Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego knockdownu ekspresji genów i pomiar efektów knockdown na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4

Summary

Zmierzono udział czynnika przebudowy chromatyny ACF w śmierci komórki wywołanej przez E4orf4. Protokół obejmuje wybór klonów komórek, w których leczenie doksycykliną indukuje warunkowe knockdown podjednostek ACF Acf1 i SNF2h oraz zastosowanie testu DAPI do pomiaru śmierci komórki indukowanej przez E4orf4 w indukowalnych liniach komórkowych.

Abstract

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest kluczowa dla badania udziału białka będącego przedmiotem zainteresowania w różnych szlakach^1,2. Jednak warunkowe wyłączenie ekspresji genów jest wymagane w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown nie jest tolerowany przez komórki przez długi okres czasu^3-5. W tym miejscu opisano protokół przygotowania linii komórkowych umożliwiający warunkowe wyłączenie podjednostek czynnika przebudowy chromatyny ACF. Te linie komórkowe ułatwiają określenie udziału ACF w indukcji śmierci komórki przez białko adenowirusa E4orf4⁶. Sekwencje kodujące krótkie RNA spinki do włosów dla podjednostek Acf1 i SNF2h czynnika przebudowy chromatyny ACF sklonowano obok promotora indukowanego doksycykliną w plazmidzie zawierającym również gen oporności na neomycynę. Klony komórek opornych na neomycynę wybrano w obecności G418 i wyizolowano. Powstałe linie komórkowe indukowano przez leczenie doksycykliną, a po zmniejszeniu poziomu ekspresji Acf1 lub SNF2h komórki transfekowano plazmidem kodującym E4orf4 lub pustym wektorem. Aby potwierdzić specyficzne działanie konstruktów shRNA, poziomy białka Acf1 lub SNF2h zostały przywrócone do poziomów WT poprzez kotransfekcję z plazmidem eksprymującym Acf1 lub SNF2h, które stały się odporne na shRNA poprzez wprowadzenie cichych mutacji. Zdolność E4orf4 do indukowania śmierci komórki w różnych próbkach określono za pomocą testu DAPI, w którym zmierzono częstość pojawiania się jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek^7-9.

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do określenia funkcjonalnego wkładu różnych białek w indukcję śmierci komórki przez ich białkowych partnerów w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown może być śmiertelny dla komórki.

