Artykuł metodologiczny

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

30.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4418

⸱

26 listopada 2012

 ,  , 
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology, CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Paris Diderot University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Streszczenie

Astrocyty tworzą wraz z neuronami synapsy trójdzielne, w których integrują i modulują aktywność neuronalną. W rzeczywistości astrocyty wykrywają sygnały neuronalne poprzez aktywację swoich kanałów jonowych i receptorów neurotransmiterów, a informacje przetwarzają częściowo poprzez zależne od aktywności uwalnianie gliotransmiterów. Ponadto astrocyty stanowią główny system wychwytu glutaminianu, przyczyniając się do przestrzennego buforowania potasu, jak również do usuwania GABA. Komórki te nieustannie monitorują zatem aktywność synaptyczną i są w związku z tym czułymi wskaźnikami zmian w poziomach uwalnianego synaptycznie glutaminianu, GABA oraz potasu pozakomórkowego. Dodatkowo zmiany w aktywności wychwytu astroglialnego lub pojemności buforowej mogą mieć poważny wpływ na funkcje neuronalne i mogą zostać przeoczone podczas charakteryzowania stanów fizjopatologicznych lub myszy z knockautem. Podwójna rejestracja aktywności neuronalnej i astroglialnej jest zatem ważną metodą badania zmian w sile synaptycznej związanych z towarzyszącymi zmianami w astroglialnych możliwościach wychwytu i buforowania. W niniejszej pracy opisujemy, jak przygotować skrawki hipokampa, jak zidentyfikować astrocyty w stratum radiatum oraz jak jednocześnie rejestrować neuronalne i astroglialne odpowiedzi elektrofizjologiczne. Ponadto opisujemy, jak farmakologicznie wyizolować synaptycznie wywołane prądy astroglialne.

Protokół

1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego i roztworu wewnątrzkomórkowego

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór wewnętrzny do rejestracji metodą patch clamp oraz sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do preparacji hipokampa. Ponadto potrzebny będzie zestaw do dysekcji składający się z nożyczek chirurgicznych i precyzyjnych nożyczek irydowych, dwóch szpatułek i pęsety (Fine science tools); szklane urządzenie do napowietrzania (mikrofiltr świecowy, ROBU Germany) i siatkę do tkanek (moskitiera lub gęsta nylonowa siatka), a także superglue (Uhu Dent). Konfiguracja układu do patch clamp na skrawkach tkanek została opisana przez Finkel & Bookman, 20011.
  2. W celu przygotowania roztworu wewnętrznego rozpuścić (w mM): 105 K-glukonianu, 30 KCl, 10 HEPES i 0,3 EGTA w wodzie dejonizowanej (w 70-80% końcowej objętości). Schłodzić roztwór do 4 °C i dodać (w mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris i 10 fosfokreatyny. Dostosować pH do 7,4 za pomocą KOH i uzupełnić wodą dejonizowaną do końcowej objętości (osmolarność: ~ 280 mOsm). Przefiltrować ten roztwór (rozmiar porów 0,2 μm). Alikwoty roztworu są stabilne przez 3-4 tygodnie w temperaturze - 20 °C. Na jeden dzień eksperymentalny potrzeba ~ 1 ml roztworu wewnętrznego.
  3. O ile nie określono inaczej, ACSF stosowany do preparacji hipokampa i rejestracji komórek w obszarze CA1 zawiera (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,3 MgSO4, 1 NaH2PO4, 26,2 NaHCO3 i 11 glukozy. Rozpuścić te sole w wodzie dejonizowanej (osmolarność ~ 320 mOsm) i napowietrzać roztwór przez co najmniej 10 min (pH ~ 7,3 - 7,4) karbogenem (95 % O2 i 5 % CO2). Przygotować co najmniej 1 litr roztworu na jeden eksperyment. Szczególną ostrożność należy zachować przy przygotowaniu tkanki hipokampa, która będzie wykorzystywana do eksperymentów w obszarze CA3 hipokampa. Obszar ten jest bowiem podatny na aktywność epileptiformną i następującą po niej śmierć neuronów. W związku z tym aktywność synaptyczna powinna być silnie zredukowana podczas przygotowania skrawka, co osiąga się poprzez przeprowadzenie dysekcji hipokampa w lodowatym roztworze sacharozy zawierającym (w mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 10 glukozy i 75 sacharozy. W tym roztworze połączenie niskiego stężenia sodu, niskiego stężenia wapnia i wysokiego stężenia magnezu znacznie redukuje impulsację presynaptyczną i prawdopodobieństwo uwalniania neurotransmiterów, a także postsynaptyczną aktywność receptorów NMDA, minimalizując tym samym aktywność spontaniczną i śmierć komórek. Po przygotowaniu, skrawki hipokampa wykorzystywane do rejestracji komórek z obszaru CA3 są perfundowane zmodyfikowanym ACSF, zawierającym 4 mM CaCl2 i 4 MgSO4, aby zminimalizować aktywność polisynaptyczną.

