Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Podsumowanie

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Streszczenie

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków ma kluczowe znaczenie dla badania wpływu analizowanego białka na różne szlaki sygnałowe^1,2. Jednak w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown nie jest tolerowany przez komórki przez dłuższy czas, wymagany jest warunkowy knockdown ekspresji genów^3-5. W niniejszym opracowaniu opisano protokół przygotowania linii komórkowych umożliwiających warunkowy knockdown podjednostek czynnika przebudowy chromatyny ACF. Linie te ułatwiają określenie udziału ACF w indukcji śmierci komórek przez białko E4orf4 adenowirusa⁶. Sekwencje kodujące krótkie napinki RNA (shRNA) dla podjednostek Acf1 i SNF2h czynnika przebudowy chromatyny ACF sklonowano obok promotora indukowalnego doksycykliną w plazmidzie zawierającym również gen oporności na neomycynę. Klony komórkowe oporne na neomycynę wyselekcjonowano w obecności G418 i wyizolowano. Uzyskane linie komórkowe indukowano traktowaniem doksycykliną, a po obniżeniu poziomu ekspresji Acf1 lub SNF2h komórki transfekowano plazmidem kodującym E4orf4 lub pustym wektorem. Aby potwierdzić specyficzny efekt konstruktów shRNA, poziomy białek Acf1 lub SNF2h przywrócono do poziomu WT poprzez kotransfekcję plazmidem ekspresyjnym Acf1 lub SNF2h, które uczyniono opornymi na shRNA poprzez wprowadzenie mutacji cichych. Zdolność E4orf4 do indukcji śmierci komórek w różnych próbkach określono za pomocą testu z DAPI, w którym mierzono częstotliwość występowania jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek^7-9.

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do określenia funkcjonalnego udziału różnych białek w indukcji śmierci komórkowej przez ich białkowe partnery w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown może być letalny dla komórek.