Protocol

1. Generowanie indukowalnych linii komórkowych

1. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy ustalić minimalne stężenie leku G418, który zabija wszystkie komórki użyte do przygotowania pożądanych linii komórkowych. W tym celu należy umieścić wybrane komórki na kilku zduplikowanych płytkach z 70% zbieżnością w pożywce, która zostanie użyta podczas eksperymentu i dodać rosnące stężenia G418 (0-1,000 μg na ml). Codziennie monitoruj komórki, aby określić minimalne stężenie G418, które skutecznie zabija komórki. Śmierć komórki obserwuje się w ciągu 3-7 dni.
2. Przed generacją linii komórkowych zaleca się sprawdzenie za pomocą testów transfekcji przejściowej, czy plazmid wyrażający shRNA może w pewnym stopniu zmniejszyć ekspresję badanego genu. Można to zrobić w dowolnej linii komórkowej, która może być skutecznie transfekowana.
3. Płytki komórek T-REx-293 o gęstości około 5x10⁶ komórek na 10 cm płytki w 8 ml pożywki DMEM (zawierającej 10% zatwierdzonego przez system Tet FBS, 2mM L-glutaminy, 100 jednostek na ml penicyliny i 0,1 mg na ml streptomycyny, 5 μg na ml blasticydyny). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Następnego dnia zmień pożywkę na 8 ml świeżej pożywki przed transfekcją.
5. Transfekcja komórek za pomocą 10 μg plazmidu pSuperior.neo + GFP (Figura 1) kodującego shRNA Acf1 lub SNF2h sterowanego przez indukowany tetracykliną promotor H1, a także gen oporności na neomycynę połączony z GFP i napędzany przez konstytutywny promotor PGK. Dodać DNA do 500 μl 150 mM NaCl. Dodać odczynnik jetPIE do innej podwielokrotności 500 μl 150 mM NaCl w stężeniu 2 μl na μg DNA. Dodaj roztwór jetPIE do DNA i dobrze wymieszaj, wirując. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie pipetuj kompleksy DNA na 10-centymetrowe płytki zawierające 70-80% zlewających się komórek. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.
6. Następnego dnia zastąp pożywkę selektywną pożywką (pożywka DMEM, jak opisano powyżej, zawierająca dodatkowe 500 μg na ml G418).
7. Przez następne dwa tygodnie monitoruj komórki i zastępuj selektywną pożywkę podobną świeżą pożywką co 3-4 dni, aż pojawią się kolonie, które będzie można uwidocznić bez mikroskopu.
8. Przed izolacją kolonii należy przygotować 24-dołkowe płytki z selektywną pożywką.
9. Zidentyfikuj kolonie na oko i zaznacz ich położenie na dole płytki za pomocą kolorowego markera. Sprawdź pod mikroskopem, czy kolonie są dobrze oddzielone.
10. W sterylnym kapturze odessać pożywkę z płytki, delikatnie spłukać ciepłym PBS i dobrze odessać cały pozostały płyn. Dodać 3 μl 0,25% trypsyny/EDTA do jednej kolonii na płytce. Kilkakrotnie pipetować trypsynę, aż komórki się oderwą i dodać je do jednego z dołków w 24-dołkowej płytce. Powtórz to dla kilku innych kolonii na talerzu.
11. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 aż} do napełnienia studzienki. Następnie podziel komórki pochodzące z każdej z pierwotnych kolonii na trzy dołki, każda na osobnej 12-dołkowej płytce i inkubuj przez noc.
12. Następnego dnia zastąpić pożywkę w jednej płytce pożywką zawierającą 1 μg na ml doksycykliny z roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie podwójnie destylowanej (1-5 mg na ml). Wymienić pożywkę w płytce kontrolnej na pożywkę bez doksycykliny. Inkubować komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
13. Z każdego klonu komórkowego należy pobrać komórki z jednej studzienki poddanej działaniu substancji i jednej niepoddanej działaniu substancji w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot w celu określenia skuteczności knockdownu Acf1 lub SNF2h. Użyj przeciwciał przeciwko Acf1 lub SNF2h, a także przeciwciał przeciwko alfa-tubulinie, służąc jako kontrola obciążenia. Komórki w trzeciej studzience, pozostawione niepoddane leczeniu, wykorzystać do ekspansji wybranych klonów komórkowych, w których dodatek doksycykliny doprowadził do co najmniej 50% obniżenia poziomu badanego białka. Zamroź porcje tych komórek w 90% FBS, 10% DMSO do dalszego wykorzystania.

2. Indukcja powalenia i transfekcji

1. Komórki płytkowe w podłożu selektywnym na płytkach 10 cm. Dodać doksycyklinę w stężeniu 1 μg na ml do połowy płytek i inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 48-72 godziny (patrz rysunek 4).
2. Po 48-72 godzinach trypsynizuj komórki z każdej grupy komórek, policz je i umieść 1,5x10⁶ komórek na 6 cm płytce w tym samym podłożu, z doksycykliną lub bez. Inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez noc. Zaplanuj tak, aby każda grupa płytek z sekcji 2.1 zawierała komórki dla dwunastu płytek o średnicy 6 cm, w tym dwóch duplikatów do testu DAPI dla każdego punktu, jak również jedną płytkę do analizy Western blot każdej próbki (patrz rysunek 4).
3. Następnego dnia przetacza się komórki na 6 cm płytkach z następującymi kombinacjami plazmidów: 1 μg pustego plazmidu lub identyczna ilość plazmidu kodującego E4orf4 wraz z 4 μg wektora wykazującego ekspresję Acf1-GFP lub SNF2h-GFP, który stał się odporny na shRNA w klonach komórek poprzez wprowadzenie cichych mutacji, lub 3 μg odpowiedniego pustego wektora i 1 μg plazmidu wykazującego ekspresję GFP (ryc. 4). Użyć odczynnika jetPIE, jak opisano powyżej (10 μl na 5 μg DNA), aby przygotować mieszankę transfekcyjną. Dla każdej próbki należy przygotować mieszankę do transfekcji na trzy płytki.
4. Po 15-minutowej inkubacji DNA z odczynnikiem jetPIE w temperaturze pokojowej, delikatnie odpipetować równe ilości kompleksów DNA z każdej mieszanki transfekcyjnej na trzy płytki o średnicy 6 cm i inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez noc.

