Badania nad zmianami w funkcjonowaniu obwodów hipokampa po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu

Podsumowanie

Omówiono wieloaspektowe podejście do badania zmian funkcjonalnych w obwodach hipokampa. Opisano techniki elektrofizjologiczne wraz z protokołem wywoływania urazu, testami behawioralnymi oraz metodą sekcji regionalnej. Kombinację tych technik można zastosować w podobny sposób w odniesieniu do innych obszarów mózgu i innych problemów naukowych.

Streszczenie

Urazy czaszkowo-mózgowe (TBI) dotykają ponad 1,7 miliona osób w Stanach Zjednoczonych każdego roku, a nawet łagodny TBI może prowadzić do trwałych zaburzeń neurologicznych ¹. Uważa się, że dwa powszechne i upośledzające objawy występujące u osób, które przeżyły TBI — deficyty pamięci oraz obniżenie progu drgawkowego — są pośrednio wywoływane przez indukowaną przez TBI dysfunkcję hipokampa ^2,3. Aby wykazać, w jaki sposób zmieniona funkcja obwodów hipokampa niekorzystnie wpływa na zachowanie myszy po TBI, stosujemy boczne urazowe uderzenie płynowe (lateral fluid percussion injury), powszechnie używany model zwierzęcy TBI, który odtwarza wiele cech ludzkich urazów czaszkowo-mózgowych, w tym utratę komórek neuronalnych, gliozę oraz zaburzenia jonowe ^4-6.

W niniejszej pracy prezentujemy kombinatoryczną metodę badania dysfunkcji hipokampa wywołanej przez TBI. Nasze podejście łączy wiele technik fizjologicznych ex vivo z analizą behawioralną zwierząt oraz analizą biochemiczną, aby zbadać zmiany w hipokampie po TBI. Rozpoczynamy od eksperymentalnego modelu urazu wraz z analizą behawioralną w celu oceny dysfunkcji poznawczych następujących po TBI. Następnie przedstawiamy trzy odrębne techniki rejestracji ex vivo: rejestrację potencjałów polowych zewnątrzkomórkowych, wizualizowany patch-clamp całokomórkowy oraz rejestrację z użyciem barwników wrażliwych na napięcie. Na koniec prezentujemy metodę regionalnej dyssekcji podregionów hipokampa, która może być przydatna do szczegółowej analizy zmian neurochemicznych i metabolicznych po TBI.

Metody te zostały wykorzystane do zbadania zmian w obwodach hipokampa po TBI oraz do analizy przeciwstawnych zmian w funkcji obwodów sieciowych, które występują w zakręcie zębatym i podregionach CA1 hipokampa (patrz Rycina 1). Zdolność do analizy zmian po TBI w każdym z tych podregionów jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw deficytów behawioralnych i poznawczych wywołanych przez TBI.

Wieloaspektowy system opisany w niniejszej pracy pozwala badaczom wyjść poza charakterystykę fenomenologii indukowanej stanem chorobowym (w tym przypadku TBI) i określić mechanizmy odpowiedzialne za obserwowaną patologię związaną z TBI.

Protokół

1. Boczny uraz uderzeniowy cieczą

1. Zanurzyć mysz w narkozie, podając domięśniowo mieszankę ketaminy i ksylazyny. Następnie przygotować głowę myszy do nacięcia, stosując odkażanie jodyną.
2. Wykonać kraniektomię w obszarze prawego ciemienia, używając trepanu o średnicy zewnętrznej 3 mm.
3. Zamocować gniazdo igły Luer-loc (średnica wewnętrzna 3 mm) nad miejscem kraniektomii za pomocą cyjanoakrylanu i akrylu stomatologicznego.
4. Po 24 h ponownie z narkozować mysz, stosując izofluran drogą wziewną.
5. Gdy powróci normalny oddech, ale zanim mysz stanie się wrażliwa na bodźce, podać 20 msec impuls soli fizjologicznej do czaszki za pomocą urządzenia do urazów płynowych (fluid percussion injury device).
6. Niezwłocznie po urazie usunąć gniazdo igły, ponownie z narkozować mysz izofluranem i zaszyć skórę głowy.
   Grupy kontrolne poddane operacji pozorowanej (sham) zostaną poddane identycznej procedurze z pominięciem kroku 1.5.

