Artykuł metodologiczny

Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4415

⸱

13 września 2012

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł szczegółowo opisuje protokół swoistej miejscowo transfekcji komórek ssaków w hodowli adherentnej za pomocą matrycy mikroelektrod (MEA) z wykorzystaniem siRNA o sekwencji scrambled.

Streszczenie

Odkrycie szlaku RNAi u eukariotów oraz późniejszy rozwój czynników RNAi, takich jak siRNA i shRNA, pozwoliły na opracowanie skutecznej metody wyciszania konkretnych genów1-8 na potrzeby genomiki funkcjonalnej i terapeutyki. Głównym wyzwaniem w badaniach opartych na RNAi jest dostarczenie czynników RNAi do docelowych komórek. Tradycyjne niewirusowe techniki dostarczania, takie jak masowa elektroporacja i chemiczne metody transfekcji, często nie zapewniają niezbędnej kontroli przestrzennej nad dostarczaniem i cechują się niską wydajnością transfekcji9-12. Niedawne postępy w metodach transfekcji chemicznej, takich jak zastosowanie lipidów kationowych, polimerów kationowych i nanocząsteczek, doprowadziły do znacznego zwiększenia wydajności transfekcji13. Niemniej jednak techniki te wciąż nie oferują precyzyjnej kontroli przestrzennej nad dostarczaniem, co mogłoby przynieść ogromne korzyści w zminiaturyzowanych technologiach wysokoprzepustowych, badaniach pojedynczych komórek oraz analizie oddziaływań międzykomórkowych.

Ostatnie postępy technologiczne w dostarczaniu genów umożliwiły wysokoprzepustową transfekcję komórek adherentnych14-23, z czego większość metod opiera się na elektroporacji w mikroskali. Elektroporacja w mikroskali oferuje precyzyjną czasowo-przestrzenną kontrolę nad dostarczaniem (aż do poziomu pojedynczych komórek) i wykazano, że pozwala osiągnąć wysoką wydajność19, 24-26. Ponadto podejścia oparte na elektroporacji nie wymagają długotrwałego okresu inkubacji (zazwyczaj 4 godziny) z kompleksami siRNA i DNA, co jest konieczne w chemicznych metodach transfekcji, i prowadzą do bezpośredniego wprowadzenia nagich cząsteczek siRNA i DNA do cytoplazmy komórki. W konsekwencji ekspresja genów może zostać osiągnięta już sześć godzin po transfekcji27. Nasz zespół badawczy wcześniej zaprezentował wykorzystanie matryc mikroelektrodowych (MEA) do transfekcji specyficznej dla danej lokalizacji w adherentnych kulturach komórek ssaków17-19. W podejściu opartym na MEA dostarczenie materiału genetycznego odbywa się poprzez lokalną elektroporację komórek w mikroskali. Przyłożenie impulsu elektrycznego do wybranych elektrod generuje lokalne pole elektryczne, które prowadzi do elektroporacji komórek znajdujących się w obszarze stymulowanych elektrod. Niezależne sterowanie mikroelektrodami zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad transfekcją, a także umożliwia przeprowadzenie wielu eksperymentów opartych na transfekcji na tej samej kulturze, co zwiększa przepustowość eksperymentalną i zmniejsza zmienność między kulturami.

W niniejszym materiale opisujemy układ eksperymentalny oraz protokół celowanej transfekcji adherentnych komórek HeLa za pomocą siRNA o sekwencji scrambled znakowanej fluorescencyjnie z wykorzystaniem elektroporacji. Ten sam protokół można zastosować również do transfekcji wektorów plazmidowych. Ponadto opisany tutaj protokół można z łatwością rozszerzyć na różne linie komórek ssaków po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Komercyjna dostępność MEA z predefiniowanymi oraz niestandardowymi układami elektrod sprawia, że technika ta jest dostępna dla większości laboratoriów badawczych dysponujących podstawowym wyposażeniem do hodowli komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie MEA

