Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Streszczenie

Właściwa interakcja między neuronami a glejem jest kluczowa dla funkcji fizjologicznych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ta dwukierunkowa komunikacja jest w złożony sposób mediowana przez specyficzne szlaki sygnalizacyjne między neuronami a glejem^1,2. Identyfikacja i charakterystyka tych szlaków sygnalizacyjnych są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób interakcja neuron-glej kształtuje fizjologię OUN. Wcześniej do testowania i charakterystyki szlaków sygnalizacyjnych między neuronami a glejem powszechnie wykorzystywano mieszane hodowle neuronów i gleju. To, czego dowiedzieliśmy się z tych preparatów oraz innych narzędzi in vivo, sugeruje jednak, że wzajemna sygnalizacja między neuronami a glejem często zachodzi w konkretnych przedziałach neuronów (i.e., aksonie, dendrycie lub somie)³. Dlatego ważne jest opracowanie nowego systemu hodowli, który pozwala na oddzielenie przedziałów neuronalnych i umożliwia specyficzne badanie interakcji między glejem a aksonami/dendrytami neuronalnymi. Ponadto konwencjonalny system hodowli mieszanych nie pozwala na rozróżnienie czynników rozpuszczalnych od sygnałów bezpośredniego kontaktu błonowego między neuronem a glejem. Co więcej, duża liczba neuronów i komórek glejowych w konwencjonalnym systemie kokultury nie zapewnia rozdzielczości niezbędnej do obserwacji interakcji między pojedynczym aksonem a komórką glejową.

W niniejszym badaniu opisujemy nowatorski system kokultury aksonów i gleju z wykorzystaniem mikrofluidycznej platformy hodowlanej (MCP). W tym systemie kokultury neurony i komórki glejowe są hodowane w dwóch oddzielnych komorach połączonych za pomocą wielu kanałów centralnych. W tej mikrofluidycznej platformie hodowlanej tylko wypustki neuronalne (w szczególności aksony) mogą przedostać się na stronę glejową poprzez kanały centralne. W połączeniu z wydajnym znakowaniem białkami fluorescencyjnymi system ten umożliwia bezpośrednie badanie szlaków sygnalizacyjnych w interakcjach aksonalno-dendrytycznych i glejowych, takich jak regulacja transkrypcyjna w gleju pośredniczona przez aksony, transport receptorów w zakończeniach neuronalnych pośredniczony przez glej oraz wzrost aksonów pośredniczony przez glej. Wąska średnica komory znacząco ogranicza również przepływ medium wzbogaconego w neurony do komory glejowej, co ułatwia badanie bezpośrednich oddziaływań białek błonowych między aksonami/dendrytami a powierzchniami glejowymi.

Protokół

1. Montaż mikrofluidycznej komory hodowlanej (MCP)

1. MCP (Rysunek 1) to otwarte komory zaprojektowane do przedzielonych kultur różnych typów komórek ⁴. Zazwyczaj posiadają one dwie komory połączone kanałami centralnymi (o średnicy 3 μm). Do przygotowania kultur i późniejszej analizy obrazowej niezbędny jest montaż MCP z szalkami z dna szklanego.
2. Najpierw sterylne szalki z dna szklanego powleka się poliornityną (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml) rozpuszczoną w tetraboranie sodu (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8.5), a następnie inkubuje przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Następnego dnia powleczone szalki z dna szklanego przemywa się trzykrotnie wodą ddH₂O i suszy pod sterylną dygestorem. Następnie szalki z dna szklanego powleka się lamininą (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml) i suszy pod światłem UV przez 1 godzinę. Powleczone szalki są gotowe do użycia lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania. Powłoki te są niezbędne do wysiewania neuronów i astrocytów w ko-kulturze.
4. Aby zmontować platformę hodowlaną, mikrofluidyczne platformy hodowlane umieszcza się na wierzchu powleczonych szalek z dna szklanego, tak aby centralne kanały łączące znajdujące się po ich dolnej stronie tworzyły szczelne połączenie. Do zmontowanego MCP dodaje się standardowe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów (przez obszary wysiewu komórek) po obu stronach (Rysunek 1) i inkubuje przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że nie ma wycieków między MCP a szalką z dna szklanego. Przed wysianiem komórek przeprowadziliśmy test z pożywką, aby wykluczyć nieszczelności. Zmontowany na szalce z dna szklanego układ MCP powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.

