Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4401

⸱

26 kwietnia 2013

 ,  , 
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Streszczenie

Pakiet oprogramowania 3DNA to popularne i wszechstronne narzędzie bioinformatyczne umożliwiające analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które mają zastosowanie zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych. Protokół 1 zawiera zestaw instrukcji niezbędnych do pobrania i zainstalowania oprogramowania. Następnie w Protokole 2 opisano analizę struktury kwasu nukleinowego, w tym przypisywanie par zasad oraz wyznaczanie parametrów sztywnych ciał opisujących strukturę, a w Protokole 3 przedstawiono rekonstrukcję modelu atomowego struktury na podstawie jej parametrów sztywnych ciał. Najnowsza wersja 3DNA, wersja 2.1, posiada nowe funkcje służące do analizy i manipulacji zespołami struktur, takimi jak te uzyskane z pomiarów magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz symulacji dynamiki molekularnej (MD); funkcje te zostały zaprezentowane w Protokołach 4 i 5. Oprócz samodzielnego pakietu oprogramowania 3DNA, serwer WWW w3DNA, znajdujący się pod adresem http://w3dna.rutgers.edu, zapewnia przyjazny interfejs użytkownika do wybranych funkcji oprogramowania. Protokół 6 demonstruje nową funkcję strony służącą do budowania modeli długich cząsteczek DNA z białkami związanymi w określonych przez użytkownika miejscach.

Wprowadzenie

Zrozumienie trójwymiarowych struktur DNA, RNA oraz ich kompleksów z białkami, lekami i innymi ligandami jest kluczowe dla rozszyfrowania ich różnorodnych funkcji biologicznych oraz umożliwia racjonalne projektowanie terapeutyków. Badanie takich struktur obejmuje trzy odrębne, lecz ściśle powiązane ze sobą elementy: analizę (w celu wyodrębnienia wzorców w kształtach i oddziaływaniach), modelowanie (do oceny energetyki i dynamiki molekularnej) oraz wizualizację. Analiza strukturalna i budowanie modeli są w zasadzie dwiema stronami tej samej monety, a wizualizacja uzupełnia oba te procesy.

Zestaw programów komputerowych 3DNA to coraz popularniejszy zestaw narzędzi bioinformatyki strukturalnej, umożliwiający analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Wcześniejsze publikacje opisały możliwości oprogramowania1, przedstawiły procedury wykonywania wybranych zadań2, wprowadziły interfejs internetowy do popularnych funkcji oprogramowania3, zaprezentowały bazy danych cech strukturalnych zebranych przy użyciu 3DNA4, 5 oraz zilustrowały użyteczność oprogramowania w analizie struktur zarówno DNA, jak i RNA6, 7.

Celem niniejszego artykułu jest udostępnienie pakietu oprogramowania 3DNA naukowcom laboratoryjnym oraz innym osobom zainteresowanym i/lub potrzebującym badania organizacji przestrzennej DNA i RNA przy użyciu najnowocześniejszych narzędzi obliczeniowych. Przedstawione tutaj protokoły zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące: (i) pobierania i instalacji oprogramowania w systemie Mac OS X, (ii-iii) analizy i modyfikacji struktur DNA na poziomie poszczególnych stopni par zasad, (iv-v) analizy i wyrównywania zestawów powiązanych struktur DNA oraz (vi) konstruowania modeli łańcuchów DNA z przyłączonymi białkami za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu internetowego w3DNA. Oprogramowanie to umożliwia analizę pojedynczych struktur rozwiązanych metodami krystalografii rentgenowskiej, a także dużych zespołów struktur wyznaczonych metodami magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub generowanych za pomocą technik symulacji komputerowych.

