Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odpowiedź nadwrażliwości opóźnionej (DTH) jest szybką manifestacją in vivo odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T na obcy antygen (Ag), z którym układ odpornościowy gospodarza zetknął się w niedawnej przeszłości. Reakcje DTH są często podzielone na fazę uczulania, odnoszącą się do pierwszego kontaktu z antygenem, oraz fazę wyzwalania, która zazwyczaj następuje kilka dni po uczuleniu. Brak odpowiedzi nadwrażliwości opóźnionej na antygen przypominający, wykazany w próbie skórnej, jest często uznawany za dowód anergii. Tradycyjny test DTH jest skutecznie wykorzystywany w diagnostyce wielu infekcji mikrobiologicznych.
Mimo wspólnych cech immunologicznych, takich jak naciek limfocytarny, obrzęk i nekroza tkanek, bezpośrednia próba DTH nie jest wykonalną techniką diagnostyczną u pacjentów po transplantacji ze względu na ryzyko, że bezpośredni wtrysk doprowadzi do uczulenia na antygeny dawcy i utraty przeszczepu. Aby uniknąć tego problemu, opracowano ludzko-mysią próbę DTH „trans-vivo” 1,2. Test ten jest w istocie próbą transferowej DTH, w której ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) oraz specyficzne antygeny wstrzykuje się podskórnie do małżowin usznych lub poduszek stóp naiwnej myszy, a po 18-24 h mierzy się obrzęk typu DTH 3. Prezentacja antygenu przez ludzkie komórki prezentujące antygen, takie jak makrofagi lub komórki DC, limfocytom T w silnie unaczynionej tkance myszy uruchamia kaskadę zapalną i przyciąga mysie komórki odpornościowe, co skutkuje wystąpieniem reakcji obrzękowej. Odpowiedź ta jest swoista dla antygenu i wymaga wcześniejszego uczulenia na ten antygen. Dodatnia odpowiedź DTH reagująca z dawcą w próbie Tv-DTH wskazuje, że u pacjenta po transplantacji rozwinęła się prozapalna dyspozycja immunologiczna wobec alloantygenów przeszczepu.
Najważniejszą cechą tego testu jest możliwość wykrywania limfocytów T regulatorowych, które wywołują supresję typu bystander. Supresja bystander odpowiedzi DTH po ponownym podaniu antygenu dawcy w obecności antygenu jest charakterystyczna dla biorców przeszczepów z zaakceptowanymi allograftami 2,4-14. Monitorowanie biorców przeszczepów pod kątem alloreaktywności i regulacji za pomocą Tv-DTH może pozwolić na zidentyfikowanie grupy pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z redukcji immunosupresji bez zwiększonego ryzyka odrzucenia przeszczepu lub pogorszenia funkcji nerek.
Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu Tv-DTH w monitorowaniu autoimmunizacji15,16, a także w immunologii nowotworów 17.
Protokół
1. Przygotowanie limfocytów
- Pobrać krew do probówek z ACD (kwasem cytrynowo-dekstrozowym).
- Wyizolować PBMC ze świeżej ludzkiej krwi obwodowej, używając medium do separacji limfocytów (Lymphocyte Separation Medium) zgodnie ze standardowymi metodami.
- Przemyć PBMC trzy razy roztworem PBS, aby usunąć zanieczyszczające płytki krwi. Stwierdzono, że płytki krwi zakłócają przebieg testu DTH trans-vivo. Maksymalnie dopuszczalne zanieczyszczenie preparatu PBMC płytkami krwi wynosi ≤1x107/iniekcję.
- W przypadku zauważalnego zanieczyszczenia erytrocytami, po pierwszym przemyciu przeprowadzić lizę czerwonych krwinek za pomocą buforu lizującego ACK. Usunąć bufor ACK, przemywając próbkę 2 razy roztworem PBS.
2. Przygotowanie alloantygenu
- Wyizolować PBMC z krwi obwodowej dawcy zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej.
- Resuspendować PBMC dawcy w PBS do stężenia 120x106 komórek/ml (4x106 komórek / 30 μl).
- Dodać do mieszaniny 1 μM PMSF, aby zapobiec degradacji białek.
- Poddać zawiesinę komórkową sonikacji, stosując siedem 1-sekundowych impulsów za pomocą sonikatora z sondą 2 mm. (Uwaga: Materiał należy utrzymać w niskiej temperaturze i unikać nadmiernego powstawania pęcherzyków powietrza. W przypadku pienienia należy pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie na 2-3 min.)
- Zweryfikować za pomocą hemocytometru, czy rozbito >90% komórek.
- Odwirować mieszaninę z prędkością 14 000 rpm w temperaturze 4 °C przez 20 min w chłodzonej mikrowirówce.
- Przenieść nadsącz do nowej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml i oznaczyć stężenie białka.
3. Przygotowanie komórek do iniekcji
- Do każdej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml przenieś 7x106 PBMC na każdą dawkę iniekcyjną.
- Wiruj przez minutę z prędkością 6 000 rpm w mikrowirówce, a następnie usuń nadsącz.