2. Przygotowanie hodowli neuronalnej i indukcja aksonów neuronalnych w zmontowanym MCP

1. Kultury neuronalne kory mózgu przygotowano na świeżo z mózgów embrionalnych myszy w wieku 14-16 dni. Pożywka do hodowli neuronów składa się z pożywki Neurobasal, 2% suplementu Neurobasal B27, 2 mM glutaminy (poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Po wypreparowaniu mózgu myszy, pod mikroskopem stereoskopowym usunięto oponi mózgowe z kory. Następnie tkankę posiekano żyletką na małe fragmenty, aby zwiększyć powierzchnię wystawioną na działanie trypsyny. Fragmenty tkanki poddano trypsynizacji (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsyny) przez 10 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie delikatnie rozdzielono poprzez tryturację za pomocą wypalanej pipety Pasteura. Rozdzielone komórki przefiltrowano przez sito 70 μm w celu uzyskania klarownej zawiesiny komórek neuronalnych.
2. Neurony (2-3 x 10⁶/ml, 150 μl) wysiano na obszary wysiewu komórek po prawej stronie (Rysunek 1) złożonej platformy MCP, tak aby neurony mogły przytwierdzić się w obszarze retencji komórek (Rysunek 1). Świeżo przygotowane neurony wysiano w pożywce do wysiewu neuronów, która jest regularną pożywką do hodowli neuronów uzupełnioną o 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone). Ponieważ tylko neurony przytwierdzone w obszarze retencji komórek są w stanie rozwinąć aksony na drugą stronę złożonej platformy MCP poprzez kanały centralne, ważne jest wysianie neuronów o wysokiej gęstości w obszarze wysiewu, aby zapewnić przytwierdzenie odpowiedniej liczby neuronów do obszaru retencji komórek. Reprezentatywny obraz wysokiej gęstości aksonów neuronalnych przedstawiono na Rysunku 2A.
3. Następnego dnia pożywkę do wysiewu neuronów zastąpiono regularną pożywką do hodowli neuronów. Wymianę pożywki przeprowadzono poprzez ostrożne odessanie pożywki z obszaru wysiewu komórek w komorze, z pominięciem obszaru retencji komórek złożonej platformy MCP, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w obszarze retencji oraz w centralnych kanałach łączących. Pęcherzyki powietrza mogą silnie hamować wzrost aksonów i ich późniejsze wnikanie do kanałów centralnych w MCP. Tego samego dnia po drugiej (lewej) stronie komory dodano również czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF, 10-20 ng/ml), aby ułatwić indukcję wzrostu aksonów⁵ ze strony neuronalnej i ich przejście przez kanały centralne złożonej platformy MCP (Rysunek 2A). Obserwuje się również znaczną ilość spontanicznego wzrostu neurytów bez dodatku GDNF ze strony neuronalnej i ich przejście przez kanały centralne złożonej platformy MCP. Aksony wnikające do kanału centralnego obserwuje się często 2-3 dni po wysianiu. Po wniknięciu do kanału centralnego, aksony zazwyczaj docierają na drugą stronę w ciągu jednego dnia. Aksony pozostają zazwyczaj nienaruszone przez co najmniej tydzień po dotarciu na drugą stronę.

3. Dodanie hodowanych astrocytów do MCP w celu ustanowienia przedzielonego systemu kokultury

Pierwotne kultury astrocytów przygotowano z mózgu myszy w wieku P1-3. Procedura dysocjacji mózgu jest podobna do opisanej powyżej procedury izolacji komórek neuronalnych. Astrocyty wysiano początkowo do szalek 10 cm, które uprzednio pokryto poliornityną (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml). Pożywkę do hodowli astrocytów (DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny) zmieniano codziennie przez kolejne dwa dni w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie pożywkę zmieniano co trzy dni.