Struktury analizowane w niniejszej pracy obejmują (i) krystaliczną strukturę o wysokiej rozdzielczości DNA związanego z białkiem Hbb z Borrelia burgdorferi8 (bakterii przenoszonej przez kleszcze, która wywołuje u ludzi boreliozę9, 10), (ii) dwa duże zestawy sekwencyjnie powiązanych cząsteczek DNA wytworzonych za pomocą symulacji molekularnych11 – 4500 migawek d(GGCAAAATTTTGCC)2 oraz d(CCGTTTTAAAACGG)2 zarejestrowanych w odstępach 100-psec podczas obliczeń, oraz (iii) niewielki zespół struktur opartych na NMR operatora DNA O3 związanego z domenami głowic białka represora Lac z Escherichia coli12. Poniższe instrukcje zawierają informacje o tym, jak uzyskać dostęp do plików współrzędnych atomowych powiązanych z każdą z tych struktur, a także jak używać programu 3DNA (kopia tego pliku znajduje się na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove) do badania i modyfikowania tych struktur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instalacja pakietu oprogramowania

  1. Wejdź na stronę internetową 3DNA pod adresem http://x3dna.org i kliknij link do Forum 3DNA. W obrębie Forum wybierz link „register” i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowe konto.
  2. Poniższe instrukcje szczegółowo opisują instalację oprogramowania na komputerze Macintosh z systemem OS X z domyślną powłoką „bash”. Procedura dla systemów Linux lub Windows (Cygwin, MinGW/MSYS) z powszechnie używanymi powłokami (w tym „tcsh”) znajduje się na Forum 3DNA.
  3. Po ustaleniu nazwy użytkownika i hasła zaloguj się na Forum. Wybierz link „Downloads” w sekcji powitalnej, a na nowej stronie wybierz „3DNA download”. Przeniesie Cię to do strony pobierania 3DNA, z której można pobrać różne wersje oprogramowania.
  4. Wybierz link Mac OS X Intel, aby pobrać skompresowany plik tarball (tar.gz) zawierający oprogramowanie.
  5. Kliknij dwukrotnie plik (tar.gz), aby utworzyć folder o nazwie x3dna-v2.1. Folder ten, zawierający pakiet oprogramowania 3DNA, można przenieść w dowolne miejsce. Na potrzeby niniejszej procedury przeciągamy go do katalogu „Applications”. Na tym etapie plik tar.gz nie jest już potrzebny i można go usunąć.
  6. Otwórz aplikację Terminal, która zazwyczaj znajduje się w folderze „Utilities”, i przejdź do katalogu x3dna-v2.1 utworzonego w kroku 5, używając następującego polecenia (zakończonego tutaj, jak i we wszystkich poniższych instrukcjach, klawiszem Enter):
    cd /Applications/x3dna-v2.1
  7. Uruchom skrypt konfiguracyjny niezbędny do prawidłowego działania 3DNA, wpisując:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Skopiuj dwulinijne ustawienia eksportu wydrukowane w kroku 7. Jeśli użytkownik umieścił oprogramowanie w katalogu „Applications”, dwie linie powinny wyglądać następująco:
    export X3DNA=/Applications/x3dna-v2.1
    export PATH=/Applications/x3dna-v2.1/bin:$PATH
    Jeśli użytkownik zdecydował się zainstalować oprogramowanie w innym katalogu, w poleceniu export pojawi się inne słowo niż „Applications”. Ta alternatywna nazwa katalogu zastąpi słowo „Applications” w powyższych dwóch poleceniach. Należy pamiętać, że jeśli domyślną powłoką jest „tcsh” zamiast „bash”, treść dwóch linii powinna brzmieć: setenv X3DNA /Applications/x3dna-v2.1 oraz setenv PATH /Applications/x3dna-v2.1/bin:$PATH.
  9. Sprawdź w „Finderze”, czy na Twoim komputerze istnieje już plik o nazwie „.bashrc”.
  10. Otwórz aplikację TextEdit znajdującą się w katalogu „Applications” i wybierz opcję „Make Plain Text” w menu „Format”.
  11. Jeśli plik „.bashrc” z kroku 9 istnieje, otwórz go w programie TextEdit i wklej ustawienia eksportu z kroku 8 na końcu pliku. Jeśli plik „.bashrc” nie istnieje, wklej ustawienia eksportu z kroku 8 do pustego pliku i zapisz go pod nazwą „.bashrc” w katalogu domowym. (Katalog domowy na komputerze Macintosh jest oznaczony ikoną „domu”).
  12. Aby nowe ustawienia były dostępne, należy uruchomić nowo zapisany plik „.bashrc”, używając następującego polecenia w programie Terminal:
    source ~/.bashrc
  13. Pakiet 3DNA jest teraz zainstalowany w systemie i można przeprowadzić Protokoły 2–5 w programie Terminal. Protokół 6 wykonuje się za pomocą w3DNA, interfejsu webowego do wybranych funkcji oprogramowania 3DNA.

