Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Yoray Sharon; Lina Alon; Sarah Glanz; Charlotte Servais; Neta Erez

doi:10.3791/4425

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

35.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4425

⸱

14 stycznia 2013

Yoray Sharon¹ , Lina Alon¹ , Sarah Glanz¹ , Charlotte Servais¹ , Neta Erez¹

¹Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Streszczenie

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) stanowią najliczniejszy typ komórek w zrębie guza wielu nowotworów, w szczególności w raku piersi, a ich znaczna obecność często wiąże się ze złym rokowaniem^1,2. CAFs są aktywowaną subpopulacją fibroblastów zrębowych, z których wiele wykazuje ekspresję markera miofibroblastów α-SMA³. CAFs wywodzą się z lokalnych fibroblastów tkankowych, a także z komórek pochodzących z szpiku kostnego rekrutowanych do rozwijającego się guza, przyjmując fenotyp CAF pod wpływem mikrośrodowiska nowotworowego⁴. Wykazano, że CAFs wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację komórek nowotworowych, angiogenezę oraz inwazję^5-8. Udowodniliśmy, że CAFs nasilają wzrost guza poprzez pośredniczenie w zapaleniu promującym nowotwór, zaczynając od najwcześniejszych etapów przednowotworowych⁹. Pomimo rosnących dowodów na kluczową rolę CAFs w ułatwianiu wzrostu guza, badanie tych komórek pozostaje wyzwaniem ze względu na brak specyficznych markerów CAF oraz ogromną heterogeniczność tych komórek, przy czym w mikrośrodowisku guza współistnieje wiele podtypów¹⁰. Ponadto badanie fibroblastów in vitro jest utrudnione przez fakt, że ich profil ekspresji genów często ulega zmianie w hodwlach tkankowych^11,12. Aby rozwiązać ten problem i umożliwić obiektywne profilowanie ekspresji genów fibroblastów z tkanki świeżej myszy i człowieka, opracowaliśmy metodę opartą na wcześniejszych protokołach sortowania komórek metodą fluorescencji (FACS)^13,14. Nasze podejście polega na wykorzystaniu PDGFRα jako markera powierzchniowego do izolacji fibroblastów z tkanki świeżej myszy i człowieka. PDGFRα jest obficie ekspresowany zarówno przez normalne fibroblasty, jak i przez CAFs^9,15. Metoda ta pozwala na izolację czystych populacji normalnych fibroblastów i CAFs, w tym, ale nie ograniczając się do, aktywowanych miofibroblastów α-SMA+. Izolowane fibroblasty mogą być następnie wykorzystane do charakterystyki i porównania ewolucji ekspresji genów, która zachodzi w CAFs podczas tumorigenzy. Rzeczywiście, my oraz inni autorzy zgłosiliśmy profilowanie ekspresji fibroblastów izolowanych poprzez sortowanie komórek¹⁶. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do izolacji i profilowania silnie wzbogaconych populacji fibroblastów z tkanek skóry, gruczołów mlekowych, trzustki i płuc. Ponadto nasza metoda pozwala również na hodowlę sortowanych komórek w celu przeprowadzenia eksperymentów funkcjonalnych i uniknięcia kontaminacji komórkami nowotworowymi, co często stanowi dużą przeszkodę przy próbach hodowli CAFs.

Protokół

1. Disekcja tkanki gruczołu mlekowego lub skóry myszy

Przed wypreparowaniem pożądanej tkanki z myszy należy przygotować następujące materiały i odczynniki:

Materiały:
- Narzędzia chirurgiczne (umyte detergentem, a następnie zanurzone w 70% etanolu).
- Powierzchnia styropianowa do ułożenia myszy podczas sekcji.
- Szpilki lub igły do unieruchomienia myszy podczas sekcji.
- Szklany słoik z pokrywką do trawienia, zawierający magnetyczny mieszadło (autoklawowany).
- Kąpiel wodna w temperaturze 37 °C, zawierająca zanurzalne mieszadło magnetyczne i wystarczającą ilość wody, aby słoik do trawienia był całkowicie zanurzony podczas ustawienia go na mieszadle.
Odczynniki:
- Bufor FACS I (4 °C): Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF (bez wapnia i magnezu) + 0.5% BSA
- Roztwór kolagenazy (przygotowany bezpośrednio przed użyciem):
  0.05 g Kolagenazy II
  0.05 g Kolagenazy IV
  0.01 g Deoksrybonukleazy
  20 ml buforu FACS I. Roztwór kolagenazy należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.
- PharmLyse (odczynnik lityczny z chlorkiem amonu).
- Bufor FACS II: Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF + 1% FCS.
Wypreparowanie gruczołów mlekowych (patrz również¹⁷).
- Eutanazję samic myszy przeprowadzić poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (CO₂).
- Na powierzchni styropianowej ułożyć mysz na grzbiecie i mocno przybić wszystkie cztery kończyny za pomocą igieł 25 G (Rycina 1A). Myszy obficie spryskać 70% etanolem.
- Za pomocą pęsety unieść skórę brzuszną w linii środkowej i wykonać niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami.
- Zacząwszy od nacięcia, rozciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jamy brzusznej lub klatki piersiowej.
- Rozciąć skórę na tylnych łapach od nacięcia w linii środkowej w kierunku łapy, tworząc kształt litery „Y”.
- Odciągnąć skórę od ciała myszy i przybić ją, odsłaniając gruczoły mlekowe przymocowane do wewnętrznej strony skóry (Rycina 1B).
- Użyć patyczków higienicznych do delikatnego oddzielenia gruczołów mlekowych od skóry, jednocześnie przecinając tkankę łączną małymi, ostrymi nożyczkami, aby oddzielić gruczoł mlekowy w kierunku kręgosłupa myszy.
- Do niniejszego protokołu najlepiej nadają się gruczoły brzuszne (#4, 5). Można również użyć 2^go gruczołu mlekowego, należy jednak pamiętać, że gruczoły te znajdują się anatomicznie w bliskim sąsiedztwie mięśnia piersiowego, który może być trudny do oddzielenia, co może prowadzić do uzyskania komórek z mieszanych tkanek.
- Uwaga: Podczas wypreparowywania tkanki nowotworowej zaleca się usunięcie obszarów martwiczych.
Wypreparowanie tkanki skórnej: Najprostszym sposobem na uzyskanie tkanki skórnej bez konieczności usuwania sierści jest wykorzystanie uszu myszy. Jeśli wymagana jest większa ilość tkanki, można ogolić tułów myszy i wypreparować skórę.
- Eutanazję myszy przeprowadzić poprzez inhalację CO₂.
- Za pomocą ostrych nożyczek odciąć oba uszy i natychmiast umieścić je w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość (~0.5 ml) PBS w lodzie.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek gruczołu mlekowego/skóry

Umieścić gruczoły mlekowe/skórę w pojemniku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie. Jeśli tkanka jest zakrwawiona, przemyć ją dwukrotnie PBS, a następnie odlać nadmiar PBS.
Dokładnie posiekać za pomocą zakrzywionych nożyczek.
Dodać 20 ml roztworu kolagenazy (Uwaga: taka ilość roztworu kolagenazy pozwoli na efektywną dysocjację około 5 g tkanki gruczołu mlekowego lub nowotworowej oraz uszu z maksymalnie 15 myszy).
Natychmiast umieścić na mieszadle w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 15 min przy średniej prędkości mieszania.

Uwaga: optymalne czasy inkubacji mogą się różnić w przypadku trawienia innych tkanek.

Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 30 ml zimnego DMEM + 10% FCS.
Mieszaninę tkanki i medium należy przefiltrować przez sitko komórkowe 70 μm umieszczone na probówce stożkowej 50 ml.
Probówkę stożkową wiruje się przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.

3. Lizy erytrocytów

Uwaga: ten krok nie jest konieczny, jeśli przed uśmierceniem myszy przeprowadzono perfuzję serca roztworem PBS.

Odssać nadsącz za pomocą pipety szklanej podłączonej do próżni, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
W celu lizy RBC zawiesić ponownie osad komórkowy w 10 ml roztworu PharmLyse i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
Zneutralizować roztwór PharmLyse, dodając około 40 ml buforu FACS I.
Wirować probówkę stożkową z komórkami przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.
Odssać nadsącz.

4. Blokowanie endogennego Fc

Opcjonalnie: przeprowadź zliczanie komórek, aby określić odpowiednią objętość dla kolejnych etapów.
Resuspenduj komórki w 1-3 ml buforu FACS I (zależnie od liczby komórek oraz ilości przeciwciał, którą zamierzasz zastosować).
Dodaj FcBlock (anty-mysie CD16/CD32) do uzyskania rozcieńczenia 1:50 (10 μg/ml) i inkubuj na lodzie przez 10-20'.
Nie ma potrzeby wypłukiwania FcBlock.

5. Barwienie

Przenieś alikwoty o objętości 100 μl do probówek typu Eppendorf, aby służyły jako kontrola niebarwiona oraz kontrole jednobarwne (zależnie od liczby użytych przeciwciał fluorescencyjnych).
Aby znakować fibroblasty: dodaj przeciwciało anty-PDGFRα (bezpośrednio sprzężone z fluorophorem) w rozcieńczeniu 1:50 (10 μg/ml).
Aby znakować inne populacje komórek (np. komórki odpornościowe, makrofagi, komórki śródbłonka itp.): dodaj odpowiednie przeciwciała sprzężone z fluoresceiną przeciwko markerom powierzchniowym w rozcieńczeniu 1:50.

