Tani układ do behawioralnej audiometrii u gryzoni

Podsumowanie

Opisano szybką i niedrogą metodę behawioralnego wyznaczania parametrów słuchowych, takich jak progi słyszalności, zaburzenia słuchu czy percepcje fantomowe (subiektywny szum uszny). Metoda ta wykorzystuje hamowanie wstępne (pre-pulse inhibition) reakcji przestrachu akustycznego i może być łatwo zaimplementowana w komputerze osobistym przy użyciu programowalnego przetwornika AD/DA oraz czujnika piezoelektrycznego.

Streszczenie

W badaniach nad słuchem zwierząt kluczowe jest posiadanie precyzyjnych informacji o podstawowych parametrach słyszenia osobników biorących udział w eksperymentach. Parametrami takimi mogą być charakterystyki odpowiedzi fizjologicznej drogi słuchowej, np. poprzez audiometrię pni pnia mózgu (BERA). Metody te pozwalają jednak jedynie na pośrednią i niepewną ekstrapolację dotyczącą percepcji słuchowej odpowiadającej tym parametrom fizjologicznym. Aby ocenić poziom percepcyjny słuchu, należy zastosować metody behawioralne. Potencjalnym problemem przy stosowaniu metod behawioralnych do opisu percepcji w modelach zwierzęcych jest fakt, że większość z nich wymaga zastosowania pewnego rodzaju paradygmatu uczenia się przed przeprowadzeniem testów behawioralnych, np. zwierzęta muszą nauczyć się naciskać dźwignię w odpowiedzi na dźwięk. Ponieważ paradygmaty uczenia się te zmieniają samą percepcję ^1,2, wpływają one w konsekwencji na każdy wynik dotyczący percepcji uzyskany tymi metodami i dlatego muszą być interpretowane z ostrożnością. Wyjątkiem są paradygmaty wykorzystujące odpowiedzi odruchowe, ponieważ w tym przypadku przed testowaniem percepcyjnym nie trzeba przeprowadzać żadnych procesów uczenia się. Jednym z takich odruchów jest reakcja zaskoczenia (ASR), którą można wywołać w sposób wysoce powtarzalny za pomocą nieoczekiwanych głośnych dźwięków u naiwnych zwierząt. Reakcja ASR może z kolei być modyfikowana przez dźwięki poprzedzające, w zależności od postrzegalności tego bodźca poprzedzającego: dźwięki znacznie powyżej progu słyszenia całkowicie zahamują amplitudę ASR; dźwięki bliskie progu będą hamować ASR tylko w niewielkim stopniu. Zjawisko to nazywa się hamowaniem przez impuls poprzedzający (PPI) ^3,4, a stopień PPI w reakcji ASR zależy stopniowo od postrzegalności impulsu poprzedzającego. PPI reakcji ASR jest zatem bardzo dobrze dostosowane do wyznaczania behawioralnych audiogramów u naiwnych, niewytrenowanych zwierząt, określania upośledzenia słuchu, a nawet wykrywania możliwych subiektywnych percepcji szumów usznych (tinnitus) u tych zwierząt. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie tej metody w modelu gryzoni (por. również ref. ⁵), mianowicie u gerbila mongolskiego (Meriones unguiculatus), który jest dobrze znanym gatunkiem modelowym w badaniach nad reakcją zaskoczenia w zakresie normalnego ludzkiego słyszenia (np. ⁶).