2. Analiza struktury krystalicznej

  1. Przedstawiamy analizę struktury kwasu nukleowego na przykładzie DNA związanego z białkiem Hbb z Borrelia burgdorferi8. Plik współrzędnych atomowych powiązany z tą strukturą znajduje się w Protein Data Bank13 (PDB; http://www.rcsb.org), gdzie przypisano mu identyfikator strukturalny 2np2. Dołączone dane uzupełniające zawierają kopię tego pliku, którą można również znaleźć na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Pierwszym krokiem w analizie struktury za pomocą 3DNA jest utworzenie pliku zawierającego listę wszystkich sparowanych zasad. Wykonuje się to za pomocą programu „find_pair”, wpisując następującą komendę:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    W tym przypadku 2np2.pdb jest wspomnianym wcześniej plikiem wejściowym ze współrzędnymi atomowymi, a 2np2.bps to wyjściowy plik tekstowy zawierający informacje o parowaniu zasad. Ten ostatni plik z parami zasad może zostać sprawdzony i w razie potrzeby zedytowany przez użytkownika.
  3. Kolejnym krokiem w analizie jest wyznaczenie parametrów geometrycznych charakteryzujących strukturę. Obejmują one standardowe kąty torsyjne wiązań chemicznych14, kąty pseudorotacji opisujące puckerowanie pierścienia cukrowego15, parametry ciała sztywnego określające ułożenie zasad i kolejnych par zasad16 oraz inne miary trójwymiarowej struktury chemicznej. Komenda „analyze” przyjmuje jako wejście plik z parami zasad wygenerowany w kroku 2 i tworzy kilka plików wyjściowych, które pojawiają się w bieżącym katalogu roboczym. Wartości te są obliczane poprzez wpisanie następującej komendy:
    analyze 2np2.bps
    Pliki wyjściowe wykorzystane w tej procedurze to 2np2.out, zawierający przegląd obliczonych parametrów, oraz bp_step.par, zawierający listę opisanych powyżej parametrów ciała sztywnego. Ten ostatni plik można łatwo zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i tworzenia wykresów. Przykład znajduje się w sekcji Wyniki Reprezentatywne (Rysunek 1).