3. Test DAPI w transfekowanych komórkach

1. Następnego dnia wyekstrahuj białka z jednej płytki na próbkę do analizy Western blot, aby ustalić, czy Acf1 lub SNF2h zostały skutecznie strącone i że E4orf4 uległ równomiernej ekspresji w różnych próbkach.
2. Odessać pożywkę z płytek przeznaczonych do testu DAPI, delikatnie przemyć płytki PBS i dodać 1 ml 4% paraformaldehydu przygotowanego w PBS w celu pokrycia komórek. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu i traktowanie komórek tą substancją chemiczną powinno odbywać się w kapturze chemicznym. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
3. Odessać paraformaldehyd i przemyć trzykrotnie PBS, za każdym razem kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 80% etanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę. Płytki mogą być przechowywane w etanolu w temperaturze -20 °C przez kilka dni, o ile są dobrze uszczelnione, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu etanolu.
4. Odessać etanol i przemyć ogniwa dwukrotnie PBS i raz PBS-BT (PBS zawierający 0,5% BSA i 0,05% tween-20), kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 minut za każdym razem.
5. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał, zablokuj komórki w 1 ml buforu PBS-BT zawierającego 10% koziej surowicy na 20 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki dwukrotnie w PBS-BT, po 5 minut każde mycie.
6. Inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym (w naszym przypadku przeciwciałem specyficznym dla E4orf4) w 1 ml PBS-BT przez 1 godzinę, kołysząc się w temperaturze pokojowej. Następnie umyć dwa razy w PBS-BT i raz w PBS zawierającym 0,1% BSA, po 5 minut każde pranie.
7. Inkubować komórki w 1 ml PBS-0,1% BSA zawierającym odpowiednie wtórne przeciwciało znakowane fluorescencyjnie i 0,5 μg na ml końcowego stężenia DAPI przez 40 minut, kołysząc się w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie myj PBS przez 5 minut, dobrze wysusz przez aspirację i trzymaj płytki do góry nogami przez dodatkową godzinę do nocy, aby uzyskać całkowite wyschnięcie. Następnie zamontuj szkiełka pokrywy na ogniwach, używając roztworu Fluoromount-G. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C w ciemności, aż będą gotowe do policzenia jąder apoptozy.
8. Poproś kolegę, aby zidentyfikował różne płytki za pomocą nowych liczb, aby liczenie jąder apoptotycznych w różnych próbkach można było przeprowadzić w bezstronny sposób.
9. Wizualizuj komórki pod pionowym mikroskopem fluorescencyjnym w powiększeniu 400X (w powietrzu) lub 630X (w olejku immersyjnym). Zidentyfikuj transfekowane komórki, które są barwione pod kątem różnych białek wyrażonych w każdej próbce, i policz liczbę skondensowanych lub fragmentaryzowanych jąder uwidocznionych przez barwienie DAPI w transfekowanej populacji komórek. Monitoruj kilka pól i policz w sumie co najmniej 200 transfekowanych komórek.
10. Obliczyć procent jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek. Powtórz eksperyment z duplikatami 2-3 razy, aby obliczyć istotność statystyczną zmian między różnymi próbkami.

