Artykuł metodologiczny

Analiza i budowa struktur kwasów nukleinowych za pomocą 3DNA

DOI:

10.3791/4401

⸱

26 kwietnia 2013

 ,  , 
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pakiet oprogramowania 3DNA to popularne i wszechstronne narzędzie bioinformatyczne z możliwością analizy, konstruowania i wizualizacji trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły dla podzbioru nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, mających zastosowanie zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów powiązanych struktur.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pakiet oprogramowania 3DNA to popularne i wszechstronne narzędzie bioinformatyczne z możliwością analizy, konstruowania i wizualizacji trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły dla podzbioru nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, mających zastosowanie zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów powiązanych struktur. Protokół 1 zawiera zestaw instrukcji potrzebnych do pobrania i zainstalowania oprogramowania. Następnie, w Protokole 2, następuje analiza struktury kwasu nukleinowego, w tym przypisanie par zasad i wyznaczenie parametrów ciała sztywnego, które opisują strukturę, a w Protokole 3 opis rekonstrukcji modelu atomowego struktury na podstawie jej parametrów ciała sztywnego. Najnowsza wersja 3DNA, wersja 2.1, ma nowe funkcje do analizy i manipulacji zespołami struktur, takimi jak te wydedukowane z pomiarów magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i symulacji dynamiki molekularnej (MD); cechy te zostały przedstawione w protokołach 4 i 5. Oprócz samodzielnego pakietu oprogramowania 3DNA, serwer WWW w3DNA, znajdujący się pod adresem http://w3dna.rutgers.edu, zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs do wybranych funkcji oprogramowania. Protokół 6 demonstruje nowatorską funkcję tego miejsca do budowy modeli długich cząsteczek DNA ozdobionych związanymi białkami w określonych przez użytkownika lokalizacjach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie trójwymiarowych struktur DNA, RNA i ich kompleksów z białkami, lekami i innymi ligandami, jest kluczowe dla rozszyfrowania ich różnorodnych funkcji biologicznych i umożliwienia racjonalnego projektowania terapii. Eksploracja takich struktur obejmuje trzy oddzielne, ale ściśle powiązane ze sobą komponenty: analizę (w celu wyodrębnienia wzorców w kształtach i interakcjach), modelowanie (w celu oceny energetyki i dynamiki molekularnej) oraz wizualizację. Analiza statyczno-wytrzymałościowa i budowanie modeli to w zasadzie dwie strony tego samego medalu, a wizualizacja uzupełnia obie te dziedziny.

Pakiet programów komputerowych 3DNA to coraz bardziej popularny zestaw narzędzi do bioinformatyki strukturalnej z możliwością analizy, konstruowania i wizualizacji trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. We wcześniejszych publikacjach przedstawiono możliwości oprogramowania1, podano przepisy na wykonanie wybranych zadań2 , przedstawiono interfejs internetowy do popularnych funkcji oprogramowania3 , zaprezentowano bazy danych cech strukturalnych zebranych za pomocą 3DNA4, 5 oraz zilustrowano użyteczność oprogramowania w analizie zarówno struktur DNA, jak i RNA6, 7.

Celem tego artykułu jest dostarczenie zestawu oprogramowania 3DNA naukowcom laboratoryjnym i innym zainteresowanym i/lub potrzebującym do zbadania organizacji przestrzennej DNA i RNA za pomocą najnowocześniejszych narzędzi obliczeniowych. Przedstawione tutaj protokoły zawierają instrukcje krok po kroku (i) dotyczące pobierania i instalowania oprogramowania w systemie Mac OS X, (ii-iii) analizowania i modyfikowania struktur DNA na poziomie kroków składowych par zasad, (iv-v) analizowania i dopasowywania zestawów powiązanych struktur DNA oraz (vi) konstruowania modeli łańcuchów DNA ozdobionych białkami za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu internetowego w3DNA. Oprogramowanie posiada możliwość analizy pojedynczych struktur rozwiązanych metodami krystalografii rentgenowskiej, a także dużych zespołów struktur wyznaczonych metodami magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub wygenerowanych technikami symulacji komputerowej.

