Artykuł metodologiczny

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

DOI:

10.3791/4454

⸱

2 maja 2013

 ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odpowiedź nadwrażliwości opóźnionej (DTH) jest szybką manifestacją in vivo odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T na obcy antygen (Ag), z którym układ odpornościowy gospodarza zetknął się w niedawnej przeszłości. Reakcje DTH są często podzielone na fazę uczulania, odnoszącą się do pierwszego kontaktu z antygenem, oraz fazę wyzwalania, która zazwyczaj następuje kilka dni po uczuleniu. Brak odpowiedzi nadwrażliwości opóźnionej na antygen przypominający, wykazany w próbie skórnej, jest często uznawany za dowód anergii. Tradycyjny test DTH jest skutecznie wykorzystywany w diagnostyce wielu infekcji mikrobiologicznych.

Mimo wspólnych cech immunologicznych, takich jak naciek limfocytarny, obrzęk i nekroza tkanek, bezpośrednia próba DTH nie jest wykonalną techniką diagnostyczną u pacjentów po transplantacji ze względu na ryzyko, że bezpośredni wtrysk doprowadzi do uczulenia na antygeny dawcy i utraty przeszczepu. Aby uniknąć tego problemu, opracowano ludzko-mysią próbę DTH „trans-vivo” 1,2. Test ten jest w istocie próbą transferowej DTH, w której ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) oraz specyficzne antygeny wstrzykuje się podskórnie do małżowin usznych lub poduszek stóp naiwnej myszy, a po 18-24 h mierzy się obrzęk typu DTH 3. Prezentacja antygenu przez ludzkie komórki prezentujące antygen, takie jak makrofagi lub komórki DC, limfocytom T w silnie unaczynionej tkance myszy uruchamia kaskadę zapalną i przyciąga mysie komórki odpornościowe, co skutkuje wystąpieniem reakcji obrzękowej. Odpowiedź ta jest swoista dla antygenu i wymaga wcześniejszego uczulenia na ten antygen. Dodatnia odpowiedź DTH reagująca z dawcą w próbie Tv-DTH wskazuje, że u pacjenta po transplantacji rozwinęła się prozapalna dyspozycja immunologiczna wobec alloantygenów przeszczepu.

Najważniejszą cechą tego testu jest możliwość wykrywania limfocytów T regulatorowych, które wywołują supresję typu bystander. Supresja bystander odpowiedzi DTH po ponownym podaniu antygenu dawcy w obecności antygenu jest charakterystyczna dla biorców przeszczepów z zaakceptowanymi allograftami 2,4-14. Monitorowanie biorców przeszczepów pod kątem alloreaktywności i regulacji za pomocą Tv-DTH może pozwolić na zidentyfikowanie grupy pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z redukcji immunosupresji bez zwiększonego ryzyka odrzucenia przeszczepu lub pogorszenia funkcji nerek.

Obiecującym obszarem jest zastosowanie testu Tv-DTH w monitorowaniu autoimmunizacji15,16, a także w immunologii nowotworów 17.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie limfocytów

  1. Pobrać krew do probówek z ACD (cytrynianem dekstrozą kwasową).
  2. Wyizolować PBMC z pobranej świeżej ludzkiej krwi obwodowej, wykorzystując medium do separacji limfocytów zgodnie ze standardowymi metodami.
  3. Przemyć PBMC trzy razy w PBS, aby usunąć zanieczyszczenia z płytek krwi. Stwierdzono, że płytki krwi zakłócają test DTH trans-vivo. Maksymalnie dopuszczalne zanieczyszczenie preparatu PBMC płytkami krwi wynosi ≤1x107/injection.
  4. W przypadku zauważalnego zanieczyszczenia erytrocytami, po pierwszym przemyciu przeprowadzić lizę czerwonych krwinek z użyciem buforu lizującego ACK. Usunąć bufor ACK, przemywając próbkę 2 razy w PBS.