1. Astrocyty osiągają 90% konfluencji i tworzą monowarstwę po 7 dniach. Konfluentne astrocyty poddano trypsynizacji, a następnie 150 μl resuspenderowanych astrocytów (1x10⁶ /ml) wysiano ponownie do obszaru wysiewu komórek po lewej stronie zmontowanego MCP, w momencie gdy aksony miały wejść lub właśnie weszły do lewej strony zmontowanego MCP. Astrocyty wysiewano zazwyczaj 4-5 dni po wysianiu neuronów. Przed ponownym wysianiem astrocytów do lewej strony MCP usunięto GDNF. Ponownie wysiane astrocyty przytwierdziły się w obszarze retencji komórek, co wykazano za pomocą immunobarwienia GFAP (Rycina 1). W MCP stwierdzono jedynie minimalny przepływ medium między obiema stronami komór (wyznaczony za pomocą barwników fluorescencyjnych), co wykazano wcześniej^4,6.
2. Astrocyty osiągają 90% konfluencji i tworzą monowarstwę po 7 dniach. Konfluentne astrocyty poddano trypsynizacji, a następnie 150 μl resuspenderowanych astrocytów (1 x 10⁶ / ml) wysiano ponownie do obszaru wysiewu komórek po lewej stronie zmontowanego MCP, w momencie gdy aksony miały wejść lub właśnie weszły do lewej strony zmontowanego MCP. Astrocyty wysiewano zazwyczaj 4-5 dni po wysianiu neuronów. Przed ponownym wysianiem astrocytów do lewej strony MCP usunięto GDNF. Ponownie wysiane astrocyty przytwierdziły się w obszarze retencji komórek, co wykazano za pomocą immunobarwienia GFAP (Rycina 1). W MCP stwierdzono jedynie minimalny przepływ medium między obiema stronami komór (wyznaczony za pomocą barwników fluorescencyjnych), co wykazano wcześniej^4,6.
3. Po ponownym wysianiu astrocytów aksony, które weszły do lewej strony zmontowanego MCP, wchodzą w bezpośrednią interakcję z astrocytami poprzez bezpośredni kontakt aksonalny lub uwalnianie czynników rozpuszczalnych. Aby zwizualizować interakcję między aksonami a astrocytami, przeprowadzono immunobarwienie astroglialnego transportera glutaminianu błony plazmatycznej GLT1 oraz neuronalnej βIII-tubuliny, jak pokazano na Rycini 2D-F.

Wyniki

Analiza obrazowania time-lapse aktywacji promotora GLT1 w astrocytach indukowanej przez aksony

Przegrodowy system kokultury neuronów i astrocytów umożliwia selektywną interakcję tylko wypustek neuronalnych, w szczególności aksonów, z astrocytami. Po pomyślnym ustanowieniu kokultury aksonów i astrocytów (lub innych komórek glejowych) w zmontowanym MCP można badać różne typy oddziaływań aksonowo-glejowych, takie jak: indukowana aksonowo aktywacja promotora genu astroglialnego, indukowane astrocytam...

Dyskusja

System kokultury neuronów i astrocytów oparty na MCP umożliwia szczegółową analizę szlaków sygnalizacyjnych między neuronami a astroglia, pozwalając na przejście przez kanały centralne wyłącznie aksonom i ich oddziaływanie z komórkami astroglialnymi. Ten system kokultury można łatwo przygotować, stosując konwencjonalne procedury hodowli neuronów i astrocytów. Opisaliśmy również praktyczne zastosowanie tego systemu kokultury poprzez użycie reportera opartego na eGFP do wykazania zależnej od aksonów aktywacji promotora GLT...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płodowa surowica bydlęca	Hyclone	SH30070.03	do wysiewania neuronów do pożywki do hodowli neuronów
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F4135	do pożywki do hodowli astrocytów
czynnik nerwowy pochodzenia glejowego	R&D Systems	212-GD	Nanieść 10-20 ng/ml na stronę komory z neuronami
pożywka Dulbecco modified Eagle medium z wysoką zawartością glukozy	Sigma-Aldrich	11995
sitko do komórek 70 mm	BD Falcon	352350
Sterylna szalka z szklanym dnem	MatTek Corporation
Mikrofluidyczne platformy hodowlane	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 studzienek płytki hodowlanej	Cellstar	657 160
Pożywka do hodowli neuronów pożywka Neurobasal 2% suplement B27 do pożywki Neurobasal 2 mM glutaminianu poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX 1% penicylina-streptomycyna
Pożywka do hodowli neuronów do wysiewu komórek <µl> pożywka Neurobasal 2% dodatek B27 do pożywki Neurobasal 2 mM glutaminianu poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX 1% penicylina-streptomycyna 5% płodowa surowica bydlęca SH30070.03
Pożywka do hodowli astrocytów podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco z wysoką zawartością glukozy 10% płodowa surowica bydlęca F4135 1% penicylina-streptomycyna
Tabela 1. Materiały wykorzystane w systemie kokultury aksonów neuronalnych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej.