Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4443

⸱

22 grudnia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym materiale opisujemy molekularny odczyt długotrwałej adaptacji węchowej u Caenorhabditis elegans. Kinaza białkowa G, EGL-4, jest niezbędna do stabilnych odpowiedzi adaptacyjnych w parze pierwotnych neuronów sensorycznych zwanych AWC. Podczas długotrwałej ekspozycji na zapach EGL-4 przemieszcza się z cytozolu do jądra komórkowego neuronu AWC.

Streszczenie

Podczas długotrwałej stymulacji większość neuronów sensorycznych adaptuje swoją odpowiedź poprzez zmniejszenie wrażliwości na sygnał. Odpowiedź adaptacyjna pomaga kształtować uwagę i chroni komórki przed nadmierną stymulacją. Adaptację w obwodzie węchowym C. elegans po raz pierwszy opisali Colbert i Bargmann1,2. Autorzy zdefiniowali w niej parametry paradygmatu adaptacji węchowej, które wykorzystali do zaprojektowania przesiewu genetycznego w celu wyizolowania mutantów z defektem zdolności adaptacji do lotnych zapachów wykrywanych przez neurony sensoryczne typu C komórek skrzydłowych amfid (AWC). Gdy zwierzęta C. elegans typu dzikiego są eksponowane na atrakcyjny zapach wykrywany przez AWC3 przez 30 min, adaptują one swoją reaktywność na ten zapach i następnie ignorują go w teście behawioralnym chemotaksji przez ok. 1 hr. Gdy zwierzęta C. elegans typu dzikiego są eksponowane na atrakcyjny zapach wykrywany przez AWC przez ok. 1 hr, ignorują go następnie w teście behawioralnym chemotaksji przez ok. 3 hr. Te dwie fazy adaptacji węchowej u C. elegans opisano jako krótko- i długoterminową adaptację węchową (indukowaną odpowiednio po 30 min i 60 min ekspozycji na zapach). Późniejsze prace L'Etoile et al.,4 ujawniły kinazę białkową G (PKG) zwaną EGL-4, która jest niezbędna do krótko- i długoterminowej adaptacji węchowej w neuronach AWC. Białko EGL-4 zawiera sekwencję lokalizacji jądrowej, która jest konieczna do długoterminowych odpowiedzi adaptacji węchowej, ale zbędna do krótkoterminowych odpowiedzi adaptacyjnych w AWC4. Dzięki oznaczeniu EGL-4 zielonym białkiem fluorescencyjnym możliwe stało się zwizualizowanie lokalizacji EGL-4 w AWC podczas przedłużonej ekspozycji na zapach. Wykorzystując tę w pełni funkcjonalną cząsteczkę EGL-4 oznaczoną GFP (GFP::EGL-4), opracowaliśmy molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej w AWC5. Używając tego molekularnego odczytu adaptacji węchowej, przeprowadziliśmy zarówno forward, jak i reverse genetic screens w celu zidentyfikowania zwierząt mutantów wykazujących defekty wzorców lokalizacji subkomórkowej GFP::EGL-4 w AWC6,7. Opisujemy tutaj: 1) konstrukcję zwierząt ekspresujących GFP::EGL-4; 2) protokół hodowli zwierząt do testów długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem; oraz 3) ocenę zdarzenia długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem oraz powrotu (ponownej sensytyzacji) ze stanu jądrowego GFP::EGL-4.