2. Przygotowanie świeżych skrawków hipokampa

  1. Schłodzić ~ 300 ml ACSF do 4 °C dla komory do krojenia oraz do przygotowania próbek, stale natleniając roztwór karbogenem. Przygotować mały zlew z ACSF w temperaturze pokojowej (RT) do przechowywania skrawków, który również jest natleniany karbogenem (Schemat Rysunek 1).
  2. Znakomić mysz pod dyfuzorem, umieszczając w klatce mały ręcznik papierowy nasączony 1 ml izofluranu.
  3. Po głębokim znieczuleniu myszy odciąć głowę i umieścić ją bezpośrednio w małej szalce z lodowatym, natlenionym ACSF. Usunąć skórę głowy małymi nożyczkami i przenieść głowę na podkładkę do kolejnych etapów. Rozpocząć wycinanie hipokampa, zgodnie z ilustracją i opisem na Rysunku 1.
  4. Wyciąć poprzeczne skrawki o grubości 300-400 μm z niską prędkością (3 μm/sec) i częstotliwością drgań 70 Hz w lodowatym, natlenionym ACSF, a następnie przenieść je do komory do przechowywania. Pozostawić skrawki w RT na co najmniej 1 h przed rejestracją. Skrawki do eksperymentów w obszarze CA3 przechowywać przez 25 min w 34 °C i co najmniej 30 min w RT, aby odzyskały homeostazę po procesie krojenia.

3. Podwójna rejestracja wywołanych prądów astroglialnych i neuronalnych potencjałów polowych

Opisujemy tutaj sposób rejestracji astroglialnych i neuronalnych odpowiedzi wywołanych synaptycznie, t.j. odpowiedzi indukowanych aktywacją synaps poprzez stymulację doprowadzającą za pomocą elektrody pozakomórkowej.