Uwaga: choć PDGFRα jest wiarygodnym markerem fibroblastów, zaleca się zastosowanie przeciwciał przeciwko komórkom odpornościowym oraz komórkom nabłonkowym, aby wykluczyć populacje podwójnie dodatnie, a tym samym zwiększyć czystość wyizolowanych fibroblastów.

Do każdej z probówek Eppendorf z kontrolami jednobarwnymi dodać 2 μl każdego przeciwciała.
Inkubować komórki z przeciwciałami przez 1 hr w ciemności, w temperaturze 4 °C (na lodzie).
W celu przemycia: napełnić probówki buforem FACS I i wirować przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.
Odssać nadsącz, resuspender komórki w buforze FACS I do stężenia około 2 x 10⁶ cells/ml lub do stężenia najbardziej odpowiedniego dla sortowania przy użyciu dostępnego sortera FACS.

Opcjonalnie: Na czas sortowania komórki można resuspenderować w buforze FACS II. Może to poprawić żywotność komórek. Należy jednak pamiętać i sprawdzić, czy ekspozycja na czynniki zawarte w surowicy nie wpływa na ekspresję genów.

Przenieś oznakowane komórki do probówek do FACS z filtrem w pokrywce: przefiltruj komórki do probówek, aby zapobiec powstawaniu agregatów komórkowych.
W celu wykluczenia martwych komórek, dodaj do próbek (z wyjątkiem kontroli niebarwionej) 7AAD (0.5 μg/ml) lub jodek propidyny (PI).

Uwaga: Aby uniknąć marnowania komórek, można dodać 7AAD/PI do niebarwionej próbki po zarejestrowaniu jej w FACS i ponownie wykorzystać ją jako kontrolę z samym 7AAD.

Przechowywać próbki w lodzie podczas analizy.

6. Izolacja komórek metodą FACS

(Uwaga: ta część protokołu wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi sortera FACS, np. BD FACS AriaII, lub pomocy doświadczonego technika).

Za pomocą oprogramowania sortera FACS (BD FACSDiva) przygotuj odpowiednie wykresy analizy w celu oceny rozproszenia przedniego (FSC), rozproszenia bocznego (SSC), 7AAD, FITC, PE oraz każdego innego fluoroforu użytego do znakowania komórek (Rysunek 2).
Przed załadowaniem każdej próbki do sortera komórek krótko wymieszaj ją w wortexie, aby resuspenderć komórki.
Rozpocznij od analizy próbki niezbarwionej w celu ustawienia bramkowania dla całkowitej populacji komórek, odseparowania debris komórkowego oraz określenia autofluorescencji lub tła barwienia.
Przeanalizuj próbkę niezbarwioną + 7AAD, aby wyznaczyć i obramować populację żywych komórek z całkowitej populacji komórek.
Przeanalizuj każdą kontrolę jednobarwną, aby wyznaczyć i skalibrować parametry, takie jak kompensacja.
Przeanalizuj próbkę zbarwioną, aby zdefiniować położenie bramek do sortowania.
Po ustawieniu parametrów i bramek dla pożądanych populacji komórek rozpocznij sortowanie znakowanych populacji komórek do probótek typu Eppendorf lub 15 ml probótek stożkowych zawierających pożywkę hodowlaną lub bufor do lizy RNA (taki jak bufor RLT lub Trizol).

Uwaga: W przypadku sortowania dużej liczby komórek nie zaleca się sortowania bezpośrednio do buforu do lizy RNA, ponieważ duża objętość płynu osłonowego towarzyszącego komórkom rozcieńczy bufor do lizy i zmniejszy wydajność.

Odwirować komórki niezwłocznie po zakończeniu sortowania i przenieść je do świeżej pożywki lub buforu do lizy RNA, w zależności od celu eksperymentu.
W przypadku sortowania w celu hodowli wyizolowanych komórek, należy przeprowadzić sortowanie w warunkach sterylnych. Aby uzyskać lepszy odzysk komórek, należy użyć pożywki DMEM bez czerwieni fenolowej + 5% FCS zamiast buforu FACS buffer II i zbierać komórki do pożywki hodowlanej z 20% FCS.
Podczas hodowli posortowanych fibroblastów należy je zawsze wysiewać na płytki pokryte kolagenem, nigdy bezpośrednio na plastik, ponieważ prowadzi to do aktywacji fibroblastów i zmian w ich ekspresji genów.