  1. Matryce MEA do zastosowań w eksperymentach z elektroporacji mogą być albo wykonane za pomocą standardowej techniki fotolitografii, zgodnie z wcześniejszym opisem18, albo zakupione bezpośrednio u producentów MEA, takich jak Multi Channel Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) oraz Alpha MED Scientific, Inc. (http://www.MED64.com). MEA wykorzystane w naszych eksperymentach zostały wykonane wewnętrznie w czystym pomieszczeniu na Arizona State University, zarządzanym przez Center for Solid State Electronics Research (CSSER). Wykorzystane MEA posiadały 32 elektrody z tlenku indu i cyny w układzie 8 na 4, o średnicach od 50-200 μm, umieszczone w szklanej studni o średnicy wewnętrznej 1 cm. Studnia szklana została przyklejona do MEA za pomocą polidimetylosiloksanu (PDMS).
  2. Przed wysiewaniem komórek wysterylizuj MEA w autoklawie. Można również stosować inne metody sterylizacji, takie jak moczenie w 70% etanolu, naświetlanie UV oraz obróbka gorącą wodą, zgodnie z opisami w innych źródłach, pod warunkiem, że nie naruszą one integralności MEA.
  3. Przenieś autoklawowaną MEA do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza i umieść ją w standardowej sterylnej polistyrenowej szalce Petriego. Przed wysianiem komórek na MEA wysterylizuj dygestorium, włączając lampę UV na 20 min. Jeśli MEA jest wrażliwa na światło UV, przykryj szalkę Petriego zawierającą MEA sterylną folią aluminiową podczas naświetlania dygestorium promieniowaniem UV.

2. Wysiewanie komórek na MEA

  1. Zezbierz komórki z hodowli linii komórek ssaków przylegających, używając Trypsyny/EDTA, i doprowadź je do stężenia 100-200 komórek/μl w 1 ml pożywki komórkowej do wysiewu. W naszych eksperymentach pomyślnie hodowaliśmy na MEA linię fibroblastów NIH 3T3, linię komórek HeLa oraz pierwotne neurony korowe i hipokampalne.
  2. Nanieś kroplę 20-30 μl pożywki z komórkami na MEA. Przenieś szalkę Petriego z MEA do inkubatora. Ważne jest, aby upewnić się, że objętość kropli z komórkami jest wystarczająca, by pokryć wszystkie elektrody na MEA.
  3. 2 hr po wysiewaniu komórek przenieś szalkę Petriego z MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie dodaj 400-500 μl uprzednio ogrzanej pożywki (37 °C) do studni MEA. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nadal przylegają i są równomiernie rozłożone na powierzchni MEA. Przenieś MEA z powrotem do inkubatora. 2 hr okresu oczekiwania przed dodaniem pożywki zapewnia wystarczający czas na adhezję komórek do powierzchni MEA. Dodanie pożywki komórkowej zbyt wcześnie po wysiewaniu może doprowadzić do wypłukania komórek. Jeśli komórki nie przylegają dobrze do MEA, powierzchnię można potraktować czynnikami wspomagającymi adhezję, takimi jak polilizyna, fibronektyna i laminina, aby poprawić przyleganie komórek. W naszych eksperymentach z komórkami HeLa zazwyczaj traktujemy powierzchnię MEA fibronektyną (10 μg/ml) przez 1-2 hr.
  4. 8-12 hr po wysiewaniu komórek wykonaj 1-2 płukania PBS, aby usunąć martwe komórki. Pożywkę komórkową można wymieniać co 24-48 hr w zależności od potrzeb. W typowym eksperymencie komórki są zazwyczaj gotowe do transfekcji 24-48 hr po wysiewaniu. Aby zachować spójność wydajności elektroporacji, zaleca się odczekać, aż kultura osiągnie co najmniej 80% konfluencji przed przeprowadzeniem elektroporacji.

3. Miejscowo swoista transfekcja siRNA

  1. Przygotować roztwór kwasów nukleinowych. W przypadku transfekcji siRNA należy przygotować roztwór do elektroporacji siRNA o stężeniu 1-2 μM w lodowatym buforze do elektroporacji, aby uzyskać objętość końcową 200-400 μl. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy transfekcję komórek HeLa za pomocą siRNA o sekwencji scrambled sprzężonej z Alexa 488.
  2. Przenieść MEA z komórkami z inkubatora do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Usunąć pożywkę komórkową z MEA i przeprowadzić przemywanie PBS. Następnie do dołka dodać 200-400 μl lodowatego roztworu do elektroporacji siRNA o stężeniu 1 μM.
  3. Przyłożyć anodowe prostokątne impulsy elektryczne do wybranych elektrod (optymalne parametry impulsu elektrycznego określić w kroku 4). W naszych eksperymentach do generowania impulsów elektrycznych wykorzystaliśmy generator przebiegów Pragmatic Instruments 2414A oraz 16-pinowy klips DIP (dual-inline-package) do nawiązania kontaktu z podkładkami przyłączeniowymi MEA. Generator przebiegów można połączyć z klipsem DIP za pomocą płytki drukowanej z demultiplekserem, aby zapewnić selektywność poszczególnych elektrod. Jako elektrodę odniesienia należy umieścić stalową katodę w pożywce komórkowej. Podczas opuszczania stalowej elektrody odniesienia do pożywki niezwykle ważne jest upewnienie się, że nie nawiąże ona kontaktu z powierzchnią MEA. Kontakt ten może spowodować uszkodzenie komórek i MEA. Zaleca się opuszczenie elektrody odniesienia na wysokość 1 mm nad komórkami. Aby ułatwić rozmieszczenie elektrody odniesienia, w dołku można umieścić dystans o wysokości 1 mm. Alternatywnym podejściem do stosowania zewnętrznej elektrody odniesienia jest wykorzystanie sąsiednich elektrod jako par katoda-anoda.
  4. Niezwłocznie po przyłożeniu impulsów elektrycznych do wybranych elektrod na MEA, przenieść MEA z powrotem do inkubatora. Po 5 min inkubacji ostrożnie zastąpić 75% buforu do elektroporacji podgrzaną wcześniej (37 °C) pożywką komórkową. Następnie można przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne, aby potwierdzić dostarczenie znakowanego fluorescencyjnie siRNA do komórek.