  1. Stale perfundować komorę rejestracyjną natlenionym ACSF (1,5–2 ml/min, temperatura pokojowa), zawierającym 100 μM picrotoxiny (GABAA (antagonista), aby wyizolować odpowiedzi pobudzające. Przenieś skrawek na szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną (1,5–3 mg/ml), odessaj nadmiar cieczy, aby zapewnić dobrą adhezję skrawka, i dodaj kroplę ASCF na wierzch skrawka. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze rejestracyjnej. Blokada przekaźnictwa hamującego za pomocą picrotoxyny może prowadzić do wystąpienia aktywności epileptyformnej, t. j. spontaniczne, synchroniczne wyładowania populacji neuronalnych, które zniekształcą pomiar zdarzeń wywołanych. Aby zatem zapobiec aktywności epileptiformnej, należy wykonać płaskie cięcie (tylko powierzchniowe) pomiędzy obszarami CA1 i CA3, aby zapobiec propagacji sygnału poprzez kolaterale Schaffera (jak wskazano w Rycina 2a).
  2. Stratum radiatum Astrocyty można zidentyfikować po niewielkim rozmiarze somy (~ 10 μm) oraz gwiaździstej strukturze wypustek. Należy wybrać komórkę znajdującą się co najmniej 20–30 μm poniżej powierzchni skrawka. Szklaną elektrodę stymulującą (oporność końcówki ~ 1 MΩ) należy zamocować na srebrnym drucie połączonym z izolatorem stymulatora i uziemionym w kąpieli (poprzez owinięcie drugiego srebrnego drutu wokół szklanej pipety). Elektrodę stymulującą należy umieścić w obszarze kolaterali Schaffera, zgodnie z oznaczeniem w Rycina 2A w odległości 200–300 μm od wybranego astrocytu. Zamocuj elektrodę rejestrującą pole (~2–5 MΩ) na srebrnym drucie chlorkowanym, podłączonym do przedwzmacniacza (headstage). Obie elektrody należy wcześniej wypełnić płynem ACSF. W programie MultiClamp wybierz tryb I=0, który wyłącza zewnętrzny sygnał sterujący, a następnie umieść elektrodę w odległości ok. 50 μm od astrocytu wewnątrz stratum radiatum region (Rycina 2A). Rejestruj odpowiedzi przy wzmocnieniu (Gain) od 2 do 10, stosując filtr Bessela o częstotliwości 2 kHz. Wprowadzenie prądu elektrycznego do skrawka mózgu wyzwala potencjały czynnościowe w otaczających aksonach kolateralnych Schaffera i następujące po nich uwalnianie neurotransmiterów w terminalach presynaptycznych projektujących do postsynaptycznych neuronów piramidalnych obszaru CA1. Uwolnione transmitery wywołają napływ ładunku dodatniego do komórek poprzez postsynaptyczne receptory jonotropowe, co jest mierzalne pozakomórkowo jako niewielki potencjał ujemny. Ten polowy potencjał postsynaptyczny pobudzeniowy (fEPSP) integruje aktywność grupy jednocześnie aktywnych neuronów, podczas gdy przekazywanie sygnałów hamujących jest blokowane farmakologicznie. Zastosuj kilka impulsów testowych (trwających 0,1 ms), aby wywołać fEPSP; zmiana położenia elektrody stymulującej może pomóc zwiększyć amplitudę fEPSP. Typowy CA1 stratum radiatum fEPSP przedstawiono na Rycina 2BDalsze szczegóły dotyczące pozycjonowania i przebiegów fal odpowiedzi znajdują się w pracy Yuana i wsp. 20032Amplituda fEPSP w zdrowym skrawku hipokampa powinna być zazwyczaj ponad dwukrotnie większa od amplitudy wolty włókien. W celu dokładnej kwantyfikacji amplitudy lub nachylenia fEPSP odpowiedź wywołana powinna być monosynaptyczna, ponieważ aktywność polisynaptyczna (wykrywalna jako odpowiedź wielowierzchołkowa) wskazuje na aktywność synaptyczną niezależną od stymulacji elektrycznej, co może być oznaką nadpobudliwości. W przypadku eksperymentów przeprowadzanych w obszarze CA3 hipokampa pipety stymulujące i rejestrujące są rozmieszczone zgodnie z ilustracją w Rycina 3CAby jednoznacznie zidentyfikować silnie facylitujące wejścia włókien mszystych, stosuje się stymulację parową (odstęp międzyimpulsowy 50 ms) oraz stymulację z częstotliwością 1 Hz przez kilka sekund, co pozwala na znaczne zwiększenie początkowo niskiej amplitudy wywołanych odpowiedzi fEPSP. Na koniec eksperymentu można wprowadzić DCGIV, antagonistę receptorów mGluR2/3, aby dodatkowo potwierdzić, że stymulowane były rzeczywiście wejścia włókien mszystych. Aplikacja tego antagonisty powinna zredukować fEPSP o ok. 90% ze względu na wysoką ekspresję receptorów mGluR2/3, co hamuje presynaptyczne uwalnianie z pęcherzyków włókien mszystych.