- Resuspenduj komórki w PBS z dodatkiem antygenów lub bez nich. Dostosuj objętość iniekcyjną do 35 μl za pomocą PBS. W iniekcjach stosuje się następujący schemat:
Kontrola negatywna: PBMC + PBS
Kontrola pozytywna: PBMC + TT/DT (25 μg/iniekcję)
Eksperymentalna odpowiedź specyficzna dla antygenu: PBMC + testowy Ag (4-8 μg/iniekcję)
Eksperymentalna regulacja specyficzna dla antygenu: PBMC + testowy Ag + TT/DT
4. Etap przed pomiarem, wtryskiwanie i etap po pomiarze
- Zanurz mysz CB17 SCID w narkozie z użyciem izofluranu. Zmierz grubość poduszki stopy tylnej za pomocą suwmiarki sprężynowej. Umieść suwmiarkę w centrum poduszki stopy, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej poduszki chodnej stopy, aby zapewnić punkt odniesienia dla zachowania spójności miejsca pomiaru. Grubość poduszki stopy zapisuje się, gdy odczyt z miernika ulegnie stabilizacji.
- Powoli wstrzyknij zawiesiny komórkowe podskórnie w poduszki stóp myszy, używając strzykawek insulinowych o pojemności ½ cc z igłą 28G. Wykonaj wstrzyknięcie tak, aby igła była skierowana w stronę palców, a ścięcie igły było skierowane do góry. (Uwaga: upewnij się, że nie ma wycieku).
- W odstępie 18-24 h po wstrzyknięciu z narkozuj mysz izofluranem i powtórz pomiar obrzęku poduszki stopy.
- Odejmij grubość każdej poduszki stopy sprzed wstrzyknięcia od wartości po wstrzyknięciu, aby uzyskać wartość obrzęku poduszki stopy; dane wyraź w jednostkach 10-4 cala. Oblicz netto obrzęk specyficzny dla antygenu, odejmując obrzęk poduszki stopy kontrolnej (PBMC+PBS) od wartości obrzęku poduszki stopy uzyskanych z grup badanych (PBMC + alloantygen dawcy, TT/DT lub alloantygen dawcy + TT/DT). Aby test uznano za ważny, wymagana jest pozytywna odpowiedź kontrolna na antygen pamięci TT/DT wynosząca ≥ 25x10-4 cala powyżej odpowiedzi tła na PBS.
- Określ inhibicję odpowiedzi pamięci w obecności antygenów dawcy, porównując netto obrzęk każdego wstrzyknięcia za pomocą następującego wzoru:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
1. Ocena odpowiedzi biorców przeszczepów nerek na antygeny dawcy z wykorzystaniem testu Tv-DTH
Aby przetestować komórkową odporność reaktywną wobec dawcy u biorców przeszczepów nerek, wstrzyknięto PBMC od tych pacjentów z samymi antygenami dawcy lub z antygenem przypominającym w postaci toksyny tężcowej (TT). Jako kontrolę pozytywną komórki wstrzyknięto z samą TT. Zaobserwowaliśmy trzy główne wzorce nadwrażliwości opóźnionej u biorców przeszczepów (Rysunek 1). Wszyscy pacjenci si...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test trans-vivo DTH jest nowatorskim testem diagnostycznym o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w ocenie odpowiedzi komórkowych u pacjentów po transplantacji, z nowotworami oraz z chorobami autoimmunologicznymi. Jest on cenny, ponieważ jest przydatny nie tylko w monitorowaniu odpowiedzi efektorowych limfocytów T pamięci, ale może również wykrywać odpowiedzi regulacyjne limfocytów T. Niezawodna metoda wykrywania regulacji DTH u ludzi mogłaby pomóc w przewidzeniu bezpieczeństwa odstawienia immunosupresji u pacjentów będą...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy niniejszego manuskryptu nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować A.M. VanBuskirk za wkład w rozwój naszej wiedzy na temat regulowanej odpowiedzi DTH u biorców przeszczepów. Praca ta była wspierana przez granty NIH PO1AI084853 oraz R01AI066219-06, a także przez sponsorowane przez UE badanie One Study.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probetka ACD do pobierania krwi | BD | 02-684-26 | |
| Medium do separacji limfocytów | Cellgro | 25-072-CV | |
| Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco | Cellgro | 21-031-CM | Bez wapnia & magnez |
| bufor lizujący ACK | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT lub EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/wstrzyknięcie EBV 8 μg/iniekcję | |
| Inhibitor proteaz PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eozyna do zliczania komórek | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantygen | Zamiast bezkomórkowych lizatów komórek donora można zastosować oczyszczone antygeny HLA lub syntetyczne allopeptydy | ||
| sterylne probówki wirówkowe 50 ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| pipety 10 ml i pipetor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| probówki 2 ml z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock) | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl, 10 μpipety z jałowymi końcówkami | |||
| Komora countingowa (hemocytometr) | Fisher | 02-671-10 | |
| Wirówka pełnowymiarowa i mikrowirówka | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| strzykawki insulinowe 1/2 ml lub 1 ml | Becton Dickinson | 14-826-79 | igła 28 G |
| Sonikator Vibracell | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | sonda 2 mm | |
| Wskaźnik grubości zegarowy | Mitutoyo, Japonia | ||
| myszy SCID | Harlan | ||
| Izofluran | Piramal Healthcare | Anestezja inhalacyjna |
Bibliografia
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862(2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