Badane tutaj struktury obejmują (i) strukturę krystaliczną DNA o wysokiej rozdzielczości związaną z białkiem Hbb z Borrelia burgdorferi8 (bakteria przenoszona przez kleszcze, która powoduje boreliozę u ludzi9, 10), (ii) dwa duże zestawy sekwencyjnie powiązanych cząsteczek DNA wytworzonych za pomocą symulacji molekularnych11 - 4,500 migawek d(GGCAAAATTGCC)2 i d(CCGTTTTAAACGG)2 zebrane w odstępach co 100 psec podczas obliczeń oraz (iii) niewielki zestaw struktur opartych na NMR operatora DNA O3 związanych z głowicami białka represorowego Escherichia coli Lac12. Poniższe instrukcje zawierają informacje o tym, jak uzyskać dostęp do plików współrzędnych atomowych związanych z każdą z tych struktur, a także jak używać 3DNA (kopia tego pliku znajduje się na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove) do badania i modyfikowania tych struktur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instalacja pakietu oprogramowania

  1. Połącz się ze stroną internetową 3DNA pod adresem http://x3dna.org i kliknij link do forum 3DNA. Na forum wybierz link "zarejestruj się" i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowe konto.
  2. Poniższe instrukcje zawierają szczegółowe informacje na temat instalacji oprogramowania na komputerze Macintosh z systemem OS X z domyślną powłoką "bash". Procedura dla systemów Linux lub Windows (Cygwin, MinGW/MSYS) z powszechnie używanymi powłokami (w tym 'tcsh') znajduje się na forum 3DNA.
  3. Po ustaleniu nazwy użytkownika i hasła zaloguj się na forum. Wybierz link "Pliki do pobrania" w sekcji Witamy i na nowej stronie wybierz "Pobierz 3DNA". Spowoduje to przejście do strony pobierania 3DNA, z której można pobrać różne wersje oprogramowania.
  4. Wybierz łącze Intel w systemie Mac OS X, aby pobrać skompresowany plik archiwum tar (tar.gz) zawierający oprogramowanie.
  5. Kliknij dwukrotnie plik (tar.gz), aby utworzyć folder o nazwie x3dna-v2.1. Ten folder, który zawiera pakiet oprogramowania 3DNA, można przenieść w dowolne miejsce. Na potrzeby tego przepisu przeciągamy go i upuszczamy do katalogu "Aplikacje". Na tym etapie skończysz z plikiem tar.gz i możesz go usunąć.
  6. Otwórz aplikację Terminal, zwykle znajdującą się w sekcji "Narzędzia", i przejdź do katalogu x3dna-v2.1 utworzonego w kroku 5 za pomocą następującego polecenia (zakończonego tutaj i we wszystkich poniższych instrukcjach powrotem karetki):
    cd /Aplikacje/x3dna-v2.1
  7. Uruchom skrypt instalacyjny potrzebny do poprawnego działania 3DNA, wpisując:
    ./pojemnik/x3dna_setup
  8. Skopiuj ustawienia eksportu dwuwierszowego wydrukowane w kroku 7. Jeśli użytkownik umieścił oprogramowanie w katalogu "Aplikacje", dwa wiersze powinny wyglądać następująco:
    export X3DNA=/Aplikacje/x3dna-v2.1
    export PATH=/Aplikacje/x3dna-v2.1/bin:$PATH
    W poleceniu eksportu pojawi się inne słowo oprócz "Aplikacje", jeśli użytkownik zdecydował się zainstalować oprogramowanie w innym katalogu. Ta alternatywna nazwa katalogu zastąpi "Aplikacje" w powyższych dwóch poleceniach. Proszę zauważyć, że jeśli domyślną powłoką jest 'tcsh' zamiast 'bash', zawartość dwóch linii będzie następująca: setenv X3DNA /Applications/x3dna-v2.1 i setenv PATH /Applications/x3dna-v2.1/bin:$PATH.
  9. Sprawdź w "Finderze", czy plik o nazwie ".bashrc" już istnieje na twoim komputerze.
  10. Otwórz aplikację TextEdit znajdującą się w katalogu "Aplikacje" i wybierz "Utwórz zwykły tekst" w menu "Format".
  11. Jeśli plik '.bashrc' z kroku 9 istnieje, otwórz plik w TextEdit i wklej ustawienia eksportu z kroku 8 na koniec pliku. Jeśli żaden plik '.bashrc' nie zostanie zamknięty, wklej ustawienia eksportu z kroku 8 do pustego pliku i zapisz pod nazwą pliku ".bashrc" w swoim katalogu domowym. (Katalog domowy jest oznaczony ikoną "domu" na komputerze Macintosh).
  12. Aby nowe ustawienia były dostępne, musisz uruchomić nowo zapisany plik ".bashrc" za pomocą następującego polecenia w programie Terminal:
    źródło ~/.bashrc
  13. Pakiet 3DNA jest teraz zainstalowany w twoim systemie i możesz wykonywać protokoły 2-5 w programie terminalowym. Protokół 6 jest realizowany przy użyciu w3DNA, interfejsu internetowego do wybranych funkcji oprogramowania 3DNA.

2. Analiza struktury krystalicznej

  1. Ilustrujemy analizę struktury kwasu nukleinowego za pomocą DNA związanego z białkiem Hbb z Borrelia burgdorferi8. Plik współrzędnych atomowych związanych z tą strukturą można znaleźć w Protein Data Bank13 (PDB; http://www.rcsb.org), gdzie jest mu przypisany identyfikator strukturalny 2np2. Załączone Dane Uzupełniające zawierają kopię tego pliku, którą można również znaleźć na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Pierwszym krokiem w analizie struktury 3DNA jest utworzenie pliku, który zawiera listę wszystkich sparowanych zasad. Odbywa się to za pomocą programu 'find_pair', wpisując następujące polecenie:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Tutaj 2np2.pdb jest plikiem wejściowym o współrzędnych atomowych opisanych powyżej, a 2np2.bps jest wyjściowym plikiem tekstowym, który zawiera informacje o parowaniu zasad. Ten ostatni plik pary zasad może być w razie potrzeby sprawdzony i edytowany przez użytkownika.
  3. Kolejnym krokiem w analizie jest określenie parametrów geometrycznych, które charakteryzują konstrukcję. Należą do nich standardowe chemiczne kąty skręcania14, kąty pseudorotacji, które opisują marszczenie się pierścienia cukrowego15, parametry ciała sztywnego, które określają układy zasad i kolejnych par zasad16 oraz inne miary trójwymiarowej struktury chemicznej. Polecenie "analizuj" przyjmuje jako dane wejściowe plik pary podstawowej wygenerowany w kroku 2 i tworzy kilka plików wyjściowych, które pojawiają się w bieżącym katalogu roboczym. Wartości te są obliczane przez wpisanie następującego polecenia:
    Analiza 2NP2.bps
    Używane tutaj pliki wyjściowe to 2np2.out, który zawiera przegląd obliczonych parametrów, oraz bp_step.par, który zawiera listę parametrów ciała sztywnego opisanych powyżej. Ten ostatni plik można łatwo wczytać do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i wykreślenia. Przykład można znaleźć w reprezentatywnych wynikach (rysunek 1).