4. Reprezentatywne wyniki

Efektywność uzyskania kolonii, w których warunkowe eliminację ekspresji genu zakończyło się sukcesem, jest zmienna, w zależności od zaangażowanego genu. W naszych rękach uzyskaliśmy 7 udanych kolonii z 12 testowanych na obecność Acf1 i 6 z 18 na SNF2h. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną płytkę wybranych klonów komórkowych (Figura 2A), a także pojedynczą kolonię (Figura 2B). Rycina 3 przedstawia reprezentatywną plamę przygotowaną z białek wyekstrahowanych z komórek różnych klonów hodowanych w obecności lub bez doksycykliny przez 72 godziny. Blot został wybarwiony przeciwciałami przeciwko SNF2h i alfa-tubulinie, służąc jako kontrola obciążenia. Dwa z klonów (numer 4 i 5) wykazały silne obniżenie poziomów SNF2h po indukcji doksycykliny. Należy zauważyć, że chociaż plazmid pSuperior.neo + GFP (Figura 1) używany do generowania linii komórkowych koduje białko fuzyjne neo-GFP, zielona fluorescencja w stabilnych liniach komórkowych była bardzo niska, a ekspresję innych białek fuzyjnych GFP wprowadzonych przejściowo do tych komórek można było łatwo wykryć powyżej zielonej fluorescencji tła.

Schematyczne przedstawienie eksperymentów przeprowadzonych na klonach komórek w celu zmierzenia wpływu knockdownu Acf1 lub SNF2h na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4 jest pokazane na rysunku 4. Czas potrzebny do obniżenia ekspresji genów przez leczenie doksycykliną może się różnić w zależności od stabilności białka, którego poziom powinien zostać zmniejszony. W przypadku Acf1 i SNF2h wymagana była 72-godzinna kuracja w celu skutecznego knockdown na poziomie białka.

Rysunek 5 pokazuje przykład komórek wykazujących ekspresję E4orf4 i GFP oraz przechodzących śmierć komórki, objawiającą się pojawieniem się jąder barwionych DAPI o skondensowanej lub fragmentarycznej morfologii. Rycina 6 przedstawia wyniki reprezentatywnego eksperymentu wykazującego, że knockdown Acf1 wywołany doksycykliną doprowadził do wzrostu śmierci komórek stymulowanej przez E4orf4 (Figura 6A). Wzrost ten nie wynikał ze wzrostu poziomów E4orf4 (Figura 6B). Co więcej, przywrócenie Acf1 do komórek indukowanych doksycykliną zmniejszyło wzrost toksyczności E4orf4 do poziomów obserwowanych w komórkach nieindukowanych (Figura 6).

Rysunek 1. Mapa plazmidu pSuperior.neo+GFP. Mapa przedstawia indukowany tetracykliną promotor H1 napędzający ekspresję shRNA oraz promotor PGK napędzający ekspresję białka fuzyjnego neo-GFP. Mapa została zaadaptowana z podręcznika OligoEngine pSuperior.

Rysunek 2. Identyfikacja kolonii opornych na neomycynę. Pokazane są obrazy płytki zawierającej kolonie (A) i pojedynczej kolonii (B). Kolonie uzyskano poprzez hodowlę komórek przez 14 dni w selektywnej pożywce zawierającej neomycynę.

Rysunek 3. Badanie skuteczności knockdownu w wybranych rodzinach. Komórki kilku kolonii wyselekcjonowanych w obecności neomycyny posiewano w zduplikowanych studzienkach. Jeden studzienkę z każdej próbki został wywołany przez doksycyklinę (+), a jeden studzienkę pozostawiono niepoddawaną działaniu środka (-). Białka wyekstrahowano 72 godziny po indukcji i poddano chromatografii na SDS-PAGE. Western blot był barwiony kolejno przeciwciałami przeciwko SNF2h i alfa-tubulinie (służącej jako kontrola obciążenia) i wykazuje poziomy SNF2h w komórkach indukowanych i kontrolnych.