Protokół

1. Generowanie indukowalnych linii komórkowych

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyznaczyć minimalne stężenie leku G418, które zabija wszystkie komórki wykorzystywane do przygotowania pożądanych linii komórkowych. W tym celu wysiewamy wybrane komórki na kilka płyt w dubletach przy konfluencji 70% w pożywce, która będzie stosowana podczas eksperymentu, i dodajemy rosnące stężenia G418 (0-1 000 μg/ml). Komórki należy monitorować codziennie, aby określić minimalne stężenie G418, które skutecznie zabija komórki. Śmierć komórek obserwuje się w ciągu 3-7 dni.
2. Przed generowaniem linii komórkowych zaleca się zweryfikowanie za pomocą testów transfekcji przejściowej, czy plazmid wykazujący ekspresję shRNA może w pewnym stopniu zredukować ekspresję badanego genu. Można to przeprowadzić w dowolnej linii komórkowej, którą można skutecznie transfekować.
3. Wysiewamy komórki T-REx-293 z gęstością około 5x10⁶ komórek na płytę 10 cm w 8 ml pożywki DMEM (zawierającej 10% FBS zatwierdzonego dla systemu Tet, 2mM L-glutaminy, 100 j/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny oraz 5 μg/ml blasticydyny). Płyty inkubujemy przez noc w 37 °C, 5% CO₂.
4. Następnego dnia, przed transfekcją, wymieniamy pożywkę na 8 ml świeżej pożywki.
5. Transfekujemy komórki, używając 10 μg plazmidu pSuperior.neo+GFP (Rysunek 1) kodującego shRNA dla Acf1 lub SNF2h pod kontrolą tetracyklinowo-indukowalnego promotora H1, a także genu oporności na neomycynę połączonego z GFP i pod kontrolą konstytutywnego promotora PGK. DNA dodajemy do 500 μl 150 mM NaCl. Odczynnik jetPIE dodajemy do innej aalikwoty 500 μl 150 mM NaCl w ilości 2 μl na μg DNA. Roztwór jetPIE dodajemy do DNA i dobrze mieszamy za pomocą wortexa. Inkubujemy przez 15 min w temperaturze pokojowej. Kompleksy DNA delikatnie nanosimy pipetą na płyty 10 cm zawierające komórki o konfluencji 70-80%. Płyty przenosimy z powrotem do inkubatora.
6. Następnego dnia wymieniamy pożywkę na pożywkę selektywną (pożywka DMEM opisana powyżej, zawierająca dodatkowo 500 μg/ml G418).
7. Przez następne dwa tygodnie monitorujemy komórki i wymieniamy pożywkę selektywną na podobną świeżą pożywkę co 3-4 dni, aż pojawią się kolonie, które można będzie zobaczyć bez użycia mikroskopu.
8. Przed izolacją kolonii przygotowujemy płytki 24-dołkowe z pożywką selektywną.
9. Kolonie identyfikujemy wzrokowo i zaznaczamy ich lokalizację na spodzie płyty za pomocą kolorowego markera. Pod mikroskopem weryfikujemy, czy kolonie są dobrze odseparowane.
10. W komorze sterylnej odsysamy pożywkę z płyty, delikatnie płuczemy ciepłym PBS i dokładnie odsysamy całą pozostałą ciecz. Do jednej kolonii na płycie dodajemy 3 μl 0,25% trypsyny/EDTA. Trypsynujemy wielokrotnie pipetowaniem, aż komórki odkleją się, a następnie przenosimy je do jednego z dołków w płytce 24-dołkowej. Powtarzamy tę procedurę dla kilku innych kolonii na płycie.
11. Hodujemy komórki w 37 °C, 5% CO₂, aż wypełnią dołek. Następnie komórki pochodzące z każdej z oryginalnych kolonii dzielimy na trzy dołki, każdy w osobnej płytce 12-dołkowej, i inkubujemy przez noc.
12. Następnego dnia wymieniamy pożywkę w jednej płytce na pożywkę zawierającą 1 μg/ml doksycykliny z roztworu stokowego przygotowanego w wodzie dwukrotnie destylowanej (1-5 mg/ml). W płytce kontrolnej wymieniamy pożywkę na pożywkę bez doksycykliny. Komórki inkubujemy przez 72 h w 37 °C, 5% CO₂.
13. Zbieramy komórki z jednego dołka traktowanego i jednego nietraktowanego z każdego klonu komórkowego w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot, aby określić wydajność wyciszania Acf1 lub SNF2h. Stosujemy przeciwciała przeciwko Acf1 lub SNF2h, a także przeciwciała przeciwko alfa-tubulinie, służącej jako kontrola ładunku. Komórki w trzecim dołku, pozostawione bez traktowania, wykorzystujemy do namnażania wybranych klonów komórkowych, w których dodanie doksycykliny doprowadziło do co najmniej 50% redukcji poziomu badanego białka. Alikwoty tych komórek zamrażamy w 90% FBS i 10% DMSO do dalszego wykorzystania.