2. Analiza behawioralna - warunkowa reakcja lękowa

1. Oswajać myszy przez dwa kolejne dni przed treningiem uwarunkowanej reakcji strachu (CFR).
2. Umieścić mysz w komorze warunkowania na 3 min, a następnie podać wstrząs podłogowy o natężeniu 1,5 mA przez 2 s. Pozostawić mysz w komorze przez kolejne 30 s.
3. Po okresie odroczenia (zazwyczaj 24 h) ponownie umieścić mysz w komorze warunkowania na 5 min. Oceniać zamarcie w odstępach 5 s.
   Analiza polega na porównaniu względnego czasu zamarcia w dwóch populacjach, w naszym przypadku w grupie myszy z uszkodzeniem mózgu i w grupie kontrolnej poddanej operacji pozorowanej. Niższy wskaźnik zamarcia (w porównaniu z grupą kontrolną) wskazuje na niezdolność do utrzymania skojarzenia między kontekstem a wstrząsem podłogowym, co świadczy o zaburzeniach pamięci i dysfunkcji poznawczej.

3. Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa

*Uwaga: Znieczulenie z użyciem klosza może być stosowane wyłącznie w procedurach terminalnych (takich jak opisana tutaj dysekcja mózgu).

1. 7 dni po urazie przygotować 1 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) oraz 250 ml roztworu do wycinania z sacharozą.
2. Obficie stosować lód, aby upewnić się, że wszystkie instrumenty i roztwory używane podczas przygotowywania skrawków mózgu są lodowate.
3. Zznieczylić mysz przy użyciu izofluranu. Szybko i delikatnie wyciąć mózg z myszy i umieścić go w sacharozie.
4. Przyciąć mózg i umieścić go na powierzchni do cięcia na kropli superkleju przed blokiem agaru.
5. Wyciąć koronalne skrawki o grubości 350 μm; powinno być możliwe uzyskanie 4 lub 5 skrawków z nienaruszonym obwodem hipokampa.
6. Inkubować skrawki przez co najmniej 1 hr w temperaturze 37 °C.

4. Rejestracja potencjałów pola zewnątrzkomórkowego

1. Wyciągnij elektrody szklane borokrzemianowe do oporności 2-5 MΩ za pomocą pionowego wyciągacza.
2. Umieść skibkę w komorze i włóż elektrodę do uchwytu elektrod.
3. Opuść elektrodę stymulującą do skibki w obrębie traktu aksonalnego, takiego jak droga perforantna lub kolaterale Schaffera. Opuść elektrodę rejestrującą na odpowiednią pozycję, monitorując ślady wyjściowe, aby upewnić się, że elektrody znajdują się na tym samym poziomie z (głębokości). Gdy przy stałym poziomie prądu stymulującego osiągnięta zostanie maksymalna odpowiedź, oznacza to, że elektrody znajdują się na tym samym poziomie z.
4. Powstały ślad składa się z trzech komponentów: presynaptycznej salwy włókien, polowego pozakomórkowego potencjału postsynaptycznego (fEPSP) oraz postsynaptycznego piku populacyjnego. W niektórych preparatach komponenty te mogą nakładać się czasowo, co utrudnia analizę. W przypadku wątpliwości, czy odpowiedzi są presynaptyczne czy postsynaptyczne, do kąpieli można dodać APV i CNQX w celu zablokowania przekaźnictwa pobudzającego; wtedy wszystkie pozostałe sygnały będą pochodzenia presynaptycznego.
5. Protokoły stymulacji różnią się w zależności od trzech odrębnych typów eksperymentów: krzywych wejście/wyjście (input/output), rejestracji podwójnych impulsów oraz eksperymentów nad plastycznością długoterminową.
   Analiza zazwyczaj polega na pomiarach porównujących nachylenie fEPSP zarówno u myszy z urazami mózgu, jak i w kontrolnej grupie poddanej operacji pozorowanej (sham), z kontrolą siły wejścia poprzez pomiar salwy włókien.

