Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Francois P. Legoux; James J. Moon

doi:10.3791/4420

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4420

⸱

22 października 2012

Francois P. Legoux¹ , James J. Moon¹

¹Center for Immunology and Inflammatory Diseases, and Pulmonary and Critical Care Unit, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Streszczenie

Podstawową potrzebą badaczy studiujących odporność adaptacyjną w modelach eksperymentalnych in vivo jest zdolność do identyfikacji limfocytów T na podstawie specyficzności ich receptora antygenowego (TCR). Dostępnych jest wiele metod pośrednich, w których populacja limfocytów T jest stymulowana in vitro specyficznym antygenem, a limfocyty T specyficzne dla epitopu są identyfikowane poprzez pomiar odpowiedzi funkcjonalnej, takiej jak proliferacja, produkcja cytokin lub ekspresja markerów aktywacji¹. Metody te pozwalają jednak na zidentyfikowanie jedynie tych limfocytów T specyficznych dla epitopu, które wykazują jedną z wielu możliwych funkcji, i nie są one wystarczająco czułe, aby wykryć limfocyty T specyficzne dla epitopu o częstotliwościach charakterystycznych dla prekursorów naiwnych. Popularną alternatywą jest model adoptywnego transferu z użyciem myszy transgenicznych TCR, w którym monoklonalne limfocyty T pochodzące od myszy transgenicznej TCR są wprowadzane do histokompatybilnych biorców w celu stworzenia dużej populacji prekursorów limfocytów T specyficznych dla epitopu, które można łatwo śledzić przy użyciu przeciwciała przeciwko markerowi kongenicznemu^2,3. Choć skuteczna, metoda ta obarczona jest artefaktami eksperymentalnymi związanymi z niefizjologiczną częstotliwością występowania limfocytów T o specyficzności względem pojedynczego epitopu^4,5. Ponadto system ten nie może być wykorzystany do badania heterogeniczności funkcjonalnej klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu w obrębie populacji poliklonalnej.

Idealny sposób badania odporności adaptacyjnej powinien obejmować bezpośrednią detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu z endogennego repertuaru limfocytów T, przy użyciu metody, która rozróżnia specyficzność TCR wyłącznie na podstawie wiązania z kognatywnymi kompleksami peptyd:MHC (pMHC). Zastosowanie tetramerów pMHC oraz cytometrii przepływowej pozwala na osiągnięcie tego celu⁶, jednak metoda ta ogranicza się do detekcji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o wysokiej częstotliwości, które występują jedynie po antygenowo indukowanej ekspansji klonalnej. W niniejszym protokole opisujemy metodę, która koordynuje wykorzystanie tetramerów pMHC oraz technologii magnetycznego wzbogacania komórek, aby umożliwić detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu o ekstremalnie niskiej częstotliwości z tkanek limfatycznych myszy^3,7. Dzięki tej technice można kompleksowo śledzić całe populacje endogennych limfocytów T specyficznych dla epitopu u myszy na wszystkich etapach odpowiedzi immunologicznej.