  3. Napełnić pipetę patchową (~ 2-5 MΩ) przefiltrowanym roztworem wewnętrznym i zamocować ją na chlorowanym drucie srebrnym podłączonym do drugiego wzmacniacza przedwzmacniaczowego (headstage), a następnie przyłożyć dodatnie ciśnienie za pomocą strzykawki połączonej przewodem z uchwytem pipety. Stale aplikować impuls testowy o czasie trwania 20 ms i amplitudzie 10 mV, przesuwając pipetę w głąb tkanki, aż do osiągnięcia powierzchni komórki i pojawienia się widocznego odchylenia potencjału błonowego. Wyzerować offset pipety, usunąć dodatnie ciśnienie i ustawić potencjał błony na poziomie -80 mV (clamp). Odczekać do uzyskania gigauszczelnienia (gigaseal) o rezystancji co najmniej 1 GΩ (powinno to zająć nie więcej niż kilka sekund). Delikatne przyłożenie ujemnego ciśnienia może pomóc w uzyskaniu gigauszczelnienia. Przebicie błony komórkowej (break-in) uzyskuje się poprzez krótkie przyłożenie ujemnego ciśnienia lub korzystając z funkcji zap w systemie MultiClamp. Rozpocząć jednoczesny zapis wywołanego fEPSP w kolaterale Schaffera oraz odpowiedzi astroglialnej w trybie voltage clamp (Vhold -80 mV; częstotliwość 0,1 Hz, filtr Bessela 2 kHz, wzmocnienie 10). Odpowiedź prądowa astroocytów ma charakter dwufazowy: najpierw pojawi się szybki, przejściowy prąd wychodzący, odzwierciedlający fEPSP generowane przez sąsiednie komórki piramidalne. Następnie wystąpi powoli rosnący i zanikający prąd wchodzący (utrzymujący się przez kilka sekund (> 10 s) po zakończeniu odpowiedzi neuronalnych). Prąd ten wynika głównie z napływu potasu do astrocytów, następującego po jego uwolnieniu z otaczających, zdepolaryzowanych zakończeń postsynaptycznych. Jednocześnie aktywowany szybki, przejściowy prąd transporterów glutaminianu (GLT), wywołany presynaptycznym uwalnianiem glutaminianu, jest maskowany przez prąd potasowy. Potencjał spoczynkowy astrocytu, a także rezystancja dostępu patcha, powinny być monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu i nie powinny zmieniać się o więcej niż ~ 20%, aby uniknąć nieprawidłowego monitorowania odpowiedzi astroglialnych z powodu zmian w warunkach rejestracji. Tylko astrocyty z początkowym potencjałem spoczynkowym > W celu zbadania zdrowych komórek należy przeanalizować wartość -70 mV.
  4. Przełącz z trybu clampa napięcia na tryb clampa prądu, aby zarejestrować wywołaną depolaryzację błony astrocytarnej. Izoluj prąd glialnego transportera glutaminianu (GLT) poprzez perfuzję kwasu kynurenowego (5 mM), blokera jonotropowych receptorów glutaminianu, aż do pełnego zablokowania fEPSP i osiągnięcia plateau amplitudy GLT. W celu jednoznacznej identyfikacji prądu GLT zastosuj specyficzny antagonista, kwas DL-threo-β-benzyloasparaginowy (DL-TBOA, 200 μM). Zwiększ siłę stymulacji 2- do 5-krotnie, aby zarejestrować odpowiedzi neuronalne i astroglialne przy różnej sile synaptycznej, oraz zastosuj dwa bodźce w krótkim odstępie czasu (interwał 50 msec), aby zbadać odpowiedzi na podwójną stymulację. Stabilność oporu szeregowego oraz potencjału błonowego komórki glialnej powinna być monitorowana przez cały czas trwania rejestracji.
  5. Aby zwizualizować zasięg astroglialnych sieci pośredniczących w złączach szczelinowych, należy przeprowadzić eksperymenty sprzęgania barwnikowego w trybie clamp prądowy, bez wstrzykiwania prądu, aby umożliwić pasywną dyfuzję niskomolekularnych barwników (< 1,5 kDa), takich jak sulforodamina B, poprzez kanały połączeń szczelinowych. Aby zminimalizować wyciek barwnika do otaczającej tkanki, w momencie wnikania w tkankę należy zastosować nadciśnienie za pomocą pipety do patch-clampu, a sam patch należy uzyskać tak szybko, jak to możliwe.