Protokół

1. Konstrukcja zwierząt wykazujących ekspresję EGL-4 z oznakowaniem GFP

  1. Sklonować fuzję translacyjną GFP::EGL-4 pod promotorem genu odr-3 (użyć 2678 bp bezpośrednio powyżej kodonu start): (p)odr-3::GFP::EGL-4. Promotor odr-3 steruje ekspresją w parach neuronów amfidialnych: AWA, AWB, AWC oraz słabo w ASH.
  2. Wstrzyknąć plazmid (p)odr-3::GFP::EGL-4 w stężeniu 50 ng/μl do zwierząt typu dzikiego (N2) wraz z markerami ko-iniekcji, stosując standardowe techniki transformacji linii zarodkowej8: (p)ofm-1::GFP9 (25 ng/μl) oraz (p)odr-1::dsRed10 (25 ng/μl). Promotor odr-1 steruje ekspresją w parach neuronów amfidialnych AWC i AWB, a promotor ofm-1 steruje ekspresją w koelomocytach.
  3. Zwierzęta transgeniczne wykazujące macierze ekstrachromosomalne opisane w kroku 1.2 poddać protokołowi integracji z użyciem promieniowania ultrafioletowego (UV) i trimetylpsoralenu (TMP)11.
  4. Zsynchronizować zwierzęta metodą wybielania (bleaching)12 i hodować je na płytkach z pożywką NGM zawierającą E. coli OP50 do stadium L4. Zmyć zwierzęta L4 z płytek NGM buforem M9, aby usunąć bakterie E. coli OP50.
  5. Usunąć bufor M9 i dodać 50-100 μl roztworu roboczego TMP o stężeniu 30 μg/ml do osadu z nicieni w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1.5 ml. Owinąć probówkę folią aluminiową w celu odcięcia światła zewnętrznego i delikatnie mieszać na rotatorze przez 15 min w owiniętej folią probówce. Przenieść nicienie w roztworze TMP do dużej, niezasianej płytki NGM.
  6. Naświetlić nicienie na płytce NGM promieniowaniem UV dawką 350 μJ(X100) przy użyciu urządzenia Stratalinker 2400. Następnie przenieść nicienie na płytkę NGM z OP50 i inkubować w ciemności przez 5 hr.
  7. Przenieść 50 nicieni transgenicznych na około 10 zasianych płytek (po 2-5 nicieni na płytkę). Przenosić osobniki P0 na nowe płytki co 24 hr przez 3 dni.
  8. Wybrać 250 klonalnych zwierząt F1 (1 zwierzę na płytkę). Wyizolować 2-4 zwierzęta F2 z każdej płytki F1. Sprawdzić zwierzęta F3 w celu znalezienia linii o 100% transmisji, analizując wzór ekspresji (p)ofm-1::GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
  9. Przeprowadzić krzyżowanie zwrotne (outcross) końcowych linii zintegrowanych ze zwierzętami typu dzikiego N2 pięciokrotnie. Końcową linię zintegrowaną będziemy określać jako pyIs500, a cząsteczkę EGL-4 z tagiem GFP jako GFP::EGL-4.

2. Hodowla i utrzymanie zwierząt do testów translokacji jądrowej

  1. Hodować zwierzęta pyIs500 w temperaturze 25 °C na standardowych płytkach NGM o średnicy 10 cm (przepis poniżej) z wysianymi bakteriami OP50 E. coli13 (Rycina 1).
  2. W dniu 1. przenieść od czterech do pięciu zwierząt pyIs500 w stadium L4 z płytek hodowanych w 25 °C na pięć oddzielnych płytek o średnicy 10 cm z wysianymi bakteriami OP50 E. coli i inkubować w 25 °C (tj. 4-5 zwierząt L4 na płytkę).
  3. W dniu 4. spłukać dorosłe populacje zwierząt pyIs500 z dużych płytek NGM, używając buforu S-Basal (przepis poniżej). Do przenoszenia zwierząt używać jednorazowych pipet szklanych, ponieważ zwierzęta przywierają do ścianek plastikowych końcówek pipet.