3. Budowa struktury DNA na podstawie parametrów ciała sztywnego

  1. Oprócz analizy struktury kwasu nukleinowego, oprogramowanie 3DNA zapewnia możliwość zbudowania modelu strukturalnego na podstawie parametrów ciała sztywnego za pomocą polecenia "odbuduj". W tym Protokole pokazujemy, jak skonstruować dwa spiralne modele DNA, najpierw przy użyciu parametrów ciała sztywnego z kompleksu Hbb-DNA obliczonych w Protokole 2, a następnie przy użyciu zmodyfikowanego zestawu parametrów, w których zmieniane są wybrane kąty przechyłu. Kąt przechyłu mierzy stopień wygięcia kolejnych par zasad w rowkach DNA16. Wartości dodatnie rolki są związane ze zwężeniem głównego rowka, a wartości ujemne ze zwężeniem mniejszego rowka. Standardowy układ odniesienia17 przyjęty przez 3DNA i inne popularne programy do analizy kwasów nukleinowych, np. Curves+18, zapewnia spójność numeryczną w obliczanych parametrach par zasad Watsona-Cricka.
  2. Domyślnie funkcja "odbudowy" 3DNA utworzy dokładne modele atomowe, które zawierają tylko współrzędne atomów w zasadach azotowych. Aby utworzyć przybliżony model atomowy, który zawiera współrzędne zarówno z atomów szkieletu, jak i podstawy, wpisz następujące polecenie:
    x3dna_utils cp_std bdna
    To polecenie instruuje 3DNA, aby wprowadziło standardową konformację szkieletu B-DNA w konstrukcji modeli na podstawie parametrów ciała sztywnego.
  3. Aby zbudować model podwójnej helisy z parametrami ciała sztywnego znajdującymi się w strukturze Hbb-DNA, należy wpisać:
    rebuild -atomic bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Tutaj '-atomic' określa konstrukcję modelu wieloatomowego ze współrzędnymi atomowymi dla wszystkich ciężkich (niewodorowych) atomów, 'bp_step.par' to plik wygenerowany w kroku 3 protokołu 2, który zawiera wprowadzone parametry ciała sztywnego, a '2np2_rbld_org.pdb' to plik wyjściowy ze współrzędnymi atomowymi utworzonej struktury. Ten ostatni plik jest sformatowany zgodnie ze specyfikacją PDB i w związku z tym kończy się na ".pdb".
  4. Plik 'bp_step.par' może być edytowany w celu wygenerowania zmodyfikowanej struktury. Na komputerach Macintosh zmiany można wprowadzić za pomocą aplikacji TextEdit zgodnie z opisem w Protokół 1 Krok 10.
  5. W tym miejscu modyfikujemy ekstremalne kąty przechyłu utworzone w dwóch miejscach największego zgięcia. Wartości, które są wyrażone w stopniach, są zamieniane na zero z wartości 64,95 w wierszu 17 i 60,93 w wierszu 26. Zapisujemy zmodyfikowany plik pod nową nazwą "bp_step_roll0.par" i zamykamy program TextEdit.
  6. Budujemy strukturę, tak jak w kroku 3, ze zmodyfikowanym zestawem parametrów kroku jako plikiem wejściowym, wpisując:
    rebuild -atomic bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Oba modele można wyświetlić w standardowej przeglądarce molekularnej, takiej jak PyMOL (www.pymol.org), używając wygenerowanych plików współrzędnych (.pdb) jako danych wejściowych. Zobacz reprezentatywne wyniki (rysunek 2), aby zobaczyć zdjęcia odbudowanych konstrukcji.