Protokół

1. Montaż zestawu i programowanie oprogramowania

1. Zainstaluj kartę D/A w komputerze osobistym (np.: NI PCI 6229, National Instruments) i podłącz ją do modułu rozdzielczego breakout-box (np.: BNC-2110, National Instruments); oba urządzenia powinny obsługiwać co najmniej jeden kanał wejściowy i jeden wyjściowy z częstotliwością próbkowania wynoszącą co najmniej 44.1 kHz dla każdego z nich.
2. Podłącz wyjście modułu breakout-box za pomocą kabla BNC do wzmacniacza dźwięku (np.: szerokopasmowy wzmacniacz mocy AMP75, Thomas Wulf).
3. Zainstaluj kamerę internetową z podczerwienią (np.: Grand IP Camera Pro, GrandTec Electronics) do monitorowania zwierząt w ciemności.
4. Zainstaluj zintegrowane środowisko programistyczne (np.: Matlab), aby zaimplementować program zgodnie ze schematem blokowym przedstawionym na Ryc. 1. Wersja działająca na Matlab 2007b może zostać bezpłatnie udostępniona przez autora korespondencyjnego.
5. Wewnątrz wygłuszonej komory zainstaluj głośnik na stole. Podłącz głośnik do wzmacniacza dźwięku.
6. Zainstaluj czujnik piezoelektryczny (np. czujnik siły FSG15N1A, Honeywell) na płycie izolacyjnej, zapewnij mu zasilanie i podłącz go za pomocą kabla BNC do wejścia modułu breakout-box; uziemi sygnał czujnika.
7. Zbuduj komorę pomiarową z rurki z pleksiglasu dopasowanej do rozmiaru mierzonego gryzonia (dla myszowców np.: długość 15 cm, średnica wewnętrzna 4.3 cm, średnica zewnętrzna 4.8 cm). Do przedniej części rurki przymocuj kratkę o szerokości oczek 0.5 mm, a do tylnej wyściełane drzwiczki z mechanizmem blokującym (np. haczykiem). Mocowanie można wykonać za pomocą kleju na gorąco, natomiast w przypadku drzwiczek do rurki przymocowuje się jedynie zawias i uchwyt dla haczyka.
8. Do izolacyjnej płyty czujnika przytwierdź stopki z pianki plastikowej dopasowane do wymiarów rurki pomiarowej. Stopki powinny podtrzymywać rurkę pod przednim i tylnym końcem oraz unosić rurkę do poziomu czujnika. Upewnij się, że pomiędzy czujnikiem piezoelektrycznym a komorą pomiarową istnieje lekki kontakt.
9. Zamocuj płytę z czujnikiem tak, aby komora pomiarowa znajdowała się centralnie przed głośnikiem, a obok niej umieść mikrofon do kontroli dźwięku (np. B&K Type 2669 / B&K Type 4190 podłączony do wzmacniacza pomiarowego B&K Type 2610, wszystkie: Bruel and Kjaer) na poziomie głowy zwierzęcia, tak aby nie kolidował on z rurką.
10. Należy pamiętać, że jakość danych audiometrycznych zależy od jakości systemu dźwiękowego. W każdym przypadku przed rozpoczęciem pierwszych eksperymentów należy użyć mikrofonu i wzmacniacza pomiarowego do wyznaczenia funkcji przejścia częstotliwościowego systemu, a w oprogramowaniu zaimplementować procedurę korekcyjną dla tej funkcji, aby uzyskać płaską charakterystykę widmową głośnika.
11. Ustaw kamerę internetową względem układu w taki sposób, aby można było monitorować zachowanie zwierzęcia.

2. Behawioralne wyznaczanie progów słyszenia (audiogramy)

1. Wyjmij zwierzę z klatki domowej i umieść je głową do przodu w rurce; zamknij drzwiczki.
2. Umieść rurkę na nóżkach z pianki oraz na czujniku. Wyłącz wszelkie światła i zamknij drzwi komory. Komora nie jest klimatyzowana, lecz posiada temperaturę, wilgotność i inne zmienne środowiskowe typowe dla otaczającego laboratorium. Wymiana powietrza przez wentylatory nie jest zalecana ze względu na generowany hałas, jednak objętość komory zapewnia zwierzęciu tlen przez wiele godzin. Odczekaj 15 min, aby zwierzę mogło przyzwyczaić się do ustawienia. Czas aklimatyzacji jest korzystny dla zwierzęcia, ponieważ pozwala mu uspokoić się we własnym tempie i oswoić z rurką. Z drugiej strony, w wielu sesjach nie zaobserwowano różnic w zachowaniu podczas czasu aklimatyzacji, co wskazuje, że dodatkowa sesja zapoznawcza zwierzęcia z rurką i komorą przed eksperymentem nie jest konieczna.
3. Uruchom program i zdefiniuj parametry stymulacji (por. również ref. ⁵): Bodźce składają się z czystych tonów o różnych częstotliwościach. Bodziec wywołujący reakcję przestrachu (startle stimulus) musi być podany z poziomem ciśnienia akustycznego wystarczająco wysokim, aby w sposób powtarzalny wywołać reakcję przestrachu. W naszym laboratorium stosujemy natężenia 105 dB SPL (czas trwania bodźca 6 ms, w tym 2 ms rampy narastania i opadania w kształcie cosinus kwadrat), aby wywołać reakcje przestrachu u gerbołów mongolskich. Bodźce testowe poprzedzające bodźce wywołujące przestrach są podawane z różnymi częstotliwościami i natężeniami w zakresie przeznaczonym do badania, zazwyczaj od poziomu poniżej progu słyszalności do poziomów znacznie powyżej progu, z częstotliwościami obejmującymi cały zakres słyszalny dla danego gatunku. Częstotliwość i czas trwania bodźca wywołującego przestrach oraz bodźca testowego są dopasowane w każdej próbie; odstęp międzybodźcowy między bodźcem wywołującym przestrach a bodźcem testowym wynosi 100 ms. Wykonaj co najmniej 15 powtórzeń z randomizowanymi odstępami międzybodźcowymi wynoszącymi 10 ± 2.5 sec dla każdej kombinacji częstotliwości i natężenia bodźców testowych (por. Rycina 2A, lewa strona). Kolejne bodźce testowe mogą być podawane w kolejności zrandomizowanej lub niezrandomizowanej. W przypadku zastosowania podejścia niezrandomizowanego (np. jeden stały poziom bodźca testowego dla wszystkich badanych częstotliwości) zastosuj 5 min przerwy na regenerację pomiędzy różnymi zestawami bodźców. Należy pamiętać, że wyznaczony próg absolutny będzie zależał od randomizacji bodźców, ale ewentualne relatywne przesunięcia progu już nie (np. po urazie akustycznym, por. ref. ⁵).
4. Przed analizą danych usuń z zestawu próby nieważne (np. próby, w których zwierzę poruszyło się przed bodźcem wywołującym przestrach; por. Rycina 2B).
5. W oknie czasowym pierwszych 50 ms po bodźcu wywołującym przestrach oblicz amplitudę odpowiedzi (peak-to-peak między pierwszym maksimum a pierwszym minimum odpowiedzi) oraz latencję odpowiedzi (czas od początku bodźca do początku odpowiedzi) dla każdej pojedynczej próby.
6. Dopasuj funkcję Boltzmanna do pełnego zestawu danych amplitudy odpowiedzi dla jednej częstotliwości, posortowanych według natężenia przedstymulacyjnego dla wszystkich ważnych pojedynczych prób. Punkt 50% funkcji Boltzmanna ⁷ wskazuje próg słyszalności dla tej częstotliwości stymulacji.