3. Testy długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem

  1. Przemyj zwierzęta pyIs500 3 razy w buforze S-Basal, aby usunąć bakterie. Nie wiruj zwierząt pomiędzy płukaniami; zamiast tego pozwól im osadzić się grawitacyjnie w stacjonarnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml. Kluczowe jest upewnienie się, że wszystkie bakterie zostały usunięte, a szalki NGM są wolne od zanieczyszczeń, ponieważ resztkowe bakterie negatywnie wpłyną na wynik testu translokacji. Stwierdzono również, że autoklawowanie probówek 1.5 ml nadaje ich ściankom wewnętrznym „lepkie” właściwości, co powoduje przyleganie zwierząt do boków, dlatego należy stosować nieautoklawowane probówki 1.5 ml.
  2. Podczas osadzania się zwierząt pomiędzy płukaniami, przygotuj roztwór adaptacyjny. Do cylindra miarowego o pojemności 100 ml wlej 100 ml buforu S-Basal. Dodaj substancję zapachową do S-Basal i zabezpiecz cylinder paskiem Parafilmu. W przypadku adaptacji do benzaldehydu dodaj 7.5 μl benzaldehydu do 100 ml S-Basal, a w przypadku adaptacji do butononu dodaj 11 μl 2-butanonu do 100 ml S-Basal. Delikatnie odwróć (nie wstrząsaj) cylinder miarowy zawierający S-Basal i substancję zapachową 30 razy, aby utworzyć jednorodną emulsję.
  3. Po ostatnim płukaniu w S-Basal pozwól zwierzętom osiąść i usuń cały płyn. Oznacz jedną probówkę jako „+ve” lub „adapt”, a drugą jako „-ve” lub „unadapt”. Następnie dodaj 1 ml mieszaniny adaptacyjnej do probówki do adaptacji (+ve) oraz 1 ml S-Basal do probówki kontrolnej nieadaptowanej (-ve). Staraj się utrzymać liczbę zwierząt w każdej probówce w przedziale od 100 do 200. Przy odrobinie wprawy możliwe jest oszacowanie przybliżonej liczby zwierząt w osadzie na oko.
  4. Załóż zabezpieczacz zakrętki do każdej probówki 1.5 ml (zapobiega to przypadkowemu otwarciu się wieczek) i umieść probówki na rotatorze na 80 min. Stwierdzono, że ekspozycja na zapach trwająca od 60 min do 80 min daje podobne wyniki (oba warianty prowadzą do długoterminowych odpowiedzi adaptacyjnych). Jednakże 80 min ekspozycji zapewnia w naszej praktyce bardziej spójne wyniki. W związku z tym wszystkie nasze testy długoterminowej adaptacji są standaryzowane poprzez stosowanie 80 min ekspozycji na zapach (Rycina 2).
  5. Po 80 min przemyj zwierzęta 3 razy w S-Basal. Pozwól zwierzętom osiąść grawitacyjnie pomiędzy każdym płukaniem.

4. Krótkookresowe analizy translokacji jądrowej indukowanej zapachami

  1. W przypadku krótkotrwałej adaptacji do zapachu należy zastosować ten sam protokół, co w testach długotrwałej translokacji indukowanej zapachem (kroki 3.1-3.4), jednak zamiast inkubować zwierzęta pyIs500 w adaptującym zapachu przez 80 min, należy zastosować 30 min ekspozycji. Ilościowe określenie wyników testów translokacji jądrowej indukowanej zapachem opisane poniżej (krok 5) jest takie samo dla ekspozycji długotrwałej i krótkotrwałej.