3. Konstrukcja struktury DNA na podstawie parametrów ciał sztywnych

  1. Oprócz analizy struktury kwasów nukleinowych, oprogramowanie 3DNA umożliwia budowanie modelu strukturalnego na podstawie parametrów ciała sztywnego za pomocą komendy „rebuild”. W niniejszym protokole pokazujemy, jak skonstruować dwa helikalne modele DNA, najpierw wykorzystując parametry ciała sztywnego z kompleksu Hbb-DNA obliczone w Protokole 2, a następnie stosując zmodyfikowany zestaw parametrów, w którym zmieniono wybrane kąty roll. Kąt roll określa stopień zgięcia następujących po sobie par zasad w kierunku bruzd DNA16. Dodatnie wartości roll wiążą się z zawężeniem bruzdy większej, a ujemne z zawężeniem bruzdy mniejszej. Standardowy układ odniesienia17 przyjęty przez 3DNA oraz inne popularne oprogramowanie do analizy kwasów nukleinowych, np. Curves+18, zapewnia spójność numeryczną obliczonych parametrów par zasad Watsona-Cricka.
  2. Domyślnie funkcja „rebuild” w programie 3DNA tworzy dokładne modele atomowe, które zawierają jedynie współrzędne atomów w zasadach azotowych. Aby stworzyć przybliżony model atomowy, obejmujący współrzędne zarówno atomów szkieletu, jak i zasad, należy wpisać następującą komendę:
    x3dna_utils cp_std bdna
    Komenda ta instruuje program 3DNA, aby podczas konstrukcji modeli z parametrów ciała sztywnego wprowadzić standardową konformację szkieletu B-DNA.
  3. Aby zbudować model podwójnej helisy z parametrami ciała sztywnego znalezionymi w strukturze Hbb-DNA, należy wpisać:
    rebuild -atomic bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Parametr „-atomic” określa konstrukcję modelu pełnoatomowego ze współrzędnymi wszystkich atomów ciężkich (nie-wodór), „bp_step.par” to plik wygenerowany w kroku 3 Protokołu 2, który zawiera wprowadzone parametry ciała sztywnego, a „2np2_rbld_org.pdb” to plik wyjściowy ze współrzędnymi atomowymi utworzonej struktury. Ten ostatni plik jest sformatowany zgodnie ze specyfikacją PDB, dlatego kończy się rozszerzeniem „.pdb”.
  4. Plik „bp_step.par” można edytować w celu wygenerowania zmodyfikowanej struktury. Na komputerach Macintosh zmiany można wprowadzić za pomocą aplikacji TextEdit, zgodnie z opisem w kroku 10 Protokołu 1.
  5. W tym przypadku modyfikujemy ekstremalne kąty roll w dwóch miejscach największego zgięcia. Wartości wyrażone w stopniach zmieniamy na zero z wartości 64,95 w linii 17 oraz 60,93 w linii 26. Zmodyfikowany plik zapisujemy pod nową nazwą „bp_step_roll0.par” i zamykamy program TextEdit.
  6. Budujemy strukturę, analogicznie jak w kroku 3, używając zmodyfikowanego zestawu parametrów kroków jako pliku wejściowego, wpisując:
    rebuild -atomic bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Oba modele można wyświetlić w standardowym programie do wizualizacji molekularnej, takim jak PyMOL (www.pymol.org), wykorzystując wygenerowane pliki współrzędnych (.pdb) jako dane wejściowe. Obrazy zrekonstruowanych struktur znajdują się w sekcji Wyniki reprezentatywne (Rycina 2).