Rysunek 4. Planowanie typowego eksperymentu testowego DAPI knockdown-knockdown. Pokazano kolejne etapy eksperymentu, w tym leczenie doksycykliną w celu uzyskania knockdownu Acf1 lub SNF2h, transfekcję w celu przywrócenia ekspresji Acf1 lub SNF2h lub wprowadzenie pustego wektora i wprowadzenie E4orf4 lub odpowiadającego mu pustego wektora do komórek oraz analizę wyników. Płytki nasączone doksycykliną są oznaczone kolorem czerwonym (Dox), a płytki kontrolne są oznaczone kolorem niebieskim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Wykrywanie śmierci komórki indukowanej przez E4orf4 za pomocą testu DAPI. Komórki, które poddano różnym zabiegom opisanym na rycinie 4, utrwalono i wybarwiono przeciwciałami specyficznymi dla E4orf4 i DAPI w celu uwidocznienia jąder transfekowanych komórek. Ten konkretny obraz został wykonany z próbki zawierającej E4orf4 i kontrolne białko GFP. a) Dobra praktyka rolnicza. b) E4orf4. (C) DAPI. (D) Scalone obrazy. Białe strzałki oznaczają transfekowane GFP i E4orf4 komórki zawierające jądra o morfologii apoptotycznej. Czerwone strzałki oznaczają jądra o nieregularnych kształtach, które nie są liczone jako jądra apoptotyczne. Gwiazdki oznaczają jądra mitotyczne lub jądra, które właśnie się podzieliły.

Rysunek 6. Nokaut Acf1 zwiększa śmierć komórki indukowaną przez E4orf4. (A) Komórki z linii komórkowej pochodzącej z T-REx-293 eksprymującej Acf1-shRNA z promotora indukowanego tetracykliną indukowano doksycykliną (+Dox) lub pozostawiono bez leczenia (-Dox). Trzy dni później komórki zostały transfekowane plazmidami eksprymującymi E4orf4 (+E4orf4) lub pustym wektorem (-E4orf4) wraz z pustym wektorem lub plazmidem eksprymującym Acf1 znakowany GFP, który stał się odporny na shRNA przez wprowadzenie cichych mutacji. Komórki utrwalono dwadzieścia cztery godziny po transfekcji i wybarwiono przeciwciałami przeciwko E4orf4 i DAPI. Indukcję śmierci komórki mierzono za pomocą opisanego powyżej testu DAPI i określono odsetek transfekowanych komórek ze skondensowanymi lub fragmentarycznymi jądrami. Pokazano reprezentatywny eksperyment z trzema powtórzeniami, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (B) Komórki z równoległych płytek zostały pobrane do analizy Western blot. Plama została wybarwiona przeciwciałami przeciwko E4orf4, GFP i Acf1. Endogenne Acf1 i Acf1-GFP są pokazane w dwóch oddzielnych panelach.

Discussion

Obniżenie ekspresji określonych genów jest ważnym podejściem do badania udziału białka w szlakach regulacyjnych. Ponieważ konstytutywny knockdown ekspresji niezbędnych genów negatywnie wpływa na proliferację komórek, ich badanie może wymagać albo przejściowego wprowadzenia siRNA, albo zastosowania stabilnych systemów warunkowego knockdownu. Generowanie stabilnych linii komórkowych ze zdolnością do indukowanej lekami ekspresji shRNA daje przewagę nad przejściowymi transfekcjami, które mogą nie być skuteczne w wielu liniac...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM o wysokim poziomie glukozy	Gibco	41965
Zatwierdzony system Tet FBS	Clontech	631106
L-glutamina	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200
T-REx-293 komórki	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticydyna	Invitrogen	R210-01
pSuperior.neo+GFP plazmid	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
transfekcja	jetPIE	101-40
doksycyklina	Sigma	D9891
paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Nauki	15710
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01