4. Analiza plików struktur wielomodelowych

  1. W przeciwieństwie do Protokołu 2, w którym analizujemy pojedynczą strukturę zawierającą kwas nukleinowy, tutaj pokazujemy, jak analizować duży zespół struktur. Badamy zmienność w czasie parametrów ciała sztywnego wzdłuż serii 14 łańcuchów DNA par zasad uzyskanych z symulacji dynamiki molekularnej (MD)11. Analiza uwzględnia 4 500 konstrukcji, które są rozmieszczone w obliczeniach MD z dokładnością do 100 psec i zapisywane w 4 500 oddzielnych plikach. Towarzyszące dane uzupełniające zawierają kopie tych plików, jak również zestaw 4500 innych plików do symulacji DNA z odwrotną sekwencją (zobacz tekst wprowadzający w celu uzyskania dokładnej kolejności zasad). Dwa zestawy plików i mniejszy podzbiór danych można również znaleźć na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Pierwszy krok w analizie jest taki sam, jak ten wykonywany w Protokole 2, identyfikacja sparowanych zasad poprzez uruchomienie programu "find_pair". Ponieważ cały zestaw struktur korzysta z tego samego schematu parowania podstaw, wystarczy uruchomić 'find_pair' tylko raz na reprezentatywnym pliku. Tutaj wybieramy 1001. strukturę w symulacji łańcuchów DNA zawierających centralny krok AT, o nazwie pliku md_AT_set1.pdb.1001. Poniższa instrukcja generuje informacje o parowaniu zasad i zapisuje je w pliku md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    Użytkownik może zapoznać się ze zidentyfikowanym parowaniem bazowym i dokonać ręcznych zmian w pliku w oparciu o znajomość struktury.
  3. Kolejnym krokiem jest wyznaczenie parametrów geometrycznych całego zestawu konstrukcji za pomocą polecenia 'x3dna_ensemble analizuj'. Program wykorzystuje jako dane wejściowe plik par podstawowych wygenerowany w kroku 2 (md_AT_set1.bps), a także plik zawierający listę struktur do analizy. Ten ostatni plik, nazwany tutaj md_AT_set1.list, zawiera 4500 plików do analizy, z nazwami plików wprowadzonymi w poszczególnych wierszach w kolejności wygenerowanej przez symulację MD. Kopia tego pliku jest dołączona do Materiałów Uzupełniających i jest również oferowana na Forum 3DNA. Ze względu na dużą liczbę plików należy ostrzec użytkownika, że czas obliczeń może być długi (~20 minut na 1000 plików na procesorze AMD Phenom II X4 965). Polecenie jest uruchamiane przez wpisanie następującego polecenia:
    x3dna_ensemble analizować -b md_AT_set1.bps -l md_AT_set1.list -o md_AT_set1.out
    W powyższym przykładzie '-b' odnosi się do pliku z parą zasad utworzonego w kroku 2, '-l' określa, że podana jest lista plików, a '-o' pozwala użytkownikowi na przypisanie nazwy plikowi wyjściowemu. Istnieje wiele opcji, których można użyć w połączeniu z poleceniem "x3dna_ensemble analizuj", takich jak wybór określonych modeli. Użytkownik może wpisać "x3dna_ensemble analyze -h", aby uzyskać więcej informacji na temat tych opcji.
  4. Następnym krokiem jest wyodrębnienie żądanych parametrów korpusu sztywnego z pliku wyjściowego przeglądu, md_AT_set1.out, wygenerowanego w kroku 3. Odbywa się to za pomocą polecenia 'x3dna_ensemble extract'. Listę dostępnych parametrów geometrycznych można znaleźć, wpisując 'x3dna_ensemble extract -l'. Tutaj wyodrębniamy kąty przechyłu i tworzymy plik tekstowy oddzielony przecinkami (CSV) kątów przechyłu za pomocą następującego polecenia:
    x3dna_ensemble extract -p roll -s , -f md_AT_set1.out -o md_AT_set1_roll.csv
    Opcja "-p roll" w tym poleceniu określa parametr, który ma zostać wyodrębniony, "-s" oznacza plik oddzielony przecinkami, "-f" oznacza plik wyjściowy uzyskany z polecenia analizy zespołowej, a "-o" pozwala użytkownikowi nazwać plik wyjściowy CSV kątów przechyłu wzdłuż DNA we wszystkich analizowanych strukturach. Plik ten można wczytać do innych programów w celu dalszej analizy i wykreślenia. Zobacz reprezentatywne wyniki (Rysunek 3) w celu analizy zmienności rolki w dwóch zestawach danych wygenerowanych przez MD opisanych powyżej oraz Forum 3DNA dla skryptu MATLAB użytego do wygenerowania tych obrazów.

5. Superpozycja struktur wielomodelowych na wspólny układ odniesienia

  1. Najnowsza wersja 3DNA (wersja 2.1) ma nową funkcję, która pozwala użytkownikowi spojrzeć na wiele struktur ze wspólnej perspektywy. Polecenie "x3dna_ensemble reorientacji" nakłada zbiór powiązanych struktur na wspólny krok pary podstaw lub pary podstaw. Poniższy protokół stosuje tę zdolność do struktur pochodzących z NMR operatora DNA O3 związanych z częściami głowy białka represorowegoLac 12. Struktury te są przechowywane w PDB pod identyfikatorem 2kek w wielomodelowym pliku strukturalnym, który zawiera wszystkie modele konstrukcji w jednym pliku, w przeciwieństwie do oddzielnych plików, takich jak te używane dla każdego z 4500 modeli w Protokole 4. Załączone Dane Uzupełniające zawierają kopię tego pliku, którą można również znaleźć na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Podobnie jak w poprzednich protokołach, pierwszym krokiem jest obliczenie parowania zasad DNA za pomocą programu "find_pair". W tym przypadku używamy jako danych wejściowych pliku "2kek.pdb" i wpisujemy:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    Parowanie podstawowe jest generowane przy użyciu pierwszego modelu w pliku pdb. Ręczne poprawki do wyjściowego pliku par podstawowych, '2kek.bps', mogą być dokonywane w oparciu o znajomość struktury.
  3. Program "x3dna_ensemble reorientacji" wyrówna poszczególne modele w strukturę wielomodelową na wspólnym układzie odniesienia. Ten program wymaga zarówno pliku pdb, jak i pliku parowania podstawowego z poprzedniego kroku jako danych wejściowych i jest uruchamiany za pomocą następującego polecenia:
    x3dna_ensemble reorient -b 2kek.bps -f 1 -e 2kek.pdb -o 2kek_fr1.pdb
    Tutaj opcja '-b' określa plik parowania podstaw, '-f 1' oznacza parę zasad, na której wszystkie struktury są wyrównane, w tym przypadku para zasad 1 na końcu 5' pasma zawierającego sekwencję, opcja '-e' określa wejściowy plik zespołu, a '-o' pozwala użytkownikowi podać nazwę pliku wyjściowego, w tym przypadku '2kek_fr1.pdb'. Więcej informacji na temat opcji poleceń można uzyskać wpisując 'x3dna_ensemble reorient -h'. Zobacz Reprezentatywne wyniki (Rysunek 4), aby zapoznać się z omówieniem wyrównanych struktur.