3. Uraz akustyczny i kwantyfikacja upośledzenia słuchu

1. Przygotować anestezję z ketaminą i ksylazyną, stosując mieszaninę chlorowodorku ketaminy: 96 mg/kg (Ketamin-ratiopharm, Ratiopharm); chlorowodorku ksylazyny: 4 mg/kg (Rompun 2%, Bayer); siarczanu atropiny: 1 mg/kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) oraz fizjologicznego roztworu NaCl (Berlin-Chemie AG, Berlin) w stosunku 9:1:2:8.
2. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie 3 ml/kg anestetyku. Odczekać do momentu głębokiego znieczulenia (ok. 5 min, sprawdzając odruchy, np. odruch wycofania łapy). Aby utrzymać znieczulenie podczas pomiarów, nieustannie podawać roztwór anestetyka za pomocą pompy strzykawkowej z prędkością 3 ml/kg/hr. Kontrolować parametry życiowe za pomocą odpowiedniego sprzętu (np. oddychanie za pomocą kamery) i utrzymywać ciepłotę zwierzęcia, umieszczając je na macie grzejnej.
3. Wywołać uraz akustyczny, np. używając głośnego czystego tonu: np. 2 kHz przy 115dB SPL przez 75 min.
4. Po zakończeniu urazu wyłączyć pompę strzykawkową i pozwolić zwierzęciu obudzić się w klatce do wybudzania na macie grzejnej w cichym miejscu. Podczas fazy wybudzania regularnie sprawdzać, czy parametry życiowe są stabilne. Przenieść zwierzę do klatki macierzystej dopiero po całkowitym wybudzeniu. Pozostawić zwierzę do regeneracji po anestezji (przynajmniej 2 dni) i odpoczynku w klatce macierzystej.
5. Powtórzyć czynności od 2.1 do 2.6. Porównać progi słyszenia przed i po urazie akustycznym, obliczając procent utraty słuchu dla każdej częstotliwości. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów przeprowadzić bezbolesną eutanazję zwierzęcia.