2. Indukcja wyciszenia genu i transfekcja

1. Wysiać komórki w pożywce selektywnej na płytkach 10 cm. Do połowy płytek dodać doksycyklinę w stężeniu 1 μg/ml i inkubować w 37°C, 5% CO₂ przez 48-72 h (patrz Rycina 4).
2. Po 48-72 h poddać komórki z każdej grupy trypsynizacji, przeliczyć je i wysiać 1,5x10⁶ komórek na płytkę 6 cm w tej samej pożywce, z doksycykliną lub bez niej. Inkubować komórki w 37°C, 5% CO₂ przez noc. Zaplanować proces tak, aby każda grupa płytek z sekcji 2.1 dostarczyła komórek na dwanaście płytek 6 cm, w tym dwa duplikaty do analizy DAPI dla każdego punktu oraz jedną płytkę do analizy Western blot dla każdej próbki (patrz Rycina 4).
3. Następnego dnia przeprowadzić transfekcję komórek na płytkach 6 cm z następującymi kombinacjami plazmidów: 1 μg pustego plazmidu lub taka sama ilość plazmidu kodującego E4orf4, wraz z 4 μg wektora wykazującego ekspresję Acf1-GFP lub SNF2h-GFP, który został uczyniony odpornym na shRNA w klonach komórkowych poprzez wprowadzenie mutacji cichych, lub 3 μg odpowiadającego pustego wektora i 1 μg plazmidu wykazującego ekspresję GFP (Rycina 4). Do przygotowania mieszaniny do transfekcji użyć odczynnika jetPIE zgodnie z powyższym opisem (10 μl na 5 μg DNA). Dla każdej próbki przygotować mieszaninę do transfekcji na trzy płytki.
4. Po 15-minutowej inkubacji DNA z odczynnikiem jetPIE w temperaturze pokojowej, ostrożnie nanieść pipetą równe ilości kompleksów DNA z każdej mieszaniny do transfekcji na trzy płytki 6 cm i inkubować w 37°C, 5% CO₂ przez noc.

3. Analiza DAPI w komórkach transfekowanych

1. Następnego dnia wyizoluj białka z jednej płytki na próbkę do analizy Western blot, aby potwierdzić efektywny knockdown Acf1 lub SNF2h oraz równomierną ekspresję E4orf4 w różnych próbkach.
2. Odsącz pożywkę z płytek przeznaczonych do testu DAPI, delikatnie przemyj płytki PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu przygotowanego w PBS, aby pokryć komórki. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu oraz traktowanie komórek tym odczynnikiem należy przeprowadzać w dygestorium. Inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
3. Odsącz paraformaldehyd i przemyj trzy razy PBS, kołysząc płytkami w temperaturze pokojowej przez 5 min przy każdym płukaniu. Dodaj 80% etanol przechowywany w -20 °C i inkubuj w -20 °C przez co najmniej 1 hr. Płytki można przechowywać w etanolu w -20 °C przez kilka dni, pod warunkiem, że są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu etanolu i wysychaniu.
4. Odsącz etanol i przemyj komórki dwukrotnie PBS oraz raz PBS-BT (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,05% tween-20), kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 min przy każdym płukaniu.
5. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał, zablokuj komórki w 1 ml buforu PBS-BT zawierającego 10% surowicy koziej przez 20 min podczas kołysania w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w PBS-BT, po 5 min na każde płukanie.
6. Inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym (w naszym przypadku przeciwciałem specyficznym dla E4orf4) w 1 ml PBS-BT przez 1 hr podczas kołysania w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj dwukrotnie w PBS-BT i raz w PBS zawierającym 0,1% BSA, po 5 min na każde płukanie.
7. Inkubuj komórki w 1 ml PBS-0,1% BSA zawierającego odpowiednie przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie i DAPI w końcowym stężeniu 0,5 μg per ml przez 40 min podczas kołysania w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przemyj PBS przez 5 min, dokładnie osusz przez odsysanie i pozostaw płytki odwrócone do góry dnem na dodatkową godzinę lub na noc, aby osiągnąć całkowite wysuszenie. Następnie zamocuj szkiełka nakrywkowe na komórkach, używając roztworu Fluoromount-G. Przechowuj płytki w 4 °C w ciemności do momentu zliczania jąder apoptotycznych.
8. Poproś współpracownika o oznaczenie płytek nowymi numerami, aby zliczanie jąder apoptotycznych w różnych próbkach mogło odbyć się w sposób obiektywny (ślepa próba).
9. Wizualizuj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400X (w powietrzu) lub 630X (w oleju imersyjnym). Zidentyfikuj komórki transfektowane, które zostały zabarwione na poszczególne białka ekspresjonowane w każdej próbce, i policz liczbę skondensowanych lub pofragmentowanych jąder uwidocznionych w barwieniu DAPI w populacji komórek transfektowanych. Monitoruj kilka pól widzenia i policz łącznie co najmniej 200 komórek transfektowanych.
10. Oblicz procent jąder o morfologii apoptotycznej w populacji komórek transfektowanych. Powtórz eksperyment w duplikatach 2-3 razy, aby obliczyć istotność statystyczną zmian między poszczególnymi próbkami.