5. Ocena zdarzenia translokacji jądrowej indukowanej zapachem

  1. Przygotować 2% podkładki agarozowe zawierające 5 mM azotku sodu (NaN3), rozpuszczając agarozę do elektroforezy w dH20. Nanieść jedną kroplę stopionej agarozy z NaN3 na szklane szkiełko przedmiotowe. Natychmiast położyć drugie szkiełko przedmiotowe na pierwszym, aby spłaszczyć kroplę stopionej agarozy. Pozostawić na 30 s, a następnie delikatnie rozdzielić szkiełka, pozostawiając na jednym z nich płaską podkładkę agarozową o grubości ~1 mm.
  2. Po ostatnim przemyciu w S-Basal pozwolić nicieniom osiąść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i usunąć cały płyn. Następnie nanosić zwierzęta kroplami na podkładki agarozowe na kilku szkiełkach przedmiotowych. Ważne jest, aby liczba zwierząt na szkiełku wynosiła od 50 do 100. Zbyt duża liczba zwierząt na szkiełku utrudni ocenę i często spowoduje rozproszoną poświatę po wzbudzeniu światłem niebieskim. Nadmiar płynu można usunąć z podkładki agarozowej za pomocą małej chusteczki Kim-wipe. Na podkładkę położyć szkiełko nakrywkowe o grubości 0,5 mm i pozostawić na 2 min, aby NaN3 unieruchomił zwierzęta. Należy pamiętać, że zwierzęta można odzyskać ze szkiełek po ocenie. Zwierzęta wybudzą się z narkozy wywołanej przez NaN3 po ~1 h, jeśli zostaną przeniesione do kropli buforu M9 na zasiałą płytkę NGM.
  3. Na tym etapie niezbędne jest, aby każdy eksperymentator opracował klucz pozwalający zidentyfikować, które szkiełko jest szkiełkiem eksperymentalnym (+ve), a które kontrolnym (-ve), a następnie przekazał szkiełka innej osobie, która dokona ślepej oceny wzoru lokalizacji GFP:EGL-4. Pozwoli to wyeliminować błąd eksperymentatora.
  4. Ocenić od 50 do 100 zwierząt na szkiełku, korzystając z pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywami o powiększeniu 10X, 40X i 63X oraz filtrami GFP/RFP. Po pierwsze, zlokalizować zwierzęta przy powiększeniu 10X, korzystając z oświetlenia w polu jasnym. Po drugie, zlokalizować neuron AWC, wyłączając oświetlenie w polu jasnym i używając filtra RFP. (p)odr-1::dsRed indukuje ekspresję w neuronach AWB i AWC. Neurony AWC mają charakterystyczne owalne ciała komórkowe w porównaniu z ciałami komórkowymi AWB, które są mniejsze i mają kształt kolisty (Rycina 2).
  5. Po zlokalizowaniu ciała komórkowego AWC przełączyć na filtr GFP i zapisać lokalizację GFP:EGL-4 jako jądrową lub cytoplazmatyczną. Użycie licznika pozwala eksperymentatorowi na stałe patrzenie w okular podczas oceny szkiełka. Uwaga: kroki 5.1-5.5 powtarza się co najmniej 3 razy w różne dni, aby uzyskać statystycznie istotne dane (Ryciny 1-2).

6. Monitorowanie EGL-4 znakowanego GFP podczas powrotu do stanu wyjściowego po długotrwałej adaptacji do zapachu

  1. Po kroku 3.5 podziel populacje zwierząt pyIs500 na kilka alikwotów i oceń lokalizację GFP::EGL-4 w neuronach AWC (jądrową w stosunku do cytoplazmatycznej) w punkcie czasowym zero (tj. po 80 min ekspozycji) oraz w kilku kolejnych punktach czasowych (Rycina 3).
  2. Przenieś zwierzęta kontrolne (-ve) i doświadczalne (+ve) za pomocą jednorazowych pipet szklanych na płytki NGM.
  3. Pozostaw zwierzęta do regeneracji przez różne okresy czasu i ponownie zbadaj lokalizację GFP::EGL-4 w neuronach AWC w każdym punkcie czasowym, zgodnie z krokami od 5.1 do 5.5.

7. Materiały

Płytki NGM: Do 1 L ddH20 dodać: 21 g Bacto-Agar; 3 g chlorku sodu (NaCl); 2,5 g Bacto-Peptone. Pożywkę wysterylizować w autoklawie. Po autoklawowaniu chłodzić agar do temperatury 54 °C. Dodać następujące roztwory: 25 ml 1M buforu fosforanowego potasu; 1 ml 1 M siarczanu magnezu (MgSO4); 1 ml 1 M chlorku wapnia (CaCl2); 1 ml cholesterolu w etanolu (stok 5 mg/ml).

1 M fosforan potasu dwuzasadowy K2HPO4 174,2 g/mol: Dla 500 ml: w 400 ml ddH2O rozpuścić 87,1 g fosforanu potasu dwuzasadowego K2HPO4. Uzupełnić objętość do 500 ml za pomocą ddH2O. Sterylizować poprzez filtrację, używając sterylnej jednostki filtrującej 500 ml.

1 M fosforan potasu jednopodstawny KH2PO4 136,1 g/mol: Aby przygotować 1 L: w 800 ml ddH2O rozpuścić 136,1 g fosforanu potasu jednopodstawnego KH2PO4. Uzupełnić objętość do 1 L za pomocą ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie, używając sterylnej jednostki filtrującej o pojemności 500 ml.