Wyniki

Reprezentatywny jednoczesny zapis odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych (fEPSP) wywołanych synaptycznie w obszarze CA1 hipokampa przedstawiono na Rysunku 2 A-B. Wywołany prąd astroglialny jest dwufazowy, t. j. składa się z przejściowego prądu wychodzącego oraz powoli zanikającego prądu wchodzącego (> 10 s) (Rysunek 2B). Prąd wychodzący odzwierciedla wywołany fEPSP i jest blokowany po zahamowaniu jonotropowych receptorów glutaminianowych przez kwas kynurenowy (ciemnoszara linia, Rysunek 2B)3. Większość powolnego prądu wchodzącego odzwierciedla napływ potasu do astrocytu w następstwie depolaryzacji postsynaptycznej, ponieważ jest on również zniesiony przez kwas kynurenowy, który hamuje aktywność postsynaptycznych jonotropowych receptorów glutaminianowych (Rysunek 2B oraz Rysunek 2C1)3-6, co uznaje się za główne źródło (80 %) uwalniania potasu7. Pozostały, szybko narastający i zanikający prąd wchodzący jest hamowany przez antagonistę GLT DL-TBOA (jasnoszara linia, Rysunek 2B oraz Rysunek 2C2). Post-hoc odjęcie pozostałego powolnego prądu w TBOA (jasnoszara linia) od prądu w kwasie kynurenowym (ciemnoszara linia) pozwala na wyizolowanie czystego prądu transporterów glutaminianu w astroglii (czarna linia), jak zilustrowano na Rysunku 2C2. Trwały, powoli zanikający prąd w kwasie kynurenowym i TBOA (jasnoszara linia, Rysunek 2B oraz Rysunek 2C2) może być zablokowany przez TTX (dane nie przedstawiono) i najprawdopodobniej odzwierciedla akumulację zewnątrzkomórkowego K+ uwalnianego podczas pobudzenia aferentnego presynaptycznego3. Umiarkowana pojedyncza stymulacja kolaterali Schaffera indukuje stosunkowo duży wywołany synaptycznie prąd astroglialny w porównaniu z niewielką wywołaną depolaryzacją zarejestrowaną w tej samej komórce (Rysunek 2D). Wynika to z niskiej oporności błony astrocytów. Rejestracja dynamiki potencjału błony astroglialnej wywołanej synaptycznie, zilustrowana na Rysunku 2D, stanowi bezpośredni pomiar lokalnych poziomów zewnątrzkomórkowego potasu8. Normalizacja wywołanych odpowiedzi astroglialnych do podstawowej aktywności neuronalnej umożliwia bezpośrednie porównanie różnych eksperymentów, co wykazano niedawno6. Prądy astroglialne mogą ponadto bardzo wiarygodnie monitorować zmiany w transmisji pobudzającej, ponieważ całkowity wywołany synaptycznie prąd astroglialny liniowo podąża za wzrostem fEPSP (Rysunek 2E). Prądy astroglialne odzwierciedlają również krótkotrwałą plastyczność synaptyczną, ponieważ – podobnie jak neurony – wykazują one facylitację podwójnego impulsu (Rysunek 2F). Podwójna rejestracja whole-cell z komórki piramidalnej CA1 i astrocytu ujawnia bardzo różny przebieg elektrofizjologiczny obu typów komórek, ponieważ neuron wykazuje potencjały czynnościowe w odpowiedzi na impuls depolaryzujący, podczas gdy sąsiedni astrocyt pozostaje nieaktywny (Rysunek 3A-B). Jednakże umiarkowana stymulacja kolaterali Schaffera może jednocześnie wywołać szybki pobudzający potencjał postsynaptyczny w komórce piramidalnej CA1 oraz szybkie prądy wychodzące i powolne prądy wchodzące w sąsiednim astrocycie (Rysunek 3B2). Podwójne rejestracje odpowiedzi neuronalnych i astroglialnych wywołanych synaptycznie mogą być również prowadzone w obszarze CA3 hipokampa, co pokazano na Rysunku 3C. Rzeczywiście, pojedyncza stymulacja włókien mszystych CA3 wywołuje w warunkach bazowych bardzo małe odpowiedzi neuronalne, rejestrowane jako lokalne fEPSP, powiązane z małymi, szybkimi prądami wychodzącymi i powolnymi prądami wchodzącymi w astrocytach (Rysunek 3D1). W przeciwieństwie do tego, stymulacja włókien mszystych CA3 z częstotliwością 1 Hz przez kilka sekund silnie potęguje fEPSP, podczas gdy odpowiedź astroglialną zwiększa jedynie umiarkowanie (Rysunek 3D2).

Proces renowacji zęba; wiele etapów, seria zdjęć, układ eksperymentalny, wypełnianie ubytku.
Rycina 1. Izolacja hipokampa w celu przygotowania przekrojów poprzecznych. Aby wypreparować mózg, należy przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej (a). Wykonać cięcie wieńcowe na poziomie opuszki węchowej (b), a następnie na poziomie móżdżku (c). Ostrożnie usunąć czaszkę za pomocą pęsety (d), rozdzielić obie półkule skalpelem (e) i przenieść je małą łyżeczką do zimnego, natlenionego roztworu ACSF (f). Po ok. 5 min równoważenia, umieścić jedną półkulę na suchej chusteczce powierzchnią przyśrodkową do góry (g). Za pomocą dwóch łyżeczek usunąć wzgórze i podwzgórze (h-j). Hipokamp jest teraz widoczny, co zilustrowano liniami przerywanymi (k). Wypreparować hipokamp łyżeczką, zaczynając od kątora, widocznego jako biała struktura (l-m). Przenieść hipokamp z powrotem do zimnego roztworu ACSF. Przygotować mały blok agarozy, ułożyć oba hipokampy stroną alveus do góry, a brzuszną częścią hipokampa skierowaną ku krawędzi bloku agarowego, a następnie ostrożnie odsączyć cały nadmiar cieczy, aby zapewnić dobre przyleganie do agaru (n). Przykleić hipokamp przymocowany do bloku agarowego do części brzusznej (o).

