Eksplantaty blastomerów do testowania zaangażowania w los komórki podczas rozwoju embrionalnego

Podsumowanie

Na los pojedynczej komórki embrionalnej mogą wpływać odziedziczone molekuły i/lub sygnały z sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów zarodka Xenopus w stadium rozszczepienia, można zidentyfikować pojedyncze blastomery do hodowli w izolacji, aby ocenić udział odziedziczonych cząsteczek w interakcjach komórka-komórka.

Streszczenie

Mapy losu, zbudowane z linii śledzącej wszystkie komórki embrionu, pokazują, które tkanki pochodzą od każdej komórki embrionu. Chociaż mapy losu są bardzo przydatne do identyfikacji prekursorów narządu i do wyjaśnienia ścieżki rozwojowej, na której komórki potomne zasiedlają ten narząd w normalnym zarodku, nie ilustrują one pełnego potencjału rozwojowego komórki prekursorowej ani nie identyfikują mechanizmów, za pomocą których określa się jej los. Aby sprawdzić zaangażowanie w los komórki, porównuje się normalny repertuar potomków komórki w nienaruszonym embrionie (mapa losu) z tymi, które uległy ekspresji po eksperymentalnej manipulacji. Czy los komórki jest ustalony (zaangażowany) niezależnie od otaczającego go środowiska komórkowego, czy też wpływają na niego czynniki zewnętrzne dostarczane przez sąsiadów? Korzystając z kompleksowych map losów zarodka Xenopus, opisujemy, jak identyfikować, izolować i hodować pojedyncze prekursory etapu rozszczepienia, zwane blastomerami. Takie podejście pozwala ocenić, czy te wczesne komórki są skazane na los, który nabywają w swoim normalnym środowisku w nienaruszonym zarodku, wymagają interakcji z sąsiednimi komórkami, czy też mogą być pod wpływem wyrażania alternatywnych losów, jeśli są wystawione na inne rodzaje sygnałów.

Wprowadzenie

Zarodki Xenopus laevis były szeroko wykorzystywane do identyfikacji mechanizmów, dzięki którym komórki embrionalne nabywają swój specyficzny los, ponieważ ich jaja są wystarczająco duże, aby umożliwić metody mikrochirurgiczne. Dodatkowo rozwijają się zewnętrznie bez konieczności suplementacji odżywczej pożywki, ponieważ każda komórka zawiera bogaty wewnątrzkomórkowy zapas płytek krwi, które zapewniają wewnętrzny magazyn energii. Ważnym atutem w badaniu mechanizmów, za pomocą których determinowany jest los komórki, jest obszerny zestaw map losów blastomerów w fazie rozszczepienia (od 2 do 32 komórek) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6}. Mapy te zostały skonstruowane poprzez mikrowstrzyknięcie wykrywalnej cząsteczki do pojedynczego, możliwego do zidentyfikowania blastomeru i monitorowanie na późniejszym etapie rozwoju, które tkanki są zasiedlone przez znakowane potomstwo. Spójne mapy losów są możliwe, ponieważ osie kardynalne zarodków można wiarygodnie zidentyfikować w wielu zarodkach. Po pierwsze, we wszystkich zarodkach typu dzikiego półkula zwierzęca jest pigmentowana, podczas gdy półkula roślinna nie. Po drugie, wniknięcie plemnika podczas zapłodnienia powoduje skurcz pigmentacji półkuli zwierzęcej w kierunku przyszłej strony brzusznej; W przypadku wielu zarodków różnica w pigmentacji może być zatem wykorzystana do rozróżnienia między stroną grzbietową a brzuszną. Po trzecie, pierwsza bruzda rozszczepienia jest zbliżona do środkowej płaszczyzny strzałkowej u większości zarodków, a zatem może być wykorzystana do identyfikacji prawej i lewej strony zarodka. Mapy losów opierają się również na fakcie, że naturalnie zapłodnione jaja często rozszczepiają się w regularne wzory, które sprawiają, że każdy blastomer jest możliwy do zidentyfikowania w dużej populacji zarodków. Chociaż istnieje zmienność w obrębie jaj i pomiędzy nimi pod względem wzorów pigmentacji i rozszczepienia, zastosowanie opisanych tutaj procedur selekcji pozwala na identyfikację komórek o przepisanych losach z około 90% dokładnością.