4. Analiza plików struktury wielomodelowej

  1. W przeciwieństwie do Protokołu 2, w którym analizujemy pojedynczą strukturę zawierającą kwasy nukleinowe, tutaj pokazujemy, jak analizować duży zespół struktur. Badamy zmienność w czasie parametrów ciała sztywnego wzdłuż serii 14 par zasad łańcuchów DNA uzyskanych z symulacji dynamiki molekularnej (MD)11. Analiza obejmuje 4 500 struktur, rozmieszczonych w interwałach 100-psec w obliczeniach MD i zapisanych w 4 500 osobnych plikach. Towarzyszące dane uzupełniające zawierają kopie tych plików, a także zestaw 4 500 innych plików dla symulacji DNA o odwróconej sekwencji (dokładną kolejność zasad można znaleźć w tekście wprowadzającym). Oba zestawy plików oraz mniejszy podzbiór danych są również dostępne na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Pierwszym krokiem analizy jest ta sama czynność, która została wykonana w Protokole 2, czyli identyfikacja sparowanych zasad poprzez uruchomienie programu „find_pair”. Ponieważ cały zestaw struktur dzieli ten sam schemat parowania zasad, program „find_pair” należy uruchomić tylko raz na reprezentatywnym pliku. W tym przypadku wybieramy 1001. strukturę w symulacji łańcuchów DNA zawierających centralny krok AT, o nazwie pliku md_AT_set1.pdb.1001. Następująca instrukcja generuje informacje o parowaniu zasad i zapisuje je w pliku md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    Użytkownik może sprawdzić zidentyfikowane parowania zasad i wprowadzić ręczne zmiany w pliku w oparciu o wiedzę o strukturze.
  3. Kolejnym krokiem jest wyznaczenie parametrów geometrycznych całego zestawu struktur za pomocą polecenia „x3dna_ensemble analyze”. Program wykorzystuje jako dane wejściowe plik par zasad wygenerowany w kroku 2 (md_AT_set1.bps) oraz plik zawierający listę struktur do analizy. Ten drugi plik, nazwany tutaj md_AT_set1.list, zawiera 4 500 plików do analizy, przy czym nazwy plików są wpisywane w osobnych liniach w kolejności wygenerowanej przez symulację MD. Kopia tego pliku jest zawarta w materiałach uzupełniających oraz dostępna na forum 3DNA. Należy ostrzec użytkownika, że ze względu na dużą liczbę plików czas obliczeń może być długi (~20 min na 1 000 plików na procesorze AMD Phenom II X4 965). Polecenie uruchamia się, wpisując następującą komendę:
    x3dna_ensemble analyze -b md_AT_set1.bps -l md_AT_set1.list -o md_AT_set1.out
    W powyższym przykładzie „-b” odnosi się do pliku par zasad utworzonego w kroku 2, „-l” określa, że podano listę plików, a „-o” pozwala użytkownikowi przypisać nazwę plikowi wyjściowemu. Istnieje wiele opcji, których można używać wraz z poleceniem „x3dna_ensemble analyze”, takich jak wybór konkretnych modeli. Użytkownik może wpisać „x3dna_ensemble analyze -h”, aby uzyskać więcej informacji na temat tych opcji.
  4. Kolejnym krokiem jest wyodrębnienie pożądanych parametrów ciała sztywnego z ogólnego pliku wyjściowego md_AT_set1.out, wygenerowanego w kroku 3. Jest to wykonywane za pomocą polecenia „x3dna_ensemble extract”. Listę dostępnych parametrów geometrycznych można uzyskać, wpisując „x3dna_ensemble extract -l”. W tym przypadku wyodrębniamy kąty roll i tworzymy plik tekstowy z wartościami oddzielonymi przecinkami (CSV) dla kątów roll za pomocą następującego polecenia:
    x3dna_ensemble extract -p roll -s , -f md_AT_set1.out -o md_AT_set1_roll.csv
    Opcja „-p roll” w tym poleceniu określa parametr do wyodrębnienia, „-s ,” oznacza plik rozdzielany przecinkami, „-f” wskazuje plik wyjściowy uzyskany z polecenia ensemble analyze, a „-o” pozwala użytkownikowi nazwać plik wyjściowy CSV z kątami roll wzdłuż DNA we wszystkich analizowanych strukturach. Plik ten może być wczytywany do innych programów w celu dalszej analizy i tworzenia wykresów. Analizę zmienności roll w dwóch opisanych powyżej zestawach danych wygenerowanych przez MD można znaleźć w Reprezentatywnych Wynikach (Rysunek 3), a skrypt MATLAB użyty do wygenerowania tych obrazów jest dostępny na forum 3DNA.

5. Superpozycja struktur wielomodelowych względem wspólnej ramy odniesienia

  1. Najnowsza wersja 3DNA (wersja 2.1) posiada nową funkcję, która pozwala użytkownikowi na analizę wielu struktur z wspólnej perspektywy. Komenda „x3dna_ensemble reorient” nakłada na siebie zbiór powiązanych struktur w odniesieniu do wspólnej pary zasad lub kroku pary zasad. Poniższy protokół wykorzystuje tę możliwość w odniesieniu do struktur uzyskanych metodą NMR dla operatora O3 DNA związanego z domenami głowicami białka represora Lac12. Struktury te są przechowywane w PDB pod identyfikatorem 2kek w wielomodelowym pliku strukturalnym, który zawiera wszystkie modele struktur w jednym pliku, w przeciwieństwie do oddzielnych plików, takich jak te używane dla każdego z 4 500 modeli w Protokole 4. Dołączone dane uzupełniające zawierają kopię tego pliku, który można również znaleźć na forum 3DNA pod adresem http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Podobnie jak w poprzednich protokołach, pierwszym krokiem jest obliczenie parowania zasad DNA za pomocą programu „find_pair”. W tym przypadku jako dane wejściowe wykorzystujemy plik „2kek.pdb” i wpisujemy następującą komendę:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    Parowanie zasad jest generowane na podstawie pierwszego modelu w pliku pdb. Ręczne korekty w wygenerowanym pliku par zasad „2kek.bps” mogą zostać wprowadzone na podstawie wiedzy o strukturze.
  3. Program „x3dna_ensemble reorient” wyrówna poszczególne modele w strukturze wielomodelowej względem wspólnego układu odniesienia. Program ten wymaga jako danych wejściowych zarówno pliku pdb, jak i pliku parowania zasad z poprzedniego kroku i jest uruchamiany za pomocą następującej komendy:
    x3dna_ensemble reorient -b 2kek.bps -f 1 -e 2kek.pdb -o 2kek_fr1.pdb
    W tej komendzie opcja „-b” określa plik parowania zasad, „-f 1” oznacza parę zasad, względem której wyrównywane są wszystkie struktury (w tym przypadku parę zasad 1 na końcu 5´ nici zawierającej sekwencję), „-e” określa wejściowy plik zespołu, a „-o” pozwala użytkownikowi podać nazwę pliku wyjściowego, w tym przypadku „2kek_fr1.pdb”. Więcej informacji o opcjach komendy można uzyskać, wpisując „x3dna_ensemble reorient -h”. Omówienie wyrównanych struktur znajduje się w sekcji Wyniki Reprezentatywne (Rysunek 4).

