Tani zestaw do audiometrii behawioralnej u gryzoni

Podsumowanie

Opisana jest szybka i tania metoda behawioralnego określania parametrów słuchu, takich jak progi słyszenia, upośledzenie słuchu lub percepcja fantomowa (subiektywne szumy uszne). Wykorzystuje hamowanie impulsów wstępnych odpowiedzi akustycznej przerażenia i może być łatwo zaimplementowany w komputerze osobistym za pomocą programowalnego konwertera AD/DA i czujnika piezoelektrycznego.

Streszczenie

W badaniach słuchowych na zwierzętach kluczowe jest posiadanie precyzyjnych informacji na temat podstawowych parametrów słuchu zwierząt biorących udział w eksperymentach. Takimi parametrami mogą być fizjologiczne charakterystyki odpowiedzi drogi słuchowej, np. za pomocą audiometrii pnia mózgu (BERA). Metody te pozwalają jednak jedynie na pośrednie i niepewne ekstrapolacje dotyczące percepcji słuchowej, która odpowiada tym parametrom fizjologicznym. Aby ocenić poziom percepcji słuchu, należy zastosować metody behawioralne. Potencjalnym problemem związanym z zastosowaniem metod behawioralnych do opisu percepcji w modelach zwierzęcych jest fakt, że większość z tych metod obejmuje pewien rodzaj paradygmatu uczenia się, zanim badani będą mogli zostać przetestowani behawioralnie, np. zwierzęta mogą być zmuszone do nauczenia się naciskania dźwigni w odpowiedzi na dźwięk. Ponieważ te paradygmaty uczenia się zmieniają samą percepcję ^1,2, w konsekwencji będą miały wpływ na każdy wynik dotyczący percepcji uzyskany za pomocą tych metod i dlatego muszą być interpretowane z ostrożnością. Wyjątkiem są paradygmaty, które wykorzystują reakcje odruchowe, ponieważ tutaj nie trzeba przeprowadzać paradygmatów uczenia się przed testami percepcyjnymi. Jedną z takich reakcji odruchowych jest akustyczna reakcja na przerażenie (ASR), która może być wysoce powtarzalnie wywołana nieoczekiwanymi głośnymi dźwiękami u naiwnych zwierząt. Na ten ASR z kolei mogą wpływać poprzedzające go dźwięki, w zależności od odczuwalności tego poprzedzającego bodźca: Dźwięki znacznie powyżej progu słyszenia całkowicie zahamują amplitudę ASR; dźwięki bliskie progowi tylko nieznacznie zahamują ASR. Zjawisko to nazywa się hamowaniem przed impulsem (PPI) ^3,4, a ilość PPI na ASR stopniowo zależy od wyczuwalności impulsu wstępnego. PPI ASR doskonale nadaje się zatem do określania audiogramów behawioralnych u naiwnych, niewyszkolonych zwierząt, do określania upośledzenia słuchu, a nawet do wykrywania możliwych subiektywnych percepcji szumów usznych u tych zwierząt. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie tej metody w modelu gryzonia (por. również odnośnik ⁵), myszoskoczka mongolskiego (Meriones unguiculatus), który jest dobrze znanym gatunkiem modelowym do badań nad reakcją na przestraszenie w normalnym zakresie słuchu ludzkiego (np. ⁶).