Losy komórek mogą być determinowane podczas embriogenezy za pomocą kilku mechanizmów. Czynniki wewnętrzne, takie jak różnie dziedziczone cytoplazmatyczne mRNA lub białka, przyczyniają się do kilku aspektów wczesnego wzorcowania. Na przykład określone matczyne mRNA określają, które komórki przyczynią się do linii zarodkowej, staną się endodermą lub przyczynią się do osi grzbietowej ciała (omówione w ⁷). Czynniki zewnętrzne dostarczane lokalnie przez sąsiednie komórki lub bardziej oddalone od embrionalnego centrum sygnalizacyjnego są odpowiedzialne za indukowanie określonych typów tkanek i modelowanie prawie każdego układu narządów. Przykłady centrów sygnalizacyjnych obejmują organizatora / węzeł w gastruli, który indukuje ektodermę nerwową i tworzy mezodermę, oraz strefę aktywności polaryzacyjnej, która wyznacza oś przednio-tylną zawiązka kończyny. Chociaż mapy losu identyfikują prekursorów różnych narządów i ujawniają ścieżkę rozwojową, jaką przeszli ich potomkowie w normalnym zarodku, nie są w stanie odróżnić wewnętrznych i zewnętrznych wpływów na te komórki. Nie ujawniają również pełnego potencjału rozwojowego komórki, której potomkowie różnicują się w złożonym środowisku sygnalizacyjnym zarodka. Dwa podejścia eksperymentalne mogą sprawdzić, czy los komórki jest zdeterminowany przez czynniki wewnętrzne, czy też następnie wpływają na niego czynniki zewnętrzne: 1) przeszczepienie komórki do nowego miejsca w zarodku; lub 2) usunięcie komórki z zarodka, a następnie hodowla w przypadku braku sygnałów egzogennych.

Oba eksperymentalne podejścia były możliwe do zastosowania w Xenopus, ponieważ komórki są wystarczająco duże, aby można je było ręcznie rozdzielić. Na przykład w licznych badaniach usunięto pojedyncze komórki z zarodków (w celu zmiany interakcji komórka-komórka) lub przeszczepiono komórki do nowych miejsc w zarodkach gospodarza w celu zbadania zmian losu (przegląd w ^{7, 8, 9}). Ponadto możliwe jest drugie podejście polegające na eksplantacji niewielkiej liczby komórek z różnych regionów zarodka do hodowli w celu wyjaśnienia indukcyjnych interakcji tkankowych przy braku czynników egzogennych, ponieważ komórki zarodka Xenopus są wypełnione wewnątrzkomórkowym magazynem składników odżywczych, płytkami krwi. W związku z tym można je hodować przez kilka dni w określonym pożywce solnej bez suplementacji pożywki składnikami odżywczymi lub czynnikami wzrostu. Zastosowaliśmy to podejście, aby pokazać, że grzbietowe blastomery zwierzęce mają autonomiczną zdolność do wytwarzania nerwowych i grzbietowych tkanek mezodermalnych z powodu odziedziczonych po matce mRNA ^{10, 11}, a inni wykazali, że specyfikacja mezodermy blastomerów 32-komórkowych opiera się zarówno na informacji wewnętrznej, jak i zewnętrznej ¹². Zaletą hodowli komórek jako eksplantatów jest to, że pożywka może być również uzupełniona o zdefiniowane czynniki sygnałowe w celu określenia, który szlak komunikacyjny między komórkami może wpływać na los eksplantowanej komórki ^{12, 13, 14}. Ponadto można wstrzyknąć blastomer przed hodowlą z mRNA w celu nadekspresji genu lub z oligonukleotydami antysensownymi, aby zapobiec translacji endogennych mRNA. Te analizy przyrostu i utraty funkcji mogą określić, które cząsteczki są niezbędne do autonomicznie wyrażonego losu. Aby przeanalizować los eksplantatu, identyfikacja określonych typów komórek może być przeprowadzona za pomocą standardowej ekspresji genów (np. hybrydyzacja in situ, RT-PCR) i testów immunocytochemicznych. Protokół ten zapewnia prosty, ale skuteczny sposób na rozróżnienie między wewnętrznymi i zewnętrznymi mechanizmami, które regulują, w jaki sposób komórka embrionalna rozwija się w określone tkanki.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