6. Budowa cząsteczki DNA ozdobionej białkiem

  1. Interfejs sieciowy w3DNA zawiera kilka popularnych funkcji pakietu oprogramowania 3DNA. W tym miejscu zwracamy uwagę na możliwość konstruowania trójwymiarowych modeli DNA ozdobionego białkiem za pomocą serwera internetowego. Związane fragmenty DNA przyjmują parametry ciała sztywnego wybranych kompleksów białko-DNA, tutaj wartości DNA związanego z białkiem Hbb analizowane w Protokole 2. Niezwiązane regiony DNA mogą przyjąć jedną z trzech wybranych przez użytkownika spiralnych form (A, B lub C). A, B i C odnoszą się do trzech kanonicznych modeli DNA, uzyskanych z wczesnych eksperymentów dyfrakcji włókien, z odpowiednio 11, 10 i 9 parami zasad na obrót podwójnej helisy19-21.
  2. Pierwszym krokiem do zbudowania modelu DNA ozdobionego białkiem jest odwiedzenie strony internetowej w3DNA znajdującej się pod adresem http://w3dna.rutgers.edu. Wybranie opcji "Rekonstrukcja" z menu w lewym górnym rogu strony aktywuje możliwość budowania modeli online.
  3. Następnym krokiem jest wybranie linku "Matryca Bound Protein-DNA" znajdującego się w lekko zacienionym polu na środku nowej strony. Ten wybór aktywuje menu rozwijane, które pozwala użytkownikowi określić liczbę związanych białek. Tutaj wybieramy dwa związane białka i klikamy przycisk "Kontynuuj". Należy pamiętać, że modele są ograniczone pod względem wielkości do 1000 par zasad lub 2000 nukleotydów i trzydziestu związanych białek.
  4. Wybór liczby związanych białek prowadzi do strony specyfikacji podobnej do tej pokazanej na rysunku 5. Ta strona pozwala użytkownikowi określić sekwencję DNA, spiralną formę niezwiązanego DNA oraz tożsamość i lokalizację związanych białek.
  5. Użytkownik wpisuje lub wkleja żądaną sekwencję w polu tekstowym w środku strony specyfikacji (Rysunek 5, Etykieta 1). Uwaga: Dopuszczalne są tylko standardowe pozostałości - A, T, C, G i U. Tutaj wchodzimy do homopolimeru z 81 parami zasad, składającego się w całości z par A·T z A w splocie zawierającym sekwencję.
  6. Pod polem tekstowym znajduje się menu rozwijane (Rysunek 5, Etykieta 2), w którym można wybrać spiralną konformację niezwiązanych regionów DNA. W tym przykładzie wybieramy konformację w formie B.
  7. U dołu strony specyfikacji znajduje się pole tekstowe, w którym można wprowadzić pozycję (pozycje) wiązania i nazwę pliku (imiona) związanego białka (Figura 5, Etykieta 3). Pozycja wiązania określa położenie środka fragmentu związanego z białkiem w sekwencji DNA. Jeśli związany DNA zawiera nieparzystą liczbę par zasad, jak w strukturze Hbb-DNA, pozycja wiązania oznacza lokalizację środkowej pary zasad fragmentu. W przypadku DNA związanego z Hbb, ta środkowa para zasad jest nieparą T·T. W tym przykładzie, w którym wiążemy dwie kopie białka Hbb z matrycą DNA, para T·T jest umieszczana w pozycjach 20 i 63 sekwencji DNA z 81 parami zasad. Należy pamiętać, że sekwencja związanego fragmentu nie musi pokrywać się z sekwencją wprowadzoną w kroku 5. Jeśli region związany z białkiem zawiera parzystą liczbę par zasad, pozycja wiązania oznacza położenie środkowego kroku pary zasad w DNA. Oznacza to, że środkowy krok pary zasad związanego fragmentu jest umieszczany między parami zasad n i n +1, gdzie n jest określoną liczbą wzdłuż segmentu. Należy również pamiętać, że użytkownik może ozdobić DNA dowolnym białkiem, o ile struktura jego kompleksu z DNA jest znana i przechowywana w standardowym formacie PDB13.