Protokół

1. Konfiguracja, montaż i programowanie oprogramowania

1. Zainstaluj kartę cyfrowo-analogową w komputerze osobistym (np.: NI PCI 6229, National Instruments) i podłącz ją do skrzynki rozdzielającej (np.: BNC-2110, National Instruments), obie powinny obsługiwać co najmniej jeden kanał wejściowy i jeden wyjściowy o częstotliwości próbkowania co najmniej 44,1 kHz każdy.
2. Podłącz wyjście skrzynki rozgałęźnej za pomocą BNC do wzmacniacza dźwięku (np.: szerokopasmowy wzmacniacz mocy AMP75, Thomas Wulf).
3. Zainstaluj kamerę internetową na podczerwień (np.: Grand IP Camera Pro, GrandTec Electronics) do nadzoru zwierząt w ciemności.
4. Zainstaluj zintegrowane środowisko programistyczne (np. Matlab), aby zaimplementować program zdefiniowany na schemacie blokowym podanym na rysunku 1. Wersję działającą na Matlabie 2007b można otrzymać bezpłatnie od autora korespondencyjnego.
5. W dźwiękoszczelnej komorze zainstaluj głośnik na stole. Podłącz głośnik do wzmacniacza dźwięku.
6. Zainstaluj czujnik piezoelektryczny (np. czujnik siły FSG15N1A, Honeywell) na płytce izolacyjnej, podeprzyj go zasilaniem i podłącz BNC do wejścia skrzynki rozdzielającej; uziemić sygnał czujnika.
7. Zbuduj komorę pomiarową z rurki ze szkła akrylowego dostosowaną do wielkości mierzonego gryzonia (dla myszoskoczków np.: długość 15 cm, średnica wewnętrzna 4,3 cm, średnica zewnętrzna 4,8 cm). Przymocuj kratkę o szerokości oczek 0,5 mm z przodu rury, a wyściełane drzwi z mechanizmem blokującym (np. haczykiem) z tyłu. Mocowanie można wykonać za pomocą gorącego kleju, w przypadku drzwi do rurki przymocowany jest tylko zawias i kabłąk na hak
.
8. Przymocuj nóżki z tworzywa piankowego, które pasują do wymiarów rurki pomiarowej na płytce czujnika izolacyjnego. Stopy powinny podeprzeć rurkę pod przednim i tylnym końcem i podnieść rurkę do poziomu czujnika. Upewnij się, że czujnik piezoelektryczny ma lekki kontakt z komorą pomiarową.
9. Zamocuj płytkę czujnika z komorą pomiarową wyśrodkowaną przed głośnikiem i umieść obok niej mikrofon do kontroli dźwięku (np. B&K Typ 2669 / B&K Typ 4190 podłączony do wzmacniacza pomiarowego B&K Typ 2610, wszystkie: Bruel i Kjaer) na poziomie głowy zwierzęcia, tak aby nie kolidował z rurką.
10. Należy pamiętać, że jakość danych audiometrycznych będzie zależeć od jakości systemu dźwiękowego. W każdym przypadku użyj mikrofonu i wzmacniacza pomiarowego, aby określić funkcję przenoszenia częstotliwości w swoim systemie przed pierwszymi eksperymentami i włącz procedurę do oprogramowania, aby skorygować tę funkcję przenoszenia częstotliwości, aby wyjście widmowe głośnika było płaskie.
11. Dopasuj kamerę internetową do konfiguracji, aby można było monitorować zachowanie zwierząt.

2. Behawioralne określanie progów słyszenia (audiogramy)

1. Wyjmij zwierzę z jego domowej klatki i włóż je głową do przodu w tubie; zamknij drzwi.
2. Umieść rurkę na piankowych nóżkach i czujniku. Wyłącz światło i zamknij drzwi do komory. Sama komora nie jest klimatyzowana, ale ma temperaturę, wilgotność i inne zmienne środowiskowe otaczającego laboratorium. Wymiana powietrza za pomocą wentylatorów nie jest wskazana ze względu na indukowany hałas, ale objętość komory podtrzymuje tlen dla zwierzęcia przez wiele godzin. Odczekaj 15 minut, aby zwierzę przyzwyczaiło się do ustawienia. Czas aklimatyzacji jest korzystny dla zwierzęcia, ponieważ może się uspokoić we własnym tempie i przyzwyczaić się do rurki. Z drugiej strony nie widać żadnych różnic w zachowaniu w czasie aklimatyzacji na przestrzeni kilku sesji, co wskazuje, że dodatkowa sesja w celu zapoznania zwierzęcia z rurką i komorą przed eksperymentem nie jest potrzebna.
3. Uruchom program i określ parametry stymulacji (por. również odnośnik ⁵): Bodźce składają się z czystych tonów o różnych częstotliwościach. Bodziec zaskoczenia musi być prezentowany z wystarczająco wysokim poziomem ciśnienia akustycznego, aby w powtarzalny sposób wywołać reakcję zaskoczenia. W naszym laboratorium używamy intensywności 105 dB SPL (czas trwania bodźca 6 ms, w tym 2 ms cosinusoidalne rampy wznoszenia i opadania), aby wywołać reakcje zaskoczenia u myszoskoczków mongolskich. Bodźce testowe poprzedzające bodźce powodujące przerażenie są prezentowane z różną częstotliwością i intensywnością w badanym zakresie, zwykle od poniżej progu słyszenia do poziomów znacznie powyżej progu i z częstotliwościami obejmującymi cały zakres słyszalny gatunku. Częstotliwość i czas trwania przestraszenia i bodźca testowego są dopasowywane w każdej próbie, odstęp między bodźcami między przestraszeniem a bodźcem testowym jest ustawiony na 100 ms. Wykonaj co najmniej 15 powtórzeń z randomizowanymi interwałami międzybodźcowymi wynoszącymi 10 ± 2,5 sekundy dla każdej kombinacji częstotliwości i intensywności badanych bodźców (por. Rysunek 2A, po lewej). Kolejne bodźce testowe mogą być prezentowane w kolejności losowej lub nielosowej. Jeśli używasz podejścia nierandomizowanego (np. jeden poziom bodźca testowego ustalony dla wszystkich badanych częstotliwości), pozwól na 5 minut regeneracji między różnymi zestawami bodźców. Należy zauważyć, że wyznaczony próg bezwzględny będzie zależał od randomizacji bodźców, ale ewentualne względne przesunięcia progu nie będą (np. po urazie akustycznym, por. odnośnik ⁵).
4. Przed analizą danych należy usunąć nieważne próby ze zbioru danych (np. próby, w których zwierzę poruszało się przed bodźcem odstraszającym; por. rysunek 2B).
5. W przedziale czasowym pierwszych 50 ms po bodźcu przestraszenia należy obliczyć amplitudę odpowiedzi (od szczytu do szczytu od pierwszego maksimum do pierwszego minimum odpowiedzi) i opóźnienie odpowiedzi (czas od rozpoczęcia bodźca do początku odpowiedzi) każdej pojedynczej próby.
6. Dopasuj funkcję Boltzmanna do kompletnego zestawu danych amplitudy odpowiedzi o jednej częstotliwości posortowanej według intensywności bodźca dla wszystkich ważnych pojedynczych prób. Punkt 50% funkcji Boltzmanna ⁷ wskazuje próg słyszenia dla tej częstotliwości stymulacji.