2. Przygotowanie alloantygenu

  1. Wyizolować PBMC z krwi obwodowej dawcy, stosując procedurę przedstawioną powyżej.
  2. Resuspendować PBMC dawcy w PBS do uzyskania stężenia 120x106 komórek/ml (4x106 komórek / 30 μl).
  3. Dodać do mieszaniny 1 μM PMSF, aby zapobiec degradacji białek.
  4. Poddać zawiesinę komórkową sonikacji, stosując siedem 1-sekundowych impulsów za pomocą sonikatora z sondą 2 mm. (Uwaga: Materiał należy utrzymywać w niskiej temperaturze i unikać powstawania nadmiernej ilości pęcherzyków. W przypadku spienienia zawiesinę komórkową należy pozostawić na lodzie przez 2-3 min).
  5. Zweryfikować za pomocą hemocytometru, czy doszło do rozbicia >90% komórek.
  6. Odwirować mieszaninę z prędkością 14 000 obr./min w temperaturze 4 °C przez 20 min w wirówce z chłodzeniem.
  7. Przenieść nadsącz do nowej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml i oznaczyć stężenie białka.

3. Przygotowanie komórek do iniekcji

  1. Do każdej probówki typu safe-lock o pojemności 2,0 ml nanieś 7x106 PBMC na jedną dawkę wstrzyknięcia.
  2. Wiruj przez jedną minutę z prędkością 6 000 rpm w mikrowirówce, a następnie usuń nadsącz.
  3. Resuspenduj komórki w PBS z antygenami lub bez nich. Dostosuj objętość wstrzyknięcia do 35 μl za pomocą PBS. Do wstrzykiwań stosuje się następujący schemat:
    Kontrola negatywna: PBMC + PBS
    Kontrola pozytywna: PBMC + TT/DT (25 μg/wstrzyknięcie)
    Doświadczalna odpowiedź swoista względem antygenu: PBMC + testowy Ag (4-8 μg/wstrzyknięcie)
    Doświadczalna regulacja swoista względem antygenu: PBMC + testowy Ag + TT/DT

4. Przygotowanie do pomiaru, iniekcja i czynności po pomiarze

  1. Zanurzyć mysz CB17 SCID w narkozie z użyciem izofluranu. Zmierzyć grubość poduszki stopy tylnej za pomocą suwmiarki sprężynowej. Umieścić suwmiarkę w centrum poduszki, tak aby jedna krawędź dotykała ostatniej poduszki chodu, co zapewni punkt odniesienia dla zachowania spójności miejsca pomiaru. Grubość poduszki stopy zapisuje się po ustabilizowaniu się odczytu z urządzenia.
  2. Powoli wstrzyknąć zawiesiny komórkowe podskórnie do poduszek stóp myszy, używając strzykawek insulinowych o pojemności ½ cc z igłą 28 G. Wykonać wstrzyknięcie, kierując igłę w stronę palców, z fazą skierowaną do góry. (Uwaga: należy upewnić się, że nie występuje wyciek).
  3. Po 18-24 h od wstrzyknięcia znowu podać myszy narkozę izofluranem i powtórzyć pomiar obrzęku poduszki stopy.
  4. Odjąć grubość każdej poduszki stopy przed wstrzyknięciem od wartości po wstrzyknięciu, aby otrzymać wartość obrzęku poduszki stopy; dane wyrazić w jednostkach 10-4 cali. Obliczyć specyficzny dla antygenu obrzęk netto, odejmując obrzęk poduszki kontrolnej (PBMC+PBS) od wartości obrzęku uzyskanych w grupach badawczych (PBMC + alloantygen dawcy, TT/DT lub alloantygen dawcy + TT/DT). Aby test uznano za prawidłowy, wymagana jest dodatnia odpowiedź kontrolna na antygen przypominający TT/DT na poziomie ≥ 25x10-4 cali ponad odpowiedź tła dla PBS.
  5. Określić hamowanie odpowiedzi przypominających w obecności antygenów dawcy, porównując obrzęk netto każdego wstrzyknięcia za pomocą następującego wzoru:
    Wzór obliczania hamowania dla testu odpowiedzi antygenowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ocena biorców przeszczepów nerek pod kątem odpowiedzi swoistej dla antygenów dawcy przy użyciu testu Tv-DTH