Analiza prądu astrocytarnego; schemat ze śladami elektrofizjologicznymi; fEPSP, potencjał błonowy.
Rycina 2. Symultaniczne odpowiedzi neuronalne i astroglialne wywołane synaptycznie w obszarze CA1 hipokampa. A) Schemat skrawka hipokampa ilustrujący rozmieszczenie elektrody stymulującej, służącej do aktywacji kolaterali Schaffera (SC), elektrody pipety patch, służącej do rejestracji prądów astrocytarnych, oraz elektrody zewnątrzkomórkowej, służącej do rejestracji fEPSP wywołanych stymulacją SC w obszarze CA1 hipokampa. B) Reprezentatywne ślady symultanicznych rejestracji fEPSP (panel górny) i prądów astrocytarnych (panel dolny) wywołanych synaptycznie stymulacją SC w obecności leków farmakologicznych. Odpowiedzi rejestrowano najpierw w obecności blokera receptorów GABAA (pikrotoksyna, 100 μM, ślady czarne), aby wyizolować odpowiedzi pobudzające. Następne zastosowanie blokera jonotropowych receptorów glutaminianu (kwas kynurenowy, 5 mM, ślady ciemnoszare) hamuje fEPSP oraz główną część długotrwałego prądu astroglialnego, odsłaniając małą i szybką komponentę przejściową odpowiedzi prądowej astrocytów, która jest wrażliwa na bloker transportera glutaminianu (TBOA, 200 μM, ślady jasnoszare). Skala: fEPSP 0,1 mV, prąd astrocytarny 15 pA, 10 msec. C1) Przykładowy ślad potasowego prądu astroglialnego (1-2), który można wyizolować z odpowiedzi wywołanej przedstawionej w B (panel dolny, ślad czarny), poprzez odjęcie komponenty prądu pozostającej w kwasie kynurenowym (2) od prądu całkowitego (1). Skala: 20 pA, 1 sec. C2) Przykładowy ślad prądu transportera glutaminianu (2-3), otrzymany poprzez odjęcie niewrażliwej na TBOA powolnej komponenty (3) od prądu w kwasie kynurenowym (2). Skala: 2,5 pA, 25 msec. D) Przykładowe ślady prądu wewnątrzkomórkowego rejestrowanego w trybie voltage-clamp (panel dolny) oraz odpowiadającej mu depolaryzacji błony rejestrowanej w trybie current-clamp (panel górny) indukowanej w astrocycie przez stymulację SC. Skala: current-clamp 1,5 mV, voltage-clamp 5 pA, 1 sec. E) Krzywe wejście-wyjście ilustrujące zależność między salwami włókien presynaptycznych (wejście) a całkowitym prądem astroglialnym (wyjście) rejestrowanym symultanicznie w odpowiedzi na stymulację SC (n = 6). Prąd astroglialny wzrasta liniowo wraz ze wzrostem liczby salw włókien, podobnie jak neuronalne fEPSP. F) Przedstawiono przykładowe ślady odpowiedzi neuronalnej (fEPSP) i prądu astrocytarnego dla stymulacji podwójnym impulsem przy odstępie międzyimpulsowym wynoszącym 40 msec. Wywołany synaptycznie prąd astroglialny wykazuje, podobnie jak neurony, facylitację przy stymulacji podwójnym impulsem. Skala: 0,1 mV, 5 pA, 20 msec.

Prądy neuronalne i astrocytarne, fEPSP, układ elektrofizjologiczny, schemat skrawka hipokampa.
Rysunek 3. Podwójne rejestracje odpowiedzi neuronalnych i astroglialnych indukowanych synaptycznie w obszarach CA1 i CA3 hipokampa. A) Rekonstrukcja komórki piramidalnej CA1 wstrzykniętej sulforodaminą B (czerwony, 0,1 %) oraz astrocytu wypełnionego dekstranem fluoresceinowym (zielony, 0,1 %), z wykorzystaniem techniki whole-cell patch-clamp. Pasek skali, 10 μm. B1) Reprezentatywne przebiegi jednoczesnych rejestracji whole-cell potencjałów błonowych w trybie current-clamp z komórki piramidalnej CA1 i sąsiedniego astrocytu. Wytwarzanie potencjałów czynnościowych neuronu (linia czarna), wywołane wstrzyknięciem depolaryzującego impulsu prądowego 20 pA, nie wywołuje odpowiedzi w sąsiednim astrocycie (linia szara). Pasek skali, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B2) Przykładowe przebiegi podwójnych rejestracji whole-cell z komórki piramidalnej CA1 w trybie current-clamp i sąsiedniego astrocytu w trybie voltage-clamp po stymulacji SC w obecności picrotoxiny (100 μM). Stymulacja SC wywołuje pobudzający potencjał postsynaptyczny (EPSP, linia czarna), powiązany z niewielkim i długotrwałym prądem astrocytarnym (linia szara). Pasek skali, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Schemat skrawka hipokampa przedstawiający w obszarach zakrętu zębatego (DG) i CA3 rozmieszczenie elektrody stymulującej, służącej do aktywacji włókien mszystych, elektrody pipety patch (szara), służącej do rejestracji prądów astrocytarnych, oraz elektrody zewnątrzkomórkowej, służącej do rejestracji fEPSP wywołanych stymulacją włókien mszystych CA3. D, E) Reprezentatywne przebiegi parzystych rejestracji fEPSP w CA3 (panele górne, linie czarne w D1 i D2) oraz odpowiedzi whole-cell astrocytów (panele dolne, linie szare w D1 i D2) na pojedynczą stymulację włókien mszystych CA3 przy częstotliwości 0,02 Hz (powiększenie we wkładce) (D1) lub przy częstotliwości stymulacji 1 Hz (D2). Pasek skali dla D1 i D2, 0,2 mV, 15 pA, czas: D1 1 sec; D2 100 msec. Pasek skali we wkładce, 0,1 mV, 100 msec.