3. Uraz akustyczny i kwantyfikacja upośledzenia słuchu

1. Przygotować znieczulenie ketaminowo-ksylazynowe z mieszaniną chlorowodorku ketaminy: 96 mg/kg (Ketamin-ratiopharm, Ratiopharm); chlorowodorku ksylazyny: 4 mg/kg (Rompun 2%, Bayer); siarczanu atropiny: 1 mg/kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) i fizjologicznego roztworu NaCl (Berlin-Chemie AG, Berlin) w stosunku 9:1:2:8.
2. Wstrzyknąć zwierzęciu 3 ml/kg znieczulenia podskórnego. Poczekaj, aż zwierzę zostanie głęboko znieczulone (ok. 5 min, sprawdź odruchy, np. użyj odruchu wycofania pedału). Aby utrzymać znieczulenie podczas pomiarów, należy w sposób ciągły wstrzykiwać roztwór znieczulający z szybkością 3 ml/kg/godz. za pomocą pompy strzykawkowej. Kontroluj parametry życiowe za pomocą odpowiedniego sprzętu (np. oddychanie za pomocą kamery) i utrzymuj zwierzę w cieple, umieszczając je na podkładce grzewczej.
3. Wywołaj uraz akustyczny, np. za pomocą głośnego, czystego tonu: np. 2 kHz przy 115dB SPL przez 75 minut.
4. Po zakończeniu urazu należy przerwać pompę strzykawkową i pozwolić zwierzęciu obudzić się w klatce budzącej na podkładce rozgrzewającej w cichym miejscu. W fazie budzenia regularnie sprawdzaj, czy parametry życiowe są stabilne. Umieść zwierzę w jego domowej klatce tylko wtedy, gdy jest całkowicie przytomne. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu (co najmniej 2 dni) i odpocząć w swojej domowej klatce.
5. Ponownie wykonaj czynności od 2.1 do 2.6. Porównaj progi słyszenia przed i po urazie akustycznym, obliczając procent ubytku słuchu dla każdej częstotliwości. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów bezboleśnie poddaj zwierzę eutanazji.