Protokół

1. Izolacja komórek z tkanki limfatycznej

Do szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej mały kwadrat nylonowej siatki o oczkach 100 μm dodać 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen/strep, gentamycyna, 2 mM L-glutaminy, 55 mM 2-merkaptoetanolu) lub innego równoważnego medium dla limfocytów T i umieścić na lodzie.
Uśmiercić mysz.
Usunąć śledzionę oraz jak największą liczbę łatwo dostępnych węzłów chłonnych. Powinny one obejmować co najmniej węzły chłonne pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe. Umieścić je na nylonowej siatce w szalce hodowlanej.
Używając płaskiej góry zamkniętej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, delikatnie rozgnieść tkankę limfatyczną na nylonowej siatce, aby uwolnić limfocyty. Dodać kolejny 1 ml cEHAA i pipetować w górę i w dół, aby wprowadzić komórki w zawiesinę. Przenieść komórki przez kolejny fragment nylonowej siatki umieszczonej nad probówką wirówkową z polipropylenu o pojemności 15 ml. Przepłukać szalkę i siatkę kolejnym 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA, łącząc objętości w tej samej probówce. Powtórzyć czynność, aby uzyskać końcową objętość zawiesiny komórkowej wynoszącą 4 ml.
Dodać zimny bufor do sortowania (PBS + 2% FBS, 0,05% azydku) do końcowej objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspender pellet komórkowy w bloku Fc (bufor do sortowania + przeciwciało 2.4G2) do końcowej objętości wynoszącej w przybliżeniu dwukrotność objętości samego pelletu. Na przykład śledziona i węzły chłonne naiwnej myszy zazwyczaj dają pellet komórkowy o objętości około 100 μl. W takim przypadku dodać 100 μl bloku Fc, aby zwiększyć objętość do 200 μl. Jeśli doszło do znacznego skupiania się komórek, na tym etapie ostrożnie usunąć skupisko komórek końcówką pipety.

2. Barwienie tetramerami

Dodać tetramer pMHC znakowany PE lub APC do stężenia końcowego 10 nM (lub stężenia zoptymalizowanego empirycznie).
Wymieszać i inkubować przez 1 hr w temperaturze pokojowej (lub w czasie i temperaturze zoptymalizowanych empirycznie).
Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i odwirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Od tego momentu przechowywać próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować pellet komórkowy w buforze do sortowania do objętości końcowej 200 μl. W przypadku podwójnego wzbogacenia tetramerem resuspendować do objętości końcowej 150 μl.

3. Wzbogacanie magnetyczne

Dodać 50 μl mikrokulek Miltenyi anti-PE lub anti-APC. W przypadku wzbogacenia podwójnym tetramerem dodać po 50 μl obu rodzajów.
Wymieszać i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.
Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.
W czasie oczekiwania przygotować kolumnę magnetyczną Miltenyi LS na magnesie MidiMACS lub QuadroMACS. Umieścić otwartą polipropylenową probówkę wirówkową o objętości 15 ml w statywie bezpośrednio pod kolumną.
Dodać 3 ml buforu do sortowania na górze kolumny, pozwalając mu spłynąć do probówki 15 ml.
Umieścić kwadrat z nylonowej siatki o oczkach 100 μm na górze kolumny.
Po zakończeniu wirowania komórek ostrożnie odessać supernatant i resuspendować osad w 3 ml buforu do sortowania.
Przenieść zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę na górę kolumny.
Gdy zawiesina komórkowa całkowicie spłynie do kolumny, przepłukać pierwotną probówkę kolejnymi 3 ml buforu do sortowania i przenieść bufor przez nylonową siatkę do kolumny, płucząc przy tym siatkę. Usunąć siatkę nylonową.
Gdy bufor całkowicie spłynie do kolumny, dodać do niej kolejne 3 ml buforu do sortowania.
Powtórzyć krok 10, aby uzyskać łącznie 3 płukania po 3 ml.
Zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją nad nową polipropylenową probówką wirówkową o objętości 15 ml.
Dodać 5 ml buforu do sortowania do kolumny.
Natychmiast włożyć tłok do górnej części kolumny i jednym ciągłym ruchem docisnąć go do końca, wypychając bufor z kolumny do probówki.
Wirować probówki zawierające eluowaną frakcję związaną oraz przepuszczoną frakcję niezwiązaną przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.
Ostrożnie odessać supernatant z frakcji związanej, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować osad komórkowy w buforze do sortowania do końcowej objętości dokładnie 95 μl. Odessać i resuspendować frakcję niezwiązaną do końcowej objętości 2 ml.