  8. Na dole strony ze specyfikacją znajduje się pole, które pozwala użytkownikowi wygenerować podgląd DNA związanego z białkiem (Rysunek 5, Etykieta 4). Tutaj zaznaczamy to pole i klikamy przycisk "Kontynuuj". Ta akcja generuje stronę przeglądu z listą wybranych parametrów, a także wszelkich błędów, które mogły wynikać z nakładania się wybranych witryn powiązań. Użytkownik może wybrać przycisk "Wstecz", jeśli konieczne jest wprowadzenie jakichkolwiek zmian, lub przycisk "Buduj", aby kontynuować.
  9. Następna strona wyświetla statyczny obraz kompleksu DNA-białko w jego najbardziej rozbudowanym układzie i pozwala na interaktywną wizualizację on-line za pomocą Jmol i Webmol. Użytkownik może również pobrać plik współrzędnych (.pdb), który jest sformatowany zgodnie ze specyfikacją pliku PDB. W tym celu należy wybrać link "Pobierz odbudowany plik pdb" znajdujący się poniżej wygenerowanego obrazu. Ten ostatni plik można łatwo wczytać do programu do grafiki molekularnej w celu dalszej wizualizacji. Zobacz reprezentatywne wyniki (ryc. 6), aby zapoznać się z przykładami DNA ozdobionego Hbb opisanego powyżej i nieco dłuższego (86 par zasad) łańcucha z Hbb wyśrodkowanym w pozycjach 20 i 67.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia oprogramowania 3DNA są rutynowo używane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Na przykład tożsamość par zasad i parametry ciała sztywnego, które charakteryzują układy zasad w podwójnie helikalnych fragmentach struktur DNA i RNA, są automatycznie obliczane i przechowywane dla każdego nowego wpisu w Bazie Danych Kwasów Nukleinowych22, światowym repozytorium informacji strukturalnych kwasów nukleinowych. Wartości parametrów ciała sztywnego określone za pomocą Protokołu 2 łatwo ujawniają zniekształcen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zestaw protokołów przedstawiony w tym artykule dotyka jedynie możliwości pakietu programów 3DNA. Narzędzia te mogą być stosowane do struktur RNA w celu identyfikacji niekanonicznych par zasad, określenia drugorzędowych kontekstów strukturalnych, w których takie parowanie zachodzi, ilościowego określenia przestrzennego rozmieszczenia fragmentów spiralnych, pomiaru nakładania się zasad wzdłuż szkieletu łańcucha itp. Polecenie przebudowy pozwala użytkownikowi na konstruowanie prostych i pouczających reprezentacji blokowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Jiříemu Šponerowi za udostępnienie współrzędnych podwójnych helis DNA generowanych w symulacjach dynamiki molekularnej. Dziękujemy również Nada Spackova za pomoc w pobraniu tych struktur. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie tej pracy poprzez granty badawcze USPHS GM34809 i GM096889

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231(2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. , (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3DNA SoftwareNucleic Acid AnalysisBase Pair AssignmentRigid Body ParametersStructural ReconstructionEnsemble AnalysisNMR StructuresMD Simulationsw3DNA Web ServerProtein Decorated DNA

Powiązane artykuły