5. Wizualizowana rejestracja metodą patch-clamp

1. Przygotować skrawki, elektrody oraz zestaw do rejestracji zgodnie z opisem powyżej, aż do kroku 4.2.
2. Pod uwagę należy brać wyłącznie komórki znajdujące się głębiej niż 80 μm w tkance, ponieważ komórki bliższe powierzchni będą martwe i/lub będą miały ograniczoną łączność synaptyczną. Należy zbliżać elektrodę do komórki, przykładając nadciśnienie, aby zapobiec jej zapchaniu podczas przesuwania się w głąb tkanki. Gdy elektroda delikatnie dotknie komórki, należy przyłożyć podciśnienie w celu utworzenia tzw. „gigaseal” (uszczelnienia gigomohmowego) pomiędzy elektrodą a błoną plazmatyczną.
3. Należy przyłożyć krótkie serie podciśnienia, aby przerwać ciągłość błony plazmatycznej pod elektrodą i uzyskać konfigurację whole-cell.
4. Należy wyeliminować przejściowe zmiany pojemności za pomocą wzmacniacza oraz skompensować oporność seryjną. Kompensacja oporności seryjnej komórki jest niezbędna dla zapewnienia dokładności pomiarów.
5. Można przeprowadzić dwa tryby rejestracji z pojedynczej komórki: clamp prądowy (pomiar napięcia błonowego) oraz clamp napięciowy (pomiar prądu przepływającego przez kanały jonowe w błonie).
   Możliwe typy analiz są liczne, lecz w naszym przypadku polegają głównie na analizie biofizycznej ilościowo określającej częstotliwość i amplitudę spontanicznych prądów synaptycznych zarówno u myszy z uszkodzeniem mózgu, jak i u kontrolek poddanych operacji pozorowanej.

6. Obrazowanie z użyciem barwników wrażliwych na napięcie (VSD)

1. Przygotować skrawki i aparat do rejestracji zgodnie z opisem powyżej, do kroku 4.2 włącznie.
2. Przygotować roztwór zapasu barwnika, mieszając 1 mg di-3-ANEPPDHQ w 50 μl etanolu; rozdzielić w alikwoty po 2 μl do probówek owiniętych folią i przechowywać w temperaturze -20 °C. Pracze roztwór barwnika przygotowywać codziennie poprzez rozcieńczenie 1:200 w aCSF.
3. Inkubować skrawki na zwilżonym aCSF papierze filtracyjnym i barwić 90 μl barwnika przez 16 min; wypłukać aCSF i umieścić w komorze rejestracyjnej typu interface.
4. Dostosować intensywność stymulacji światłem, aż odpowiedź znajdzie się w środku zakresu kamery. Obrazy są zazwyczaj pozyskiwane z częstotliwością 500-1 000 klatek na sekundę.
5. Uruchomić migawkę dla stymulacji światłem na 200 msec przed stymulacją elektryczną, aby umożliwić stabilizację początkowego szybkiego fotowybielania. Przeplatać próby akwizycji między stymulowane elektrycznie a niestymulowane elektrycznie, aby umożliwić późniejszą subtrakcję tła niestymulowanego. Zarejestrować spoczynkową intensywność światła (odczyt fluorescencji przy zamkniętej migawce) przed otwarciem migawki. Każda próba VSD będzie stanowić „film” odczytów fluorescencji o wymiarach x pikseli na y pikseli w czasie. Zarejestrować 10 - 12 prób VSD dla każdego warunku testowego.
6. Wszystkie pomiary wykonuje się na wewnątrzpikselowej, znormalizowanej zmianie fluorescencji przed stymulacją elektryczną, dF/F, obliczanej w następujący sposób:
   Odjąć spoczynkową intensywność światła od surowej próbą akwizycyjnej VSD. Dla każdego piksela w każdej próbie znormalizować wynik według średniej wartości przed stymulacją elektryczną dla danej próby, odejmując jedność. Wykonać to zarówno dla prób stymulowanych elektrycznie, jak i niestymulowanych elektrycznie. Stworzyć średnią próbę „fluorescencji tła” z prób niestymulowanych elektrycznie i odjąć tę próbę tła od prób stymulowanych elektrycznie. Dalszą analizę przeprowadza się zazwyczaj na średniej z 10 - 12 takich prób, które zazwyczaj są również filtrowane przestrzennie i czasowo w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.

7. Disekcje regionalne do analiz biochemicznych

1. Wyjąć mózg myszy zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.
2. Przygotować skrawki przy użyciu urządzenia do cięcia tkanek (tissue chopper).
3. Położyć przekrój na płasko, a następnie przeprowadzić mikrodysekcję obszarów CA1 i DG.
4. Natychmiast zanurzyć w buforze lizującym zawierającym inhibitor proteaz. Zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Reprezentatywne wyniki

Nasze eksperymenty zazwyczaj rozpoczynają się od analizy danych behawioralnych w celu potwierdzenia oczekiwanych deficytów poznawczych występujących u myszy z urazami mózgu. Stosujemy test kontekstowej odruchu warunkowego strachu, ponieważ jest to zachowanie zależne od hipokampa, które jest wiarygodne i wymaga jedynie jednej sesji treningowej oraz jednej sesji testowej. Dane przedstawione na Rysunku 2 reprezentują testy behawioralne służące do pomiaru pamięci anterogradej; jednak test ten można również wykorzystać do pomiaru pamięci retrogradej, jeżeli sesja treningowa zostanie przeprowadzona przed urazem.