Aby przetestować komórkową odporność reaktywną na dawcę u biorców przeszczepów nerek, wstrzykiwaliśmy PBMC od tych pacjentów wraz z samymi antygenami dawcy lub z antygenem przypominającym w postaci toksydy tężca (TT). Jako kontrolę pozytywną komórki wstrzykiwano z samą TT. Zaobserwowaliśmy trzy główne wzorce nadwrażliwości opóźnionej u biorców przeszczepów (Rysunek 1). W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test trans-vivo DTH jest nowatorskim testem diagnostycznym o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w ocenie odpowiedzi komórkowych u pacjentów po transplantacji, z nowotworami oraz z chorobami autoimmunologicznymi. Jest on cenny, ponieważ jest przydatny nie tylko w monitorowaniu odpowiedzi efektorowych limfocytów T pamięci, ale może również wykrywać odpowiedzi regulacyjne limfocytów T. Niezawodna metoda wykrywania regulacji DTH u ludzi mogłaby pomóc w przewidzeniu bezpieczeństwa odstawienia immunosupresji u pacjentów będą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy niniejszego manuskryptu nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować A.M. VanBuskirk za wkład w rozwój naszej wiedzy na temat regulowanej odpowiedzi DTH u biorców przeszczepów. Praca ta była wspierana przez granty NIH PO1AI084853 oraz R01AI066219-06, a także przez sponsorowane przez UE badanie One Study.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probetka ACD do pobierania krwiBD02-684-26
Medium do separacji limfocytówCellgro25-072-CV
Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym DulbeccoCellgro21-031-CMBez wapnia & magnez
bufor lizujący ACKBioWhittaker10-548E
TT/DT lub EBVSanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.TT/DT 25 μg/wstrzyknięcie EBV 8 μg/iniekcję
Inhibitor proteaz PMSFSigma-Aldrich78830
Eozyna do zliczania komórekSigma-AldrichE-6003
AlloantygenZamiast bezkomórkowych lizatów komórek donora można zastosować oczyszczone antygeny HLA lub syntetyczne allopeptydy
sterylne probówki wirówkowe 50 mlFisher Scientific06-443-18
pipety 10 ml i pipetorBD Falcon13-675-20
probówki 2 ml z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock)Costar3213
1000 μl, 100 μl, 10 μpipety z jałowymi końcówkami
Komora countingowa (hemocytometr)Fisher02-671-10
Wirówka pełnowymiarowa i mikrowirówkaBeckman Coulter/Eppendorf
strzykawki insulinowe 1/2 ml lub 1 mlBecton Dickinson14-826-79igła 28 G
Sonikator VibracellDivtech Equipment Co. Sonocs Materials Incsonda 2 mm
Wskaźnik grubości zegarowyMitutoyo, Japonia
myszy SCIDHarlan
IzofluranPiramal HealthcareAnestezja inhalacyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
  2. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
  3. Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
  4. Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
  5. Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
  6. Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862(2002).
  7. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
  8. Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
  9. Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
  10. Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
  11. Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
  12. Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
  13. Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
  14. Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
  15. Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
  16. Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
  17. Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test DTH trans vivomononuklearne kom rki krwi obwodowejpomiar obrz ku poduszki stopyodpowied swoista dla antygenulimfocyty T regulatoroweswoisto antygenowa dawcytest z antygenem przypominaj cymwstrzykni cie podsk rnesystem modelu mysiego

Powiązane artykuły