4. Test percepcji fantomowego dźwięku akustycznego (Subiektywne szumy uszne)

1. Należy przeprowadzić te pomiary przed oraz po urazie akustycznym.
2. Należy przeprowadzić kroki od 2.1 do 2.2, jeśli zwierzę nie znajduje się jeszcze w układzie.
3. Do testowania subiektywnych szumów usznych u gryzoni można wykorzystać szereg paradygmatów stymulacji. Celem wszystkich tych podejść jest zbadanie istotności ciszy (przerwy w dźwięku) w obrębie szumu tła. Jeśli przerwa zostanie zauważona przez zwierzęta, może ona służyć jako bodziec testowy do redukcji reakcji przestrachu, analogicznie do procedury opisanej w punkcie 2. Jeśli zwierzę cierpi na szumy uszne (które prawdopodobnie rozwiną się po urazie akustycznym), szumy te będą słyszalne w trakcie przerwy w dźwięku, co sprawi, że przerwa ta stanie się mniej istotna. W konsekwencji wpływ przerwy na reakcję przestrachu będzie słabszy u zwierząt z szumami usznymi w porównaniu z zdrową grupą kontrolną (zredukowane PPI, por. ⁸). Postrzeżenie to jest badane za pomocą dwóch nieco różniących się protokołów.
4. W pierwszym przedstawionym tutaj paradygmacie subiektywnego szumienia usznego (Rycina 2A, środek, por. ⁹) do stymulacji należy zastosować następujące parametry: natężenie dźwięku wywołującego reakcję przestrachową 105 dB SPL z częstotliwościami od 1 do 16 kHz w krokach oktawowych, czas trwania bodźca 6 ms, w tym 2-msowe rampy narastania i opadania o przebiegu cosinus kwadrat. W trakcie eksperymentu należy wprowadzić szum biały w tle o natężeniu 50 dB SPL, z 15-msową przerwą (gap) poprzedzającą bodziec wywołujący reakcję przestrachową o 100 ms lub bez takiej przerwy; dla każdej częstotliwości i warunku przerwy należy przeprowadzić co najmniej 15 prób. W przypadku zastosowania podejścia nielosowego należy zaplanować 5 minut odpoczynku pomiędzy poszczególnymi zestawami bodźców. Zastosowanie różnych częstotliwości bodźca wywołującego reakcję przestrachową pozwoli na przybliżone oszacowanie częstotliwości odczuwanego szumu usznego (tinnitus).
5. Jako drugi subiektywny paradygmat szumów usznych (Rysunek 2A(po prawej) można zastosować następujące parametry stymulacji: natężenie dźwięku wywołującego reakcję przestrachową 105 dB SPL, bodziec w postaci podwójnego kliknięcia o czasie trwania 0,1 ms na kliknięcie i przerwie 0,1 ms między kliknięciami, przy czym drugie kliknięcie ma kierunek odwrócony w stosunku do pierwszego. Należy zastosować w tle szum filtrowany pasmowo o natężeniu 50 dB SPL z szerokością filtra gaussowskiego 0,5 oktawy i częstotliwościami środkowymi w zakresie od 1 do 16 kHz w krokach oktawowych. Szum ten należy podawać z 15-milisekundową przerwą lub bez niej, przy czym przerwa powinna poprzedzać bodziec wywołujący reakcję przestrachową o 100 ms; należy przeprowadzić co najmniej 15 prób dla każdej częstotliwości i stanu przerwy. W przypadku zastosowania podejścia nierandomizowanego należy zachować 5-minutowy czas regeneracji między różnymi zestawami bodźców. Zastosowanie różnych częstotliwości środkowych pasmowego szumu tła pozwoli na uzyskanie przybliżonego szacunku częstotliwości odczuwanego szumu usznego.
6. Postępuj zgodnie z punktami 2.4 do 2.5; znormalizuj wszystkie uzyskane dane za pomocą zestawu danych referencyjnych dla każdej testowanej częstotliwości i każdego stanu urazu, t. j.., przed i po urazie akustycznym. Odniesieniem jest amplituda odpowiedzi na bodziec startowy w postaci czystego tonu bez żadnego bodźca wstępnego (por. 2.3). Częstotliwość jest określana przez czysty ton lub częstotliwość środkową szumu filtrowanego pasmowo. Oblicz średnią odpowiedź dla każdego odniesienia i znormalizuj każdą obliczoną amplitudę odpowiedzi, dzieląc ją przez wartość odniesienia.
7. Oblicz PPI, dzieląc znormalizowane amplitudy odpowiedzi w warunku z przerwą przez średnią znormalizowanych odpowiedzi w warunku bez przerwy dla każdej testowanej częstotliwości.
8. Oblicz procentową zmianę PPI po urazie dla każdej badanej częstotliwości.

Reakcje przestrachu u zwierząt są łatwe do wywołania i analizy. Rysunek 2B przedstawia ogólny widok typowego wyniku dla jednego zwierzęcia stymulowanego czystym tonem o natężeniu 105 dB SPL bez żadnego bodźca wstępnego przez 15 powtórzeń. Większość prób jest poprawna, a próby niepoprawne są łatwe do zidentyfikowania (próby oznaczone czerwonym kwadratem). Amplitudy i latencje odpowiedzi są obliczane wyłącznie na podstawie prób poprawnych.