4. Optymalizacja parametrów elektroporacji

  1. Aby określić optymalne parametry impulsu elektrycznego dla elektroporacji, należy zaprojektować eksperymenty z zakresu wartości amplitudy impulsu, czasu trwania impulsu i liczby impulsów. W naszym doświadczeniu z komórkami HeLa zaobserwowaliśmy, że pojedynczy impuls napięcia o amplitudzie od 3 V do 9 V i czasie trwania od 1 msec do 10 msec dla elektrody o rozmiarze 100 μm prowadził do skutecznej elektroporacji przy minimalnej śmierci komórek. Zalecamy, aby w jednym czasie zmieniać tylko jeden parametr, utrzymując pozostałe na stałym poziomie. W celu ilościowego określenia wydajności elektroporacji dla każdego z parametrów impulsu stosujemy jodek propidyny (PI), barwnik nieprzenikający do wnętrza komórki, który barwi materiał nukleinowy, oraz metodologię opartą na teście żywotności, opisaną w krokach 4.2-4.5.
  2. Należy hodować komórki na MEA zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 1 i 2.
  3. Przed elektroporacją należy przygotować 300-500 μl roztworu PI o stężeniu 30 μg/ml w lodowatym buforze do elektroporacji oraz 400 μl roztworu calcein AM o stężeniu 4 μM w PBS.
  4. Należy przenieść MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Należy usunąć medium hodowlane z MEA i przeprowadzić przemycie PBS. Następnie należy dodać 300-500 μl lodowatego buforu do elektroporacji z PI.
  5. Należy przyłożyć impulsy elektryczne o pożądanej amplitudzie i czasie trwania do wybranych elektrod (sprzęt użyty w naszych eksperymentach do generowania i przykładania impulsu elektrycznego do MEA został opisany w kroku 3.3). Jako elektrodę odniesienia należy opuścić stalową elektrodę do buforu do elektroporacji w studzience MEA lub wykorzystać sąsiednią elektrodę jako odniesienie. Poprzez selektywne przykładanie impulsów o różnych amplitudach lub czasach trwania do różnych elektrod można przeprowadzić wiele eksperymentów na tym samym urządzeniu. Na przykład, na MEA z 32 elektrodami można przeprowadzić 8 eksperymentów, dzieląc 32 elektrody na 8 grup, z których każda składa się z 4 elektrod. Każda z 8 grup może być następnie stymulowana pojedynczym prostokątnym impulsem napięcia o czasie trwania 5 msec z amplitudami zmieniającymi się w zakresie 3 V-6 V w przyrostach 0,5 V, a jedną grupę można wykorzystać jako kontrolę.
  6. Natychmiast po przyłożeniu impulsów napięcia należy przenieść MEA do inkubatora na 5 min. Następnie należy ostrożnie usunąć 75% buforu do elektroporacji ze studzienki MEA i zastąpić go ciepłym medium hodowlanym. MEA należy przenieść z powrotem do inkubatora.
  7. Po okresie inkubacji od 2-4 hr należy zastąpić medium hodowlane w studzience MEA 300-500 μl roztworu Calcein AM o stężeniu 4 μM w PBS. MEA należy przenieść z powrotem do inkubatora na kolejne 30 min.
  8. Po inkubacji komórek z Calcein AM należy zastąpić roztwór Calcein AM w studzience MEA buforem PBS po dwukrotnym przemyciu PBS. Należy wykonać obrazy fluorescencyjne komórek za pomocą mikroskopu optycznego z filtrami dla PI (Wzbudzenie/Emisja - 535 nm/617 nm) i Calcein AM (Wzbudzenie/Emisja - 490 nm/520 nm). Pobranie PI w wyniku elektroporacji powoduje czerwoną fluorescencję komórek, a Calcein AM powoduje zieloną fluorescencję komórek żywych. Można zaobserwować trzy możliwe scenariusze: 1) komórka poddana elektroporacji i żywa (będzie fluorescować na czerwono i zielono), 2) komórki żywe, ale niepoddane elektroporacji (będą fluorescować tylko na zielono) oraz 3) komórki martwe w wyniku elektroporacji (będą fluorescować tylko na czerwono). Żywotność komórek obliczono jako procent całkowitej liczby komórek żywych na elektrodzie, a wydajność elektroporacji obliczono jako procent całkowitej liczby komórek załadowanych PI/siRNA.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia specyficzne dla miejsca ładowanie komórek HeLa barwnikiem PI. Można zaobserwować, że jedynie komórki znajdujące się na elektrodzie wykazują pobór PI (Rysunek 1B). W celu oceny żywotności komórek po elektroporacji przeprowadzono test żywotności (Rysunek 1A). Wydajność elektroporacji oraz żywotność komórek dla przykładu pokazanego na Rysunku 1 wyniosły odpowiednio 81.8 % i 96.1 %. Wysoką żywotność komórek i wydajność elektroporacji można osiągnąć poprzez optymalizację parametrów impulsu elektroporacyjnego. Specyficzna dla miejsca transfekcja komórek HeLa siRNA znakowanym fluorescencyjnie dla zoptymalizowanego impulsu elektroporacyjnego (8 V, 1 msec) pokazana jest na Rysunku 2. Ustalono, że wydajność elektroporacji dla siRNA przy 8 V, 1 msec wyniosła 74.4 ± 16.0 %, a żywotność komórek 87.9 ± 8.4 % (wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, N=5).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające barwienie komórek; zielone i czerwone testy komórkowe do analizy.
Rysunek 1. Dostarczanie PI w konkretne miejsce w komórkach HeLa na elektrodzie 200 μm (6 V, 5 msec). A) Test żywotności oparty na Calcien wykonany 2 h po elektroporacji. Żywe komórki są wskazane przez zieloną fluorescencję. B) Czerwona fluorescencja wykazuje pobranie PI przez komórki na elektrodzie. C) Obraz nałożony z A i B. Białe strzałki wskazują komórki poddane elektroporacji, które są żywe. Czarne strzałki wskazują komórki martwe. Białe koło na A, B i C wskazuje obrys elektrody.