Dyskusja

Podwójna rejestracja indukowanych synaptycznie odpowiedzi neuronalnych i glejowych jest użyteczną metodą badania zmian zachodzących w czasie rzeczywistym w aktywnościach przed- i postsynaptycznych związanych ze zmianami właściwości astroglii. Synaptycznie wywołana depolaryzacja błony glejowej jest bezpośrednią miarą wzrostu stężenia potasu pozakomórkowego8, wynikającego częściowo z wyzwalania potencjałów czynnościowych presynaptycznych, ale głównie z depolaryzacji postsynaptycznej 7. Dlatego rejestracja dynamiki potencjału błony glejowej może być wykorzystywana do badania modyfikacji pobudliwości presynaptycznej, aktywności postsynaptycznej, objętości przestrzeni pozakomórkowej oraz zdolności buforowania potasu6, 8. Prąd transporterów glutaminianu w astroglii jest czułą miarą presynaptycznego uwalniania glutaminianu, umożliwiającą monitorowanie krótkoterminowych zmian w prawdopodobieństwie uwalniania3, 5, 9. Może on ponadto służyć do charakteryzacji funkcjonalnych oddziaływań synapsa-glej w różnych synapsach lub na różnych etapach rozwoju10. Należy podkreślić, że GLT są wysoce wrażliwe na temperaturę11 i są napędzane gradientem elektrochemicznym Na+, K+ i H+12. Zatem amplituda i kinetyka prądu GLT w dużym stopniu zależą od wybranych warunków eksperymentalnych. Co więcej, wiadomo, że rzeczywisty przebieg czasowy oczyszczania glutaminianu przez astroglzię, wyprowadzony z zarejestrowanego prądu GLT, jest częściowo zamaskowany. Wynika to z filtrowania prądów GLT przez czynniki takie jak właściwości elektrotoniczne astrocytów lub asynchroniczne uwalnianie przekaźników, które zniekształcają ich kinetykę13. Opracowano metody wyodrębniania cech czasowych mechanizmów filtrowania, które mogą być wykorzystane do wyznaczenia rzeczywistego przebiegu czasowego oczyszczania glutaminianu w sytuacjach fizjologicznych lub patologicznych, co zostało wykonane niedawno6,13,14. Dodatkowo jednoczesna rejestracja depolaryzacji błony astrogljalnej w trybie clamp prądowy może dostarczyć informacji o możliwych zmianach przejściowych stężeń potasu pozakomórkowego. Pojedyncze astrocyty kontaktują się z maksymalnie 100 000 synaps około 100 różnych neuronów, przez co integrują i modulują aktywność lokalnych sieci neuronalnych.