Typowa zmiana progu behawioralnego przedstawiona jest na Rysunku 3A. Audiogram przykładowego zwierzęcia, uzyskany metodą opisaną w punkcie 2, przedstawiono przed (kolor niebieski) i po (kolor czerwony) urazie akustycznym o częstotliwości 2 kHz (obszar żółty). Wyraźna utrata słuchu widoczna jest konkretnie przy 2 kHz. Reakcje związane z subiektywnym odczuciem szumu usznego (tinnitus) przedstawiono na Rysunku 3B; pokazano przykładowo znormalizowane amplitudy odpowiedzi tego samego zwierzęcia dla stymulacji o oktawę niższą i wyższą od częstotliwości urazu, zgodnie z opisem w punkcie 4.5. Porównanie odpowiedzi na bodźce z przerwą (gap) i bez przerwy przed (kolor niebieski) oraz po urazie (kolor czerwony) pozwala na interpretację możliwego odczucia szumu usznego. Poniżej częstotliwości urazu nie stwierdzono zmiany wzorca odpowiedzi, natomiast powyżej częstotliwości urazu efekt przerwy zanikł po urazie, co wskazuje na błędne postrzeganie (mispercept) przy tej częstotliwości.

Rycina 1. Schemat blokowy programu użytego do pozyskania progów behawioralnych i subiektywnych danych dotyczących szumów usznych. Należy zauważyć, że jest to jedynie uproszczona wersja kodu programu. Skróty: GUI – graficzny interfejs użytkownika; ISI – odstęp międzybodźcowy.

Rysunek 2. Bodźce odpowiedzi startlowej słuchowej (ASR). A Schematy trzech zastosowanych różnych protokołów stymulacji. Panel lewy: hamowanie wstępne (PPI) ASR mierzone bez żadnego testowego bodźca w postaci czystego tonu przed (zielony) tonem startlowym (czerwony); okres odpowiedzi przedstawiono na niebiesko. Panel środkowy: paradygmat przerwa / szum z prezentacją bodźca startlowego w postaci czystego tonu o różnych częstotliwościach na tle białego szumu. Panel prawy: paradygmat przerwa / szum z prezentacją bodźca startlowego w postaci kliknięcia na tle filtrowanym pasmowo o różnych częstotliwościach środkowych. B Przykładowe odpowiedzi startlowe słuchowe z 15 prób zarejestrowanych za pomocą paradygmatu progowego bez żadnego bodźca wstępnego przy częstotliwości stymulacji 1 kHz. Trzy próby uznano za nieważne (czerwone kwadraty), ponieważ zwierzę zaczęło się poruszać jeszcze przed rozpoczęciem stymulacji.

Rysunek 3. Przykładowe wyniki ASR u jednego zwierzęcia. A Próg behawioralny przed (niebieski) i po (czerwony) urazie akustycznym przy 2 kHz (żółty obszar). Progi obliczono na podstawie odpowiedzi na protokół ASR modulowany przez PPI, przyjmując punkt przegięcia funkcji Boltzmanna jako wartość progową. Należy zauważyć, że utrata słuchu przy 2 kHz wynosi ponad 66%, podczas gdy w większej odległości od częstotliwości urazu często można zaobserwować nawet poprawę progów słuchowych. B Znormalizowane amplitudy odpowiedzi (puste kółka: pojedyncze próby, pełne kółka: średnie, wąsy: odchylenie standardowe) podczas stymulacji protokołem ASR z przerwą/szumem (4.5) dla częstotliwości centralnych 1 i 4 kHz. Odpowiedzi zostały uporządkowane dla prób bez i z przerwą w szumie przed i po urazie przy 2 kHz. Tylko przy 4 kHz efekt przerwy znika po urazie, co wskazuje na subiektywne odczuwanie szumu usznego (tinnitus) w okolicy tej częstotliwości.

Dyskusja

Przedstawiamy tanią i łatwą w budowie konfigurację do pomiarów audiometrycznych u gryzoni, opartą na hamowaniu wstępnym (pre-pulse inhibition) akustycznej reakcji przestrachu, która może być wykorzystana do wyznaczenia behawioralnych progów słyszenia (= audiogramów ¹⁰) oraz słuchowych percepcji fantomowych, takich jak subiektywny szum uszny ¹¹. Te ostatnie pomiary są szczególnie istotne w kilku niedawnych raportach ^8,12,13,14 i mogą być uznane za niezbędny warunek dla elektrofizjologiczny...