4. Reprezentatywne wyniki

Wydajność uzyskiwania kolonii, w których warunkowy knockdown ekspresji genu przebiegł pomyślnie, jest zmienna i zależy od analizowanego genu. W naszych badaniach uzyskaliśmy 7 pomyślnych kolonii z 12 przetestowanych dla Acf1 oraz 6 z 18 dla SNF2h. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną płytkę z wybranymi klonami komórkowymi (Rysunek 2A) oraz pojedynczą kolonią (Rysunek 2B). Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny blot przygotowany z białek wyekstrahowanych z komórek różnych klonów hodowanych w obecności lub w nieobecności doksycykliny przez 72 hr. Blot zabarwiono przeciwciałami przeciwko SNF2h oraz przeciwko alfa-tubulinie, która służyła jako kontrola załadunku. Dwa z klonów (numer 4 i 5) wykazały silną redukcję poziomu SNF2h po indukcji doksycykliną. Należy zauważyć, że choć plazmid pSuperior.neo+GFP (Rysunek 1) użyty do generowania linii komórkowych koduje białko fuzyjne neo-GFP, fluorescencja zielona w stabilnych liniach komórkowych była bardzo niska, a ekspresję innych białek fuzyjnych GFP wprowadzonych przejściowo do tych komórek można było łatwo wykryć powyżej tła fluorescencji zielonej.

Schematyczna reprezentacja eksperymentów przeprowadzonych na klonach komórkowych w celu zmierzenia wpływu wyciszenia Acf1 lub SNF2h na indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek przedstawiona jest na Rysunku 4. Czas wymagany do wyciszenia ekspresji genu poprzez traktowanie doksycykliną może się różnić w zależności od stabilności białka, którego poziomy mają zostać obniżone. W przypadku Acf1 i SNF2h, do efektywnego wyciszenia na poziomie białka wymagane było 72 h traktowania.

Rycina 5 przedstawia przykład komórek wykazujących ekspresję E4orf4 i GFP, w których zachodzi śmierć komórkowa objawiająca się pojawieniem się jąder barwionych DAPI o skondensowanej lub pofragmentowanej morfologii. Rycina 6 przedstawia wyniki reprezentatywnego eksperymentu wykazującego, że indukowane doksycykliną wyciszenie Acf1 doprowadziło do zwiększenia stymulowanej przez E4orf4 śmierci komórek (Rycina 6A). Wzrost ten nie wynikał ze zwiększenia poziomu E4orf4 (Rycina 6B). Ponadto przywrócenie Acf1 w komórkach indukowanych doksycykliną zmniejszyło wzrost toksyczności E4orf4 do poziomów obserwowanych w komórkach nieindukowanych (Rycina 6).

Rycina 1. Mapa plazmidu pSuperior.neo+GFP. Mapa przedstawia indukowalny tetracykliną promotor H1 sterujący ekspresją shRNA oraz promotor PGK sterujący ekspresją białka fuzyjnego neo-GFP. Mapa została opracowana na podstawie instrukcji pSuperior firmy OligoEngine.

Rysunek 2. Identyfikacja kolonii opornych na neomycynę. Przedstawiono zdjęcia płytki zawierającej kolonie (A) oraz pojedynczej kolonii (B). Kolonie uzyskano poprzez hodowlę komórek przez 14 dni w medium selektywnym zawierającym neomycynę.

Rysunek 3. Ocena wydajności wyciszenia genów w wybranych koloniach. Komórki z kilku kolonii wyselekcjonowanych w obecności neomycyny wysiano w duplikacie. Jedną studzienkę z każdej próbki indukowano doksycykliną (+), a drugą pozostawiono bez traktowania (-). Białka wyekstrahowano 72 hr po indukcji i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Western blot barwiono sukcesywnie przeciwciałami przeciwko SNF2h oraz przeciwko alpha-Tubulinie (pełniącej rolę kontroli załadunku), co pokazuje poziomy SNF2h w komórkach indukowanych i kontrolnych.