Stosując zaprezentowaną tutaj technikę, tzn. rejestrując elektrofizjologiczne odpowiedzi całego komórki (whole-cell) astrocytów w celu uzyskania wglądu w podstawową aktywność synaptyczną, należy pamiętać, że w astrocytach rejestracje patch-clamp na poziomie somy pozwalają na wykrycie prądów pochodzących głównie z somy komórki lub procesów proksymalnych. W rzeczywistości prądy wykrywane w somie pochodzą tylko częściowo z drobnych procesów dystalnych, chyba że silna aktywacja receptorów i kanałów występująca w wielu drobnych procesach wygeneruje prądy propagujące do somy komórki. Zatem podstawowa aktywność receptorów i kanałów w poszczególnych małych procesach astroglialnych pokrywających przedziały synaptyczne jest trudna do wykrycia. Wynika to w części z ograniczonej przestrzennej i czasowej kontroli prądów i napięć błonowych podczas rejestracji patch-clamp całego komórki z astrocytów in situ. Należy jednak zauważyć, że powierzchnia licznych, maleńkich procesów astrocytarnych znacznie przekracza powierzchnię błony somy i procesów głównych. Ponadto te perisynaptyczne mikrodomeny astroglialne zawierają funkcjonalnie istotne receptory i kanały, które prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w komunikacji neuroglealnej i regulacji synaptycznej. Przedstawiona tutaj technika jest zatem przydatna głównie do badania astrocytarnej integracji synchronicznej aktywności zespołów neuronalnych, występującej w szczególności podczas stymulacji doprowadzającej. Nie powinna być ona stosowana do badania dialogu między pojedynczymi synapsami a sąsiadującymi drobnymi procesami astrocytarnymi podczas podstawowej aktywności spontanicznej. Alternatywną metodą badania lokalnych odpowiedzi astroglialnych indukowanych przez podstawową aktywność synaptyczną byłoby przeprowadzenie rejestracji patch-clamp z drobnych procesów, tak jak robi się to w przypadku dendrytów15. Chociaż tworzenie uszczelnienia (patching) tych drobnych procesów astroglialnych jest prawdopodobnie trudne ze względu na ich niewielki rozmiar, stanowi to prawdopodobnie kierunek badań pozwalający na odkrycie bardziej intymnego dialogu między mikrodomenami astroglialnymi a pojedynczymi synapsami. Jednakże prawdopodobnie niewielkie elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialne wynikające z pojedynczych drobnych procesów astroglialnych mogą znajdować się poniżej progu detekcji, ponieważ szum elektryczny w rejestracjach patch-clamp osiąga średnio 3-5 pA. Inną metodą badania odpowiedzi astroglialnych na aktywność synaptyczną jest obrazowanie wapnia, ponieważ aktywacja receptorów lub transporterów błonowych astrocytów przez substancje neuroaktywne może wywołać wewnątrzkomórkowe przejściowe wzrosty stężenia wapnia. Jednak masowe ładowanie astrocytów wskaźnikami wapnia może również odzwierciedlać głównie aktywność somatyczną16. Połączenie elektrofizjologii i obrazowania wapnia umożliwia również wykrywanie niewielkich sygnałów wapniowych z drobnych procesów astroglialnych, występujących spontanicznie lub wywołanych minimalną stymulacją synaptyczną17, 18. Należy jednak pamiętać, że wysokoadzyjne wskaźniki wapnia mogą działać jak bufory wapnia, hamując ważne ścieżki sygnałowe wapnia, podczas gdy wskaźniki niskoadzyjne mogą działać poniżej poziomu detekcji. Wreszcie elegancką i nieinwazyjną techniką badania zdarzeń wapniowych w drobnych procesach astrocytarnych, która pozwala również uniknąć wypłukania wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych podczas patch-clamp całego komórki, jest zastosowanie ukierunkowanego na błonę sensora wapnia, który może być ekspresowany w astrocytach in situ, a także in vivo19. Niemniej jednak obrazowanie wapnia może dostarczyć informacji tylko o jednej cząsteczce sygnałowej, która uczestniczy w wielu, ale nie we wszystkich aktywnościach komórkowych, podczas gdy patch-clamp całego komórki dostarcza ilościowych informacji o wszystkich różnych prądach jonowych wywołanych aktywacją kanałów i receptorów. Dlatego jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne z neuronów i astrocytów są wyjątkową i potężną metodą odkrywania w czasie rzeczywistym dynamiki neuroglealnego sygnałowania jonowego i jego roli w przetwarzaniu informacji w mózgu.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Danie Kamalidenovej, Morganowi Autexierowi i Rochowi Chopierowi za przygotowanie filmu i animacji, a także Florianowi Beckowi za fotografie i postprodukcję lektora do filmu. Praca ta była sponsorowana przez Olympus i wspierana grantami z HFSPO (Career Development Award), ANR (Programme Jeunes chercheurs i Programme Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM oraz szpitala La Pitié Salpêtrière (umowa o badaniach translacyjnych) dla N.R., stypendiami podoktorskimi z francuskiego Ministerstwa Nauki i Deutsche Forschungsgemeinschaft dla U.P., a także stypendiami doktoranckimi szkoły doktorskiej „Frontiers in Life Science” Uniwersytetu Paryż Diderot, fundacji Bettencourt Schuller oraz FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) dla J.S.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PikrotoksynaSigmaP1675rozpuścić w DMSO
Kwas kynurenowyTocris0223rozpuścić w temperaturze 34 °C przy mieszaniu lub sonikacji
DL-TBOATocris1223DCG IV Tocris 0975

Bibliografia

  1. Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
  2. Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
  3. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  4. Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
  5. Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
  6. Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
  7. Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
  8. Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
  9. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
  10. Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
  11. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
  12. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
  15. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
  16. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
  17. Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  18. Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
  19. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odpowiedzi astroglialne i neuronalnepr dy wywo ane synaptycznietechnika patch clamprejestracja potencja w polowychastrocyty warstwy promienistejanaliza wychwytu glutaminianuocena buforowania potasupomiar uwalniania gliotransmiter w

Powiązane artykuły