Bufor fosforanowy potasu (K3PO4) 1 M o pH 6,0: Na 1 L: Do sterylnej jednostki filtrującej o pojemności 1 L dodać 868 ml 1 M KH2PO4 jednobazowego. Odczekać do przefiltrowania roztworu, a następnie dodać 132 ml 1 M K2HPO4 dwubazowego. Odczekać do przefiltrowania całego płynu. Wyjąć jednostkę filtrującą i dostosować pH do wartości 6,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

S-Basal: Na 1 L: dodać 50 ml 1M buforu K3PO4, pH ~6.0 oraz 20 ml 5M NaClaq. Uzupełnić do 1 L wodą ddH2O. Roztwór wysterylizować w autoklawie.

M9: Na 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O. Uzupełnić ddH20 do objętości 1 L. Sterylizować w autoklawie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład wzorca lokalizacji GFP::EGL-4 w neuronie AWC przed i po długotrwałej ekspozycji na zapach przedstawiono na Rysunku 2. Przed długotrwałą ekspozycją na zapach GFP::EGL-4 znajduje się w cytozolu AWC (Rysunek 2B), a po 80 min ekspozycji na zapach GFP::EGL-4 lokalizuje się w jądrze AWC (Rysunek 2D). Na poziomie behawioralnym zwierzęta z cytoplazmatyczną lokalizacją GFP::EGL-4 w AWC są przyciągane przez punktowe źródło zapachu (Rysunek 2C przedstawia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj indukowany zapachem transport jądrowy cząsteczki EGL-4 znakowanej GFP stanowi wiarygodny odczyt molekularny adaptacji węchowej u C. elegans. Testy translokacji jądrowej indukowanej zapachem są proste i wymagają jedynie kilku dni czasu przygotowawczego. Linia pyIs500, którą skonstruowaliśmy do tych testów, wykazuje ekspresję markera oświetlającego neuron AWC, a także ekspresję białka EGL-4 znakowanego GFP. W związku z tym uważamy, że badacz z niewielkim lub żadnym doświadczeniem w pracy z t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Scottowi Hamiltonowi oraz członkom laboratorium O'Hallorana za uważne przeczytanie niniejszego manuskryptu. Dziękujemy również anonimowemu recenzentowi za doskonałe sugestie i wnikliwe uwagi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacto AgarDifcoDF0140-07-4płytki NGM
Chlorek soduFisher ChemicalS671-10płytki NGM
Bacto PeptoneDifcoDF0118-07-2płytki NGM
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ChemicalS375-500bufor S-Basal i płytki NGM
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ChemicalP285-500bufor S-Basal i płytki NGM
Kimwipes - małeKimberly-ClarkLS2770
Etanol 100%Gold Shield Chemical Co.43196-115rozcieńczanie substancji zapachowych do testów chemotaksji
Chlorek wapniaSigma-AldrichC8106-500Gpłytki NGM
Siarczan magnezuMP Biomedicals150136-500Gpłytki NGM
Azydek sodu 99%Fisher ScientificICN10289180środek znieczulający
Agaroza - UltraPureInvitrogen16500-500podkładki agarozowe
BenzaldehydSigma-AldrichB1334-100Gsubstancja zapachowa AWC
Butanon, stopień ACSSigma-Aldrich360473-500MLsubstancja zapachowa AWC
Probówki do mikrocentryfugi - 1.5 ml koloroweDenvilleLS8147
Jednorazowa szklana pipeta Pasteura 5-3/4"Fisher Scientific13-678-20B
StratalinkerStratageneStratalinker 2400integracja UV
Butelka filtracyjna próżniowa - 500 mlNalgene09-740-25B

Bibliografia

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515(1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016(2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314(1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575(2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451(1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835(2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony AWCznakowanie GFPkinaza bia kowa Gtranslokacja j drowatest chemotaksjiadaptacja d ugoterminowaprzesiew genetycznyplastyczno neuron w sensorycznych
Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.