1. Naostrz cztery kleszcze za pomocą folii ściernej z tlenku glinu. Zrób to pod mikroskopem preparacyjnym, aby monitorować rozmiar końcówki. Jedna para kleszczyków służy jako wsparcie w przypadku uszkodzenia końcówki podczas zabiegu. Autoklaw wszystkie cztery kleszcze i przechowuj w sterylnym pojemniku.
2. Przygotować po 500 ml pożywki hodowlanej 0,1X i 1,0X (zmodyfikowane pierścienie Marca [MMR] lub zmodyfikowana sól fizjologiczna Bartha [MBS]; przepisy w ¹⁵) i wysterylizować przez filtr. Rutynowo używamy MBS (1X = 88 mM NaCl; 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO₃). Przechowywać w temperaturze 14-18 °C przez wiele miesięcy.
3. Przygotować 2% roztwór agarozy w pożywce hodowlanej (2 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml 1X pożywka hodowlana w szklanej butelce z zakrętką). Autoklaw do rozpuszczenia agarozy. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy i podgrzewać w kuchence mikrofalowej w celu upłynnienia agarozy, gdy będzie ona potrzebna.
4. Gdy agaroza jest płynna, wlej około 0,5 ml na dno każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki hodowlanej. Zapobiegnie to przywieraniu eksplantatów do plastiku.
5. Gdy agaroza jest płynna, wlej około 2-3 ml na dno dwóch lub trzech szalek Petriego o średnicy 60 mm i delikatnie obracaj, aby upewnić się, że dno jest przykryte. Będą one służyć jako naczynia do rozwarstwiania, a agaroza zapobiega przywieraniu zarodków do plastiku po usunięciu ich błon.
6. Gdy agaroza ostygnie i stwardnieje, podpal końcówkę 6-calowej pipety Pasteura, aż stopi się w kulkę, i delikatnie dotknij nią powierzchni agarozy w każdym dołku płytki hodowlanej. Stworzy to płytkie zagłębienie, w którym zostanie umieszczony eksplantat.
7. Napełnij każdą studzienkę płytki hodowlanej 1X sterylną pożywką hodowlaną.
8. Gdy agaroza ostygnie i stwardnieje, napełnij naczynie rozwarstwiające rozcieńczoną pożywką hodowlaną (0,1 X MMR lub 0,1 X MBS), aby ułatwić separację blastomerów.

2. Selekcja zarodków

1. Uzyskaj zapłodnione jaja i usuń galaretki zgodnie ze standardowymi protokołami ¹⁵. Przenieść je do pożywki 0,5X na 100-milimetrowej szalce Petriego.
2. Gdy zarodki osiągną stadium 2-komórkowe, posortuj te, w których pierwsza bruzda rozszczepienia przecina lekko pigmentowany obszar na półkuli zwierzęcej (ryc. 1) do osobnego naczynia. Będą to dawcy eksplantatów. Pozostałe 2-komórkowe zarodki należy przechowywać w osobnym naczyniu obok zarodków dawcy przez cały czas trwania procedury, aby służyły jako kontrola rodzeństwa do etapowania eksplantatów.