4. Test na akustyczną percepcję fantomową (subiektywny szum w uszach)

1. Wykonaj te pomiary przed i po urazie akustycznym.
2. Postępuj zgodnie z 2.1 do 2.2, jeśli zwierzę nie jest jeszcze w konfiguracji.
3. Do badania gryzoni pod kątem subiektywnych szumów usznych można wykorzystać szereg paradygmatów stymulacji. Stosunek we wszystkich tych podejściach polega na przetestowaniu istotności cichej przerwy w hałasie tła. Jeśli przerwa jest dostrzegana przez zwierzęta, może być wykorzystana jako bodziec testowy w celu zmniejszenia reakcji zaskoczenia analogicznie do procedury opisanej w 2. Jeśli zwierzę cierpi na szumy uszne (które prawdopodobnie rozwiną się po urazie akustycznym), ten szum w uszach będzie odczuwany w cichej szczelinie, a zatem szczelina będzie mniej widoczna. Wpływ luki na reakcję na przerażenie będzie w konsekwencji słabszy u zwierząt z szumami usznymi w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej (obniżony PPI, por. ⁸). Ten percept jest testowany za pomocą dwóch nieco różnych protokołów.
4. W pierwszym przedstawionym tutaj subiektywnym paradygmacie szumów usznych (ryc. 2A, środek, por. ⁹) do stymulacji należy zastosować następujące parametry: natężenie dźwięku przerażenia 105 dB SPL o częstotliwościach od 1 do 16 kHz w krokach co 1 oktawę, długość bodźca 6 ms, w tym 2 ms rampy wznoszenia i opadania cosinus-kwadrat. Przedstawić biały szum tła o natężeniu 50 dB SPL podczas eksperymentu, z przerwą 15 ms lub bez niej, która poprzedza bodziec zaskoczenia o 100 ms; przedstawić co najmniej 15 badań dla każdej częstości występowania i warunku przerwy. Jeśli używasz podejścia nierandomizowanego, pozwól na 5 minut regeneracji między różnymi zestawami bodźców. Użycie różnych częstotliwości bodźców przestraszenia da przybliżone oszacowanie odczuwanej częstotliwości szumów usznych.
5. Jako drugi subiektywny paradygmat szumów usznych (ryc. 2A, po prawej) możesz użyć następujących parametrów stymulacji: natężenie dźwięku przerażenia 105 dB SPL, bodziec podwójnego kliknięcia o czasie trwania 0,1 ms na kliknięcie i 0,1 ms między kliknięciami, przy czym drugie kliknięcie ma odwrócony kierunek w porównaniu do pierwszego. Przedstaw szum tła z filtrem pasmowoprzepustowym o wartości 50 dB SPL z filtrem gaussowskim o szerokości 0,5 oktawy i częstotliwościach środkowych w zakresie od 1 do 16 kHz w krokach oktawowych. Przedstaw ten hałas z przerwą 15 ms lub bez niej, która poprzedza bodziec zaskoczenia o 100 ms; przedstawić co najmniej 15 badań dla każdej częstości występowania i warunku przerwy. Jeśli używasz podejścia nierandomizowanego, pozwól na 5 minut regeneracji między różnymi zestawami bodźców. Użycie różnych częstotliwości środkowych szumu tła pasmowoprzepustowego pozwoli w przybliżeniu oszacować odczuwaną częstotliwość szumów usznych.
6. Postępuj zgodnie z 2,4 do 2,5; znormalizuj wszystkie uzyskane dane za pomocą zestawu danych referencyjnych dla każdej badanej częstotliwości i każdego stanu urazu, tj. przed i po urazie akustycznym. To odniesienie jest amplitudą odpowiedzi na bodziec przestraszenia czystym tonem bez żadnego bodźca wstępnego (por. 2.3). Częstotliwość jest określana albo przez czysty ton, albo przez częstotliwość środkową szumu filtrowanego pasmowoprzepustowego. Oblicz średnią odpowiedź każdego odniesienia i znormalizuj każdą obliczoną amplitudę odpowiedzi, dzieląc ją przez jej odniesienie.
7. Obliczyć PPI, dzieląc znormalizowane amplitudy odpowiedzi warunku przerwy przez średnią znormalizowanego stanu braku przerwy dla każdej badanej częstotliwości.
8. Oblicz zmianę PPI po urazie w procentach dla każdej badanej częstotliwości.

Reakcje zaskoczenia zwierząt są łatwe do wygenerowania i analizy. Rysunek 2B przedstawia przegląd typowego wyniku stymulacji jednego zwierzęcia czystym tonem 105 dB SPL bez żadnego bodźca wstępnego przez 15 razy. Większość badań jest ważna, a nieważne są łatwe do rozpoznania (badania są oznaczone czerwonym kwadratem). Amplitudy odpowiedzi i opóźnienia są obliczane tylko na podstawie ważnych prób.

Typowa zmiana progu zachowania jest pokazana na rysunku 3A. Audiogram przykładowego zwierzęcia pozyskany metodą opisaną w pkt. 2 podawany jest przed (kolor niebieski) i po (kolor czerwony) urazu akustycznego o częstotliwości 2 kHz (obszar żółty). Wyraźny ubytek słuchu jest widoczny szczególnie przy częstotliwości 2 kHz. Reakcje związane z subiektywnym odczuwaniem szumów usznych można zobaczyć na rycinie 3B, znormalizowane amplitudy odpowiedzi tego samego zwierzęcia jak powyżej pokazano przykładowo dla stymulacji o jedną oktawę poniżej i powyżej urazu, jak opisano w 4.5. Porównanie reakcji na bodźce z przerwą i bez przerwy przed traumą (kolor niebieski) i po traumie (kolor czerwony) pozwala na interpretację możliwej percepcji szumów usznych. Poniżej częstości traumy nie można znaleźć zmiany wzorca reakcji, podczas gdy powyżej urazu efekt przerwy zniknął po urazie, co wskazuje na błędne postrzeganie przy tej częstotliwości.

Rysunek 1. Diagram przepływu programu służącego do pozyskiwania progów behawioralnych i subiektywnych danych dotyczących szumów usznych. Należy pamiętać, że jest to tylko uproszczona wersja kodu programu. Skróty: GUI - graficzny interfejs użytkownika; ISI - interwał bodźców.

Rysunek 2. Bodźce słuchowej reakcji na zaskoczenie (ASR). A Schematy trzech różnych stosowanych protokołów stymulacji. Lewy panel: wstępne hamowanie impulsów (PPI) ASR mierzone bez żadnego bodźca testowego czystego tonu przed (zielonym) tonem przerażenia (czerwonym); Okres odpowiedzi jest zaznaczony kolorem niebieskim. Panel środkowy: paradygmat szczeliny / szumu z czystym tonem, prezentacją bodźców zaskakujących o różnych częstotliwościach na białym tle szumu. Prawy panel: paradygmat przerwy / szumu z prezentacją bodźca zaskoczenia kliknięcia na filtrowanym tle, pasmowoprzepustowym o różnych częstotliwościach środkowych. B Przykładowe słuchowe reakcje zaskoczenia z 15 prób zarejestrowanych z paradygmatem progowym bez żadnego bodźca wstępnego przy częstotliwości stymulacji 1 kHz. Trzy próby są uznawane za nieważne (czerwone kwadraty), ponieważ zwierzę poruszało się jeszcze przed rozpoczęciem stymulacji.

Rysunek 3. Przykładowe wyniki ASR u jednego zwierzęcia. Próg behawioralny przed (niebieski) i po (czerwony) urazie akustycznym przy 2 kHz (żółty obszar). Progi są obliczane na podstawie odpowiedzi na protokół ASR modulowany PPI przy użyciu punktu zwrotnego funkcji Boltzmanna jako wartości progowej. Należy pamiętać, że ubytek słuchu przy częstotliwości 2 kHz wynosi ponad 66%, podczas gdy często można zaobserwować nawet poprawę progów słyszenia. B Znormalizowane amplitudy odpowiedzi (otwarte okręgi: pojedyncze próby, wypełnione okręgi: średnie, wąsy: odchylenie standardowe) podczas stymulacji z protokołem ASR gap / noise click (4,5) dla częstotliwości środkowych 1 i 4 kHz. Odpowiedzi są sortowane dla prób bez i z przerwą w szumie przed i po urazie przy 2 kHz. Dopiero przy 4 kHz efekt przerwy znika po urazie, co wskazuje na subiektywne odczuwanie szumów usznych wokół tej częstotliwości.

Dyskusja

Przedstawiamy tani i łatwy do zbudowania zestaw do pomiarów audiometrycznych u gryzoni oparty na hamowaniu przed impulsem reakcji akustycznego przerażenia, które można wykorzystać do określenia behawioralnych progów słyszenia (= audiogramy ¹⁰) i słuchowych percepcji fantomowych, takich jak subiektywne szumy uszne ¹¹. Zwłaszcza te ostatnie pomiary są przedmiotem kilku ostatnich doniesień ^8,12,13,14 i mogą być postrzegane jako jeden z warunków wstępnych dla badań elektrofizjologicznych mech...