4. Cytometria przepływowa

Z każdej frakcji odbiór 5 μl i przenieść do 200 μl kulek zliczających (o stężeniu dostosowanym do 200,000/ml w buforze do sortowania) w probówce FACS o pojemności 5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy. Aby zaoszczędzić czas, kulki można rozdzielić do oznakowanych probówek przed rozpoczęciem eksperymentu.
Przygotować master mix przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych na komórkach (Tabela 1). W celu oszczędności czasu można to zrobić przed rozpoczęciem eksperymentu.
W przypadku frakcji związanej dodać dawkę koktajlu przeciwciał bezpośrednio do ~90 μl komórek w probówce. Jeśli planowana jest analiza frakcji niezwiązanej, przenieść 90 μl komórek do probówki FACS 5 ml i dodać dawkę koktajlu przeciwciał.
Przygotować panel jednobarwnych kontroli kompensacji do cytometru przepływowego. Dla każdego użytego fluorochromu zmieszać 50 μl pozostałych komórek z frakcji niezwiązanej w probówce FACS 5 ml z 1 μl przeciwciała anty-CD4 skoniugowanego z odpowiednim fluorochromem. Należy pamiętać o przygotowaniu również kontroli niebarwionej.
Wymieszać na wortexie i inkubować wszystkie próbki przez 30 min w temperaturze 4 °C.
Do każdej probówki dodać 5 ml buforu do sortowania i wirować przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
W przypadku frakcji związanej ostrożnie odessać nadsącz i resuspender komórki w 200 μl buforu do sortowania. Przenieść komórki do mikroprobówki FACS 1,2 ml. Przepłukać probówkę kolejnymi 200 μl buforu do sortowania i połączyć w tej samej mikroprobówce. Jeśli widoczne są agregaty komórkowe, przepuścić komórki przez filtr 50 μm.
W przypadku frakcji niezwiązanej oraz kontroli kompensacji odlać lub odessać nadsącz i resuspender w 2 ml buforu do sortowania.
Ustawić cytometr przepływowy, korzystając z jednobarwnych kontroli kompensacji. Jako dodatkowy rejestrowany parametr wybrać szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W).
Przeanalizować zabarwione próbki, stosując sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu identyfikacji limfocytów T CD4+ lub CD8+, zgodnie z ilustracją na Rysunkach 1 i 2. Dla frakcji związanych zebrać jak najwięcej komórek, do maksymalnie 2,000,000 zdarzeń całkowitych. Dla frakcji niezwiązanych zebrać 1,000,000 zdarzeń całkowitych. Utrzymywać tempo akwizycji na poziomie 3,000 zdarzeń na sekundę lub niższym.
Przy tych samych ustawieniach urządzenia przeanalizować próbki z kulkami zliczającymi. Zebrać 10,000 zdarzeń całkowitych.
Zapisywać wszystkie dane jako pliki FCS.

5. Analiza danych

Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek z koralikami liczącymi, korzystając z oprogramowania FlowJo. Przedstaw rozrzut przedni (forward scatter) w funkcji FITC i ustaw bramkę wokół koralików liczących (patrz Ryciny 1 i 2). Określ całkowitą liczbę koralików liczących wykrytych w każdej próbce. Odejmij tę wartość od całkowitej liczby zebranych zdarzeń, aby wyznaczyć liczbę zebranych zdarzeń komórkowych.
Oblicz całkowitą liczbę wszystkich komórek w każdej próbce, stosując równania opisane w Ramce 1.
Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek frakcji związanej i niezwiązanej po barwieniu. Ustaw sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu zidentyfikowania limfocytów+, komórek o niskiej szerokości rozrzutu bocznego (side-scatter-width^lo), dump-, CD3+, CD4+ lub CD8+, tetramer+ T w każdej próbce, zgodnie z ilustracją na Ryciniach 1 i 2.
Pomnóż całkowitą liczbę komórek w próbce przez częstotliwości każdej z bramek inkluzyjnych użytych do zdefiniowania komórek CD4+tetramer+ lub CD8+tetramer+, aby obliczyć całkowitą liczbę limfocytów T specyficznych dla epitopu (Ramka 1).