3. Przygotowanie eksplantatów

1. Umieść 5-10 zarodków w naczyniu separacyjnym, ale pracuj tylko nad jednym zarodkiem na raz.
2. Umieść pierwszy zarodek tak, aby widoczna była przezroczysta błona witelinowa; jest ona oddzielona wolną przestrzenią (przestrzenią okołozarodkową) nad powierzchnią zwierzęcego bieguna zarodka. Używając zaostrzonych kleszczy w ręce subdominującej (lewa ręka, jeśli jest praworęczna), chwyć błonę witeliny powyżej przestrzeni okołoręcznej. Używając zaostrzonych kleszczyków w drugiej ręce, chwyć membranę blisko końcówki pierwszego kleszcza i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby odkleić membranę. Wykonaj początkowy chwyt w pewnej odległości od komórki, która ma być wycięta, tak aby komórka docelowa nie została uszkodzona podczas usuwania błony. Można powiedzieć, że błona została usunięta, ponieważ zarodek spłaszczy się.
3. Chwyć jedną sąsiednią komórkę kleszczami w ręce subdominującej i użyj tej komórki jako "uchwytu", aby komórka, która ma być wycięta, nie została bezpośrednio dotknięta. Trzymając kleszcze w drugiej ręce, delikatnie odciągnij pozostałe sąsiednie komórki od pożądanego blastomeru. Jeśli celem są komórki linii środkowej, które dzielą ten sam los, można je usunąć razem jako parę. Na koniec odetnij komórkę "uchwytu".
4. Pobrać blastomer (lub parę blastomerów) za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego ssania. Pipetę można wypolerować ogniowo, aby usunąć ostre krawędzie, które mogą uszkodzić ogniwo, ale nie robimy tego rutynowo. Umieścić końcówkę pipety Pasteura pod powierzchnią pożywki hodowlanej w studzience z kulturą eksplantatów i delikatnie usunąć blastomer. Powinien zsunąć się w płytkie zagłębienie grawitacyjne. Ten sam blastomer z więcej niż jednego zarodka można połączyć w jeden eksplantat.
5. Powtórz tę procedurę z pozostałymi zarodkami w naczyniu separacyjnym, jeden po drugim. Po około 10 zarodkach naczynie separacyjne zostanie wypełnione resztkami komórkowymi. Kiedy tak się stanie, zmień naczynie na świeże naczynie preparacyjne.
6. Po wykonaniu wszystkich sekcji sprawdź, czy eksplantaty znajdują się w płytkich zagłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie wepchnąć do zagłębienia za pomocą pętli do włosów, która została wysterylizowana w 70% etanolu i wysuszona na powietrzu.
7. Około godziny po ostatniej sekcji usuń zanieczyszczenia otaczające zagojone eksplantaty za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura.
8. Hodować na szalce z eksplantatami w temperaturze 14–20 °C obok szalki Petriego zawierającej rodzeństwo, zarodki kontrolne. Zarodki rodzeństwa wskażą etap rozwoju eksplantatów blastomerów.

4. Zbieranie eksplantatów do analizy

1. Zbierz eksplantaty, gdy rodzeństwo osiągnie pożądany etap rozwoju. Te eksplantaty przeżywają całkiem dobrze, nawet jeśli niektóre komórki się rozpadną. Dlatego, jeśli w kulturze znajduje się mętna masa, zbadaj ją za pomocą pętli do włosów lub kleszczy, aby ustalić, czy w środku zakopany jest zdrowy eksplantat.
2. Pobrać eksplantaty w małej objętości roztworu hodowlanego za pomocą szklanej pipety Pasteura i delikatnie wydalić je do buforu utrwalającego lub do lizy odpowiedniego dla testu, który ma być przeprowadzony
.

Wyniki

Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki polega na wycięciu właściwego blastomeru na podstawie map losów ^{1, 2, 3, 4, 5, 6}. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać zarodki z prawidłowym wzorcem pigmentacji na etapie 2-komórkowym, jak pokazano na rysunku 1, które następnie dostosowują się do regularnych wzorców rozszczepienia, jak pokazano na rysunku 2. Jeśli obserwuje się posortowane zarodki, gdy osiągają wymagany etap rozszczepienia i oddziela zarodki w...

Dyskusja

Najważniejszymi krokami dla udanej hodowli poszczególnych blastomerów są: 1) prawidłowa identyfikacja interesującego nas blastomeru; 2) utrzymanie sterylnej, zdrowej kultury; 3) preparowanie komórek w odpowiednim momencie cyklu komórkowego; oraz 4) rozwijanie niezbędnej zręczności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas preparacji i dobrze przenieść do hodowli.

Aby manipulować określonymi blastomerami, niezbędna jest umiejętność identyfikacji osi kardynalnych. W zarodkach Xenopus...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia ścierna z tlenku glinu	Thomas Scientific	#6775E-38	Kurs (12 μ m), do remontów kapitalnych końcówek kleszczy
Folia ścierna z tlenku glinu	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μ m), do dokładnego ostrzenia końcówek kleszczy
Folia ścierna z tlenku glinu	Thomas Scientific	#6775E-54	Drobna (0,3 μ m), do polerowania końcówek kleszczy
Kleszcze: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	Mają cienkie końcówki, które nie wymagają ostrzenia przy pierwszym zakupie. Odporne na korozję, dzięki czemu można je sterylizować w autoklawie.
Roztwór gentamycyny	Sigma	G1397	Dodać do podłoża tego samego dnia, w którym użyto