dni po zakażeniu. Dwa drogi rodne zostały połączone razem, aby mieć wystarczającą ilość limfocytów do badania funkcjonalnego i fenotypowego za pomocą FACS. Wypreparowane tkanki poddano procesowi trawienia i izolacji, jak opisano powyżej. Zawiesinę pojedynczej komórki wybarwiono pod kątem różnych sprzężonych z fluorochromem przeciwciał monoklonalnych przeciwko mysim CD3, CD4 i CD8. Rycina 1 przedstawia prezentację na wykresie kropkowym limfocytów T CD4-dodatnich w porównaniu z limfocytami T CD8-dodatnimi bramkowanymi limfocytami T CD3-dodatnimi. Nasza procedura może badać limfocyty wyizolowane z dróg rodnych różnych modeli chorobowych w celu oceny różnych cech funkcjonalnych i fenotypowych komórek odpornościowych w różnych chorobach w modelu mysim. Należą do nich różne komórki odpornościowe, takie jak komórki dendrytyczne, neutrofile, makrofagi NK, NKT, limfocyty T (limfocyty T specyficzne dla Ag), limfocyty B ^itp.3-10.

Rysunek 1. Limfocyty wyizolowano z dróg rodnych myszy zakażonych Chlamydia muridarum, stosując przedstawioną tu metodę. Po pełnej procedurze separacji limfocyty wybarwiono sprzężonymi z fluorochromem CD3, CD4 i CD8. Dane kwadrantowe były bramkowane na limfocytach CD3 +, pokazując CD4 + w porównaniu z CD8 + z i procentem bramkowanych komórek.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.