Potencjały polowe pobudzeniowe postsynaptyczne (fEPSPs) są mierzone w celu określenia wypadkowej skuteczności synaptycznej dużej populacji komórek (Ryc. 3A). Zazwyczaj stosujemy trzy różne typy wzorców stymulacji, z których każdy dostarcza odrębnych wyników i wniosków. Po pierwsze, poprzez stopniowe zwiększanie intensywności stymulacji w serii kroków, tworzymy krzywą wejście/wyjście (Ryc. 3B/C).

Następnie, poprzez dostarczenie dwóch stymulacji o tej samej intensywności oddzielonych krótką przerwą (zazwyczaj 50 msec), badamy potencjalne zmiany w prawdopodobieństwie uwalniania pęcherzyków synaptycznych.; Ponadto często przeprowadzamy eksperymenty dotyczące długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP). Po ustaleniu odpowiedzi bazowej dostarcza się krótką stymulację o wysokiej częstotliwości (zazwyczaj 100Hz) przy tej samej intensywności, co wywołuje wewnątrzkomórkową kaskadę prowadzącą do wzmocnionej odpowiedzi synaptycznej po powrocie do normalnej stymulacji.

Aktywność elektryczną komórek w konfiguracji whole-cell patch-clamp można rejestrować w dwóch trybach. W trybie clamp napięciowy (voltage clamp) eksperymentator kontroluje napięcie błony komórki poddanej patch-clampowi względem kąpieli, za pomocą oprogramowania komputerowego powiązanego z wzmacniaczem. W tym przypadku rejestrowane są prądy pośredniczące w zdarzeniach postsynaptycznych, co dostarcza informacji o częstotliwości uwalniania presynaptycznego, liczbie aktywowanych receptorów postsynaptycznych oraz stężeniu neurotransmitera pęcherzykowego (Ryc. 4A). W trybie clamp prądowy (current clamp) eksperymentator manipuluje wstrzykiwanym prądem i mierzy odpowiedź napięciową. Może to być przydatne do określenia charakterystyki potencjału czynnościowego, takiej jak próg potencjału czynnościowego i jego półszerokość. Charakterystyki te pozwalają na funkcjonalną kategoryzację neuronów jako pobudzających lub hamujących na podstawie wzorców generowania potencjałów czynnościowych (Ryc. 4B). W celu weryfikacji tożsamości komórkowej zalecamy wypełnienie komórek barwnikiem Lucifer Yellow po zakończeniu rejestracji i wizualne potwierdzenie tożsamości poprzez obecność lub brak kolców dendrytycznych (Ryc. 4C, D).

Przykład wyników eksperymentu z wykorzystaniem barwnika wrażliwego na napięcie do pomiaru zmian napięcia błony przedstawiono na Rysunku 5. W tym przypadku elektrodę stymulującą umieszczono w drodze kolaterali Schaffera, a następnie przeanalizowano wynikową aktywność neuronalną w obszarze CA1. Barwnik wrażliwy na napięcie nie informuje o bezwzględnych wartościach napięcia błony, lecz o zmianie napięcia względem stanu bazowego bez stymulacji. Jednakże analizy porównujące dwa stany (np. po urazie mózgu w stosunku do grupy operowanej pozornie) mogą być wykorzystane do określenia parametrów czasoprzestrzennych zmian fizjologicznych, których nie można zmierzyć za pomocą fEPSP lub rejestracji metodą patch-clamp whole-cell.

Rycina 1. Schemat obwodu hipokampa. Przekrój poziomy przez hipokamp. Główne szlaki w obrębie hipokampa zaznaczono kolorem żółtym. Aksony neuronów z kory entorynalnej rzutują poprzez szlak perforujący do zakrętu zębatego, tworząc synapsy z dendrytami komórek ziarnistych zakrętu zębatego. Aksony komórek ziarnistych rzutują poprzez szlak włókien mszystych do obszaru CA3, gdzie tworzą synapsy z dendrytami neuronów CA3. Aksony neuronów CA3 rzutują poprzez szlak kolaterali Schaffera na dendryty komórek piramidowych CA1. Aksony komórek piramidowych CA1 rzutują poza hipokamp poprzez subikulum. Uwaga: Przedstawiono również kolaterale aksonów komórek piramidowych CA3, rzutujące do przeciwległego hipokampa poprzez prążki. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, DG: zakręt zębaty, linia przerywana oznacza warstwę ciał komórek, linia ciągła oznacza granice strukturalne.)