Mikroskopia fluorescencyjna: lokalizacja białka w kolorze zielonym (A) i niebieskim (B); analiza komórkowa.
Rycina 2. Transfekcja komórek HeLa z siRNA o sekwencji scramble znakowanej fluorescencyjnie. A) Obraz komórek HeLa na elektrodzie 100 μm transfekowanych siRNA znakowanym Alexa 488 (8 V, 1 msec). B) Obraz jąder komórkowych barwionych DAPI. Białe koło oznacza krawędź elektrody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule wideo demonstrujemy zastosowanie MEA do specyficznej dla miejsca transfekcji komórek HeLa siRNA o sekwencji scrambled. Jedną z zalet tej technologii jest jej możliwość zastosowania w różnych liniach komórkowych, w tym w liniach pierwotnych. Nasze laboratorium wykazało wcześniej zastosowanie tej technologii do specyficznej dla miejsca transfekcji pierwotnych kultur neuronów hipokampa szczura w 18. dniu embrionalnym (E18) oraz komórek NIH-3T3 sekwencjami scrambled siRNA i plazmidem GFP18, 19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka komórkowa:
Advanced MEM
L-Glutamina 200 mM
Penicylina/Streptomycyna
Płodowa surowica bydlęca		Gibco/Invitrogen
Himedia Laboratories/VWR
Lonza group Ltd.
Gibco/Invitrogen		12492-013
95057-448
09-757F
16000-044		Skład pożywki komórkowej:
2% FBS, 2% L-glutaminy i 2% Pennstrep w Advanced MEM
Trypsyna EDTAMediatech, Inc.25-053-CL
PBSMediatech, Inc.21-040-CV
siRNA o sekwencji scrambled znakowane Alexa 488 i rodamynąQiagen, Inc.1027292
Bufor do elektroporacjiBiorad Laboratories165-2677
Generator przebiegówPragmatic2414AMożna użyć dowolnego generatora przebiegów/impulsów zdolnego do dostarczenia wymaganych impulsów.

Bibliografia

  1. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).
  3. Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  4. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550(2002).
  5. Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
  6. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  7. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  8. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).
  10. Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).
  11. Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
  12. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
  13. Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).
  14. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
  15. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).
  16. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
  17. Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
  18. Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
  19. Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
  20. Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
  21. Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
  22. Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).
  23. Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
  24. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
  25. Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594(2005).
  26. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
  27. Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie siRNAparametry elektroporacjikom rki HeLajodek propidynyCalcium AMobrazowanie fluorescencyjneywotno kom rek

Powiązane artykuły