Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego knockdownu ekspresji genów i pomiar efektów knockdown na śmierć komórki wywołaną przez E4orf4

Summary

Zmierzono udział czynnika przebudowy chromatyny ACF w śmierci komórki wywołanej przez E4orf4. Protokół obejmuje wybór klonów komórek, w których leczenie doksycykliną indukuje warunkowe knockdown podjednostek ACF Acf1 i SNF2h oraz zastosowanie testu DAPI do pomiaru śmierci komórki indukowanej przez E4orf4 w indukowalnych liniach komórkowych.

Abstract

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest kluczowa dla badania udziału białka będącego przedmiotem zainteresowania w różnych szlakach^1,2. Jednak warunkowe wyłączenie ekspresji genów jest wymagane w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown nie jest tolerowany przez komórki przez długi okres czasu^3-5. W tym miejscu opisano protokół przygotowania linii komórkowych umożliwiający warunkowe wyłączenie podjednostek czynnika przebudowy chromatyny ACF. Te linie komórkowe ułatwiają określenie udziału ACF w indukcji śmierci komórki przez białko adenowirusa E4orf4⁶. Sekwencje kodujące krótkie RNA spinki do włosów dla podjednostek Acf1 i SNF2h czynnika przebudowy chromatyny ACF sklonowano obok promotora indukowanego doksycykliną w plazmidzie zawierającym również gen oporności na neomycynę. Klony komórek opornych na neomycynę wybrano w obecności G418 i wyizolowano. Powstałe linie komórkowe indukowano przez leczenie doksycykliną, a po zmniejszeniu poziomu ekspresji Acf1 lub SNF2h komórki transfekowano plazmidem kodującym E4orf4 lub pustym wektorem. Aby potwierdzić specyficzne działanie konstruktów shRNA, poziomy białka Acf1 lub SNF2h zostały przywrócone do poziomów WT poprzez kotransfekcję z plazmidem eksprymującym Acf1 lub SNF2h, które stały się odporne na shRNA poprzez wprowadzenie cichych mutacji. Zdolność E4orf4 do indukowania śmierci komórki w różnych próbkach określono za pomocą testu DAPI, w którym zmierzono częstość pojawiania się jąder o morfologii apoptotycznej w populacji transfekowanych komórek^7-9.

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do określenia funkcjonalnego wkładu różnych białek w indukcję śmierci komórki przez ich białkowych partnerów w przypadkach, gdy konstytutywny knockdown może być śmiertelny dla komórki.

Protocol

1. Generowanie indukowalnych linii komórkowych

1. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy ustalić minimalne stężenie leku G418, który zabija wszystkie komórki użyte do przygotowania pożądanych linii komórkowych. W tym celu należy umieścić wybrane komórki na kilku zduplikowanych płytkach z 70% zbieżnością w pożywce, która zostanie użyta podczas eksperymentu i dodać rosnące stężenia G418 (0-1,000 μg na ml). Codziennie monitoruj komórki, aby określić minimalne stężenie G418, które skutecznie zabija komórki. Śmierć komórki obserwuje się w ciągu 3-7 dni.
2. Przed generacją linii komórkowych zaleca się sprawdzenie za pomocą testów transfekcji przejściowe....

Discussion

Obniżenie ekspresji określonych genów jest ważnym podejściem do badania udziału białka w szlakach regulacyjnych. Ponieważ konstytutywny knockdown ekspresji niezbędnych genów negatywnie wpływa na proliferację komórek, ich badanie może wymagać albo przejściowego wprowadzenia siRNA, albo zastosowania stabilnych systemów warunkowego knockdownu. Generowanie stabilnych linii komórkowych ze zdolnością do indukowanej lekami ekspresji shRNA daje przewagę nad przejściowymi transfekcjami, które mogą nie być skuteczne w wielu liniac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM o wysokim poziomie glukozy	Gibco	41965
Zatwierdzony system Tet FBS	Clontech	631106
L-glutamina	Gibco	25030
Pen Strep	Gibco	15140
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200
T-REx-293 komórki	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticydyna	Invitrogen	R210-01
pSuperior.neo+GFP plazmid	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
transfekcja	jetPIE	101-40
doksycyklina	Sigma	D9891
paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Nauki	15710
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01