Rycina 2. Reprezentatywne dane behawioralne. A: Dane behawioralne przedstawiające różnicę w stopniu zamrożenia między myszami z urazem mózgu (FPI) a kontrolną grupą poddaną operacji pozorowanej (sham) w paradygmacie warunkowania lękowego. Trening odbył się w 6^tym dniu po urazie, a okres testowy 24 h później. (** oznacza p<.01.)

Rycina 3. Reprezentatywne dane z rejestracji pozakomórkowej. A: Przykład rejestracji polowego pobudzającego potencjału postsynaptycznego (fEPSP) w obszarze CA1. Pierwsze odchylenie w dół to artefakt stymulacji, po którym następuje wolta włókien presynaptycznych, a na końcu fEPSP. B: Krzywe wejście/wyjście przedstawiające spadek wypadkowej skuteczności synaptycznej w CA1 po urazie przez uderzenie cieczą (FPI). C: Krzywe wejście/wyjście przedstawiające wzrost wypadkowej skuteczności synaptycznej w zakręcie zębatym (DG) po FPI. (* oznacza p<.05.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Rycina 4. Reprezentatywne dane z rejestracji whole-cell patch-clamp. A: Przykład spontanicznego pobudzającego prądu postsynaptycznego (sEPSC) z komórki piramidowej obszaru CA1. B: Przykłady serii potencjałów czynnościowych z komórki piramidowej obszaru CA1 (górny ślad) oraz szybko wyładowującego się neuronu interneuronalnego obszaru CA1 (dolny ślad). C: Przykład wypełnionego Lucifer Yellow hamującego interneuronu obszaru CA1. Zwróć uwagę na brak kolców dendrytycznych (górny panel). D: Przykład wypełnionego Lucifer Yellow neuronu piramidowego obszaru CA1. Zwróć uwagę na obecność kolców dendrytycznych (górny panel). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 5. Reprezentatywne dane z obrazowania za pomocą barwników wrażliwych na napięcie.A: Przedstawiony przekrój koronalny hipokampa myszy w celu ukazania anatomii. (DG: zakręt zębaty, CA1: Cornu Ammonis 1) B: Piksele od żółtego do czerwonego reprezentujące aktywność pobudzającą w obszarze CA1 14 msec po stymulacji aferentnych włókien kolaterali Schaffera. Kolor czerwony wskazuje na silniejszą depolaryzację, natomiast żółty na słabszą, lecz wciąż znaczącą depolaryzację. C: Niebieskie piksele reprezentujące miejsca aktywności hamującej w obszarze CA1 56 msec po tej samej stymulacji aferentnych włókien kolaterali Schaffera, która została pokazana na obrazie B. Ciemniejszy odcień niebieskiego wskazuje na silniejszą hiperpolaryzację.

Dyskusja

Każda z opisanych powyżej technik przyczynia się do lepszego zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw obserwowanego deficytu behawioralnego. Dzięki połączeniu unikalnych informacji uzyskanych z każdej z metod jesteśmy w stanie zbadać mechanizmy biologiczne z większą precyzją.

Pomiar fEPSP jest przydatny do ilościowego określenia netto skuteczności synaptycznej dużych, przestrzennie zdefiniowanych obszarów neuronów. Może on również dostarczyć informacji o potencjale grupy komórek do przechodz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wzmacniacz Axopatch 200B	Molecular Devices	AXOPATCH 200B	Zestaw do patch-clamp
Digitalizator Digidata 1322A	Molecular Devices		Zestaw do patch-clamp
Mikromanipulator MP-225	Sutter	MP-225	Zestaw do patch-clamp
Mikroskop DMLFSA	Leica		Zestaw do patch-clamp
Wzmacniacz Multiclamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Zestaw wielozadaniowy (polowy)
Digitalizator Digidata 1440	Molecular Devices		Zestaw wielozadaniowy (polowy)
Mikromanipulator MPC-200	Sutter	MPC-200	Zestaw wielozadaniowy (polowy)
Mikroskop BX51WI	Olympus	BX51WI	Zestaw wielozadaniowy (polowy)
Wzmacniacz Axoclamp 900A	Molecular Devices	AXOCLAMP 900A	Zestaw VSD
Digitalizator Digidata 1322	Molecular Devices		Zestaw VSD
Kamera CCD-SMQ Redshirt	Redshirt	NCS01	Zestaw VSD
Wibratom VT 1200S	Leica	14048142066
Wytciągacz elektrod P-30	Sutter	P-30/P
Koks inhibitor proteaz cOmplete	Roche	11697498001