6. Konstrukcja cząsteczki DNA udekorowanej białkiem

  1. Interfejs sieciowy w3DNA zawiera niektóre popularne funkcje pakietu oprogramowania 3DNA. Przedstawiamy tutaj możliwość konstruowania trójwymiarowych modeli DNA z przywiązanymi białkami za pomocą serwera sieciowego. Związane fragmenty DNA przyjmują parametry ciała sztywnego wybranych kompleksów białko-DNA; w tym przypadku są to wartości dla DNA związanego z białkiem Hbb, przeanalizowanego w Protokole 2. Niezwiązane regiony DNA mogą przyjąć jedną z trzech wybranych przez użytkownika form helikalnych (A, B lub C). Formy A, B i C odnoszą się do trzech kanonicznych modeli DNA, uzyskanych z wczesnych eksperymentów dyfrakcji włókien, z odpowiednio 11, 10 i 9 parami zasad na jeden obrót podwójnej helisy19-21.
  2. Pierwszym krokiem w budowaniu modelu DNA z przywiązanymi białkami jest odwiedzenie strony internetowej w3DNA pod adresem http://w3dna.rutgers.edu. Wybranie opcji „Reconstruction” z menu w lewym górnym rogu strony aktywuje funkcje budowania modelu online.
  3. Następnym krokiem jest wybranie łącza „Bound Protein-DNA template” znajdującego się w lekko zacieniowanym polu na środku nowej strony. Wybór ten aktywuje menu rozwijane, które pozwala użytkownikowi określić liczbę związanych białek. Tutaj wybieramy dwa związane białka i klikamy przycisk „Continue”. Należy pamiętać, że modele są ograniczone rozmiarem do 1 000 par zasad lub 2 000 nukleotydów oraz do trzydziestu związanych białek.
  4. Wybór liczby związanych białek prowadzi do strony specyfikacji podobnej do tej przedstawionej na Rysunku 5. Strona ta pozwala użytkownikowi określić sekwencję DNA, formę helikalną niezwiązanego DNA oraz tożsamość i lokalizację związanych białek.
  5. Użytkownik wpisuje lub wkleja żądaną sekwencję w polu tekstowym na środku strony specyfikacji (Rysunek 5, Etykieta 1). Należy pamiętać, że akceptowane są tylko standardowe reszty – A, T, C, G i U. Tutaj wprowadzamy homopolimer o długości 81 par zasad, składający się całkowicie z par A·T z A w nici niosącej sekwencję.
  6. Poniżej pola tekstowego znajduje się menu rozwijane (Rysunek 5, Etykieta 2), służące do wyboru konformacji helikalnej niezwiązanych regionów DNA. W tym przykładzie wybieramy konformację w formie B.
  7. W dolnej części strony specyfikacji znajduje się pole tekstowe do wprowadzenia pozycji wiązania i nazw plików związanych białek (Rysunek 5, Etykieta 3). Pozycja wiązania określa lokalizację centrum fragmentu związanego z białkiem w sekwencji DNA. Jeśli związane DNA zawiera nieparzystą liczbę par zasad, jak w strukturze Hbb-DNA, pozycja wiązania oznacza lokalizację środkowej pary zasad fragmentu. W przypadku DNA związanego z Hbb ta środkowa para zasad jest niedopasowaniem T·T. W tym przykładzie, gdzie wiążemy dwie kopie białka Hbb z matrycą DNA, para T·T jest umieszczona na pozycjach 20 i 63 w 81-parowej sekwencji DNA. Należy zauważyć, że sekwencja związanego fragmentu nie musi pokrywać się z sekwencją wprowadzoną w kroku 5. Jeśli region związany z białkiem zawiera parzystą liczbę par zasad, pozycja wiązania oznacza lokalizację środkowego stopnia par zasad w DNA. Oznacza to, że centralny stopień par zasad związanego fragmentu jest umieszczony pomiędzy parami zasad n a n +1, gdzie n jest określoną liczbą wzdłuż segmentu. Należy również zauważyć, że użytkownik może udekorować DNA dowolnym białkiem, pod warunkiem, że struktura jego kompleksu z DNA jest znana i zapisana w standardowym formacie PDB13.