Rycina 4. Planowanie typowego eksperymentu z wykorzystaniem testu knockdown-DAPI. Przedstawiono kolejne etapy eksperymentu, w tym traktowanie doksycykliną w celu uzyskania knockdownu Acf1 lub SNF2h, transfekcję w celu przywrócenia ekspresji Acf1 lub SNF2h bądź wprowadzenia pustego wektora, a także wprowadzenie E4orf4 lub odpowiadającego mu pustego wektora do komórek oraz analizę wyników. Płytki traktowane doksycykliną zaznaczono na czerwono (Dox), a płytki kontrolne na niebiesko. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rysunek 5. Detekcja śmierci komórek indukowanej przez E4orf4 za pomocą testu DAPI. Komórki poddane różnym zabiegom opisanym na Rysunku 4 zostały utrwalone i zabarwione przeciwciałami specyficznymi dla E4orf4 oraz DAPI w celu wizualizacji jąder komórek transfektowanych. Przedstawione zdjęcie pochodzi z próbki zawierającej E4orf4 oraz kontrolne białko GFP. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Obrazy nałożone. Białe strzałki wskazują komórki transfektowane GFP i E4orf4 zawierające jądra o morfologii apoptotycznej. Czerwone strzałki wskazują jądra o nieregularnych kształtach, które nie zostały uznane za jądra apoptotyczne. Gwiazdkami oznaczono jądra w fazie mitozy lub jądra, które właśnie uległy podziałowi.

Rycina 6. Wyciszenie Acf1 nasila indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. (A) Komórki z linii pochodzącej z T-REx-293, wykazującej ekspresję Acf1-shRNA z promotora indukowanego tetracykliną, indukowano doksycykliną (+Dox) lub pozostawiono nieleczone (-Dox). Trzy dni później komórki transfekowano plazmidami wykazującymi ekspresję E4orf4 (+E4orf4) lub pustym wektorem (-E4orf4) wraz z pustym wektorem lub plazmidem wykazującym ekspresję Acf1 z tagiem GFP, który stał się odporny na shRNA dzięki wprowadzeniu mutacji cichych. Komórki utrwalono dwadzieścia cztery godziny po transfekcji i barwiono przeciwciałami przeciwko E4orf4 oraz DAPI. Indukcję śmierci komórek mierzono za pomocą opisanego powyżej testu DAPI i określono procent transfekowanych komórek z kondensacją lub fragmentacją jąder. Przedstawiono reprezentatywny eksperyment z trzema powtórzeniami, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (B) Komórki z równoległych płytek zebrano do analizy Western blot. Blot barwiono przeciwciałami przeciwko E4orf4, GFP i Acf1. Endogenne Acf1 oraz Acf1-GFP przedstawiono na dwóch oddzielnych panelach.

Dyskusja

Wyciszanie ekspresji konkretnych genów jest istotnym podejściem do badania roli białka w szlakach regulacyjnych. Ponieważ konstytutywne wyciszenie ekspresji genów niezbędnych dla życia negatywnie wpływa na proliferację komórek, ich badanie może wymagać albo przejściowego wprowadzenia siRNAs, albo zastosowania stabilnych systemów warunkowego wyciszania. Generowanie stabilnych linii komórkowych z możliwością indukowanej lekiem ekspresji shRNAs, opisane w niniejszej pracy, daje przewagę nad transfekcjami przejściowymi, któr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM z wysoką zawartością glukozy	Gibco	41965
FBS zatwierdzony do systemu Tet	Clontech	631106
L-glutamina	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200
komórki T-REx-293	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticydyna	Invitrogen	R210-01
plazmida pSuperior.neo+GFP	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfection	101-40
doksycyklina	Sigma	D9891
paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710
4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01