  8. Na dole strony specyfikacji znajduje się pole, które umożliwia użytkownikowi wygenerowanie podglądu DNA związanego z białkiem (Rysunek 5, Etykieta 4). Tutaj zaznaczamy to pole i klikamy przycisk „Continue”. Czynność ta generuje stronę przeglądu z listą wybranych parametrów, a także ewentualnymi błędami, które mogły wystąpić w wyniku nakładania się wybranych miejsc wiązania. Użytkownik może wybrać przycisk „Back”, jeśli konieczne są zmiany, lub przycisk „Build”, aby kontynuować.
  9. Kolejna strona wyświetla statyczny obraz kompleksu DNA-białko w jego najbardziej rozciągniętej konfiguracji i umożliwia interaktywną wizualizację online za pomocą Jmol i Webmol. Użytkownik może również pobrać plik współrzędnych (.pdb) sformatowany zgodnie ze specyfikacjami PDB. Odbywa się to poprzez wybranie łącza „Download the rebuilt pdb file” poniżej wygenerowanego obrazu. Plik ten można łatwo wczytać do programu grafiki molekularnej w celu dalszej wizualizacji. Przykłady DNA udekorowanego białkiem Hbb opisane powyżej oraz nieco dłuższego łańcucha (86 par zasad) z Hbb wycentrowanym na pozycjach 20 i 67 znajdują się w sekcji Wyniki Reprezentatywne (Rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Narzędzia programowe 3DNA są rutynowo wykorzystywane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Na przykład tożsamość par zasad oraz parametry ciał sztywnych, które charakteryzują ułożenie zasad w fragmentach podwójnych helis struktur DNA i RNA, są automatycznie obliczane i przechowywane dla każdego nowego wpisu w Nucleic Acid Database22, będącej światowym repozytorium informacji strukturalnych o kwasach nukleinowych. Wartości parametrów ciał sztywnych wyznaczone zgodnie z Protokołem 2 łatwo ujawniają zniekształ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zestaw protokołów przedstawionych w niniejszym artykule ukazuje jedynie część możliwości pakietu programów 3DNA. Narzędzia te można zastosować do struktur RNA w celu identyfikacji niekanonicznych par zasad, określenia kontekstów struktury drugorzędowej, w których występuje takie parowanie, ilościowego określenia dyspozycji przestrzennej fragmentów helikalnych, pomiaru nakładania się zasad wzdłuż szkieletu łańcucha i tak dalej. Komenda rebuild umożliwia użytkownikowi stworzenie prostych i informacyjnych reprezentacji blok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Jiřímu Šponerowi za udostępnienie współrzędnych podwójnych helis DNA wygenerowanych w symulacjach dynamiki molekularnej. Dziękujemy również Nadzie Spackovej za pomoc w pobieraniu tych struktur. Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie niniejszej pracy dzięki grantom badawczym USPHS GM34809 i GM096889.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231(2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. , (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oprogramowanie 3DNAanaliza kwasów nukleinowychprzypisywanie par zasadparametry ciała sztywnegorekonstrukcja strukturalnaanaliza zespołówstruktury NMRsymulacje MDserwer WWW w3DNADNA z przyłączonymi białkami
Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.