Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Podsumowanie

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Streszczenie

Mapy losów, konstruowane na podstawie śledzenia linii wszystkich komórek embrionu, ujawniają, z których komórek embrionu pochodzą poszczególne tkanki. Chociaż mapy losów są bardzo użyteczne w identyfikacji prekursorów narządu oraz w wyjaśnianiu drogi rozwojowej, dzięki której komórki potomne zasiedlają ten narząd w normalnym embrionie, nie obrazują one pełnego potencjału rozwojowego komórki prekursorskiej ani nie identyfikują mechanizmów, za pomocą których ustalany jest jej los. Aby przetestować determinację losu komórki, porównuje się normalny zestaw jej potomków w nienaruszonym embrionie (mapę losów) z tymi, którzy pojawiają się po manipulacji eksperymentalnej. Czy los komórki jest ustalony (zdeterminowany) niezależnie od otaczającego środowiska komórkowego, czy też jest on wpływany przez czynniki zewnętrzne dostarczane przez sąsiednie komórki? Wykorzystując kompleksowe mapy losów embrionu Xenopus, opisujemy sposób identyfikacji, izolacji i hodowli pojedynczych prekursorów z etapu podziałów, nazywanych blastomerami. Podejście to pozwala ocenić, czy te wczesne komórki są zdeterminowane do losu, który nabywają w normalnym środowisku w nienaruszonym embrionie, czy wymagają interakcji z sąsiednimi komórkami, bądź czy mogą zostać skłonione do realizacji alternatywnych losów w przypadku narażenia na inne rodzaje sygnałów.

Wprowadzenie

Xenopus laevis embriony są szeroko wykorzystywane do identyfikacji mechanizmów, dzięki którym komórki embrionalne nabywają swoje specyficzne przeznaczenie, ponieważ ich jaja są wystarczająco duże, aby umożliwić zastosowanie metod mikrochirurgicznych. Ponadto rozwijają się one zewnętrznie bez konieczności suplementacji odżywczej pożywki hodowlanej, gdyż każda komórka zawiera bogaty wewnątrzkomórkowy zapas płytek żółtkowych, które stanowią wewnętrzny magazyn energii. Ważnym atutem w badaniu mechanizmów determinacji przeznaczenia komórek jest kompleksowy zestaw map przeznaczenia blastomerów w stadium podziału (od stadium 2- do 32-komórkowego) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6}. Mapy te zostały opracowane poprzez mikroiniekcję wykrywalnej cząsteczki do pojedynczego, identyfikowalnego blastomeru i monitorowanie w późniejszych etapach rozwoju, które tkanki są zasiedlane przez znakowane potomstwo. Spójne mapy przeznaczenia są możliwe dzięki temu, że główne osie embrionów można niezawodnie zidentyfikować w wielu osobnikach. Po pierwsze, we wszystkich embrionach typu dzikiego półkula zwierzęca jest pigmentowana, podczas gdy półkula roślinna nie jest. Po drugie, wniknięcie plemnika podczas zapłodnienia powoduje przesunięcie pigmentacji półkuli zwierzęcej w stronę przyszłej strony brzusznej; w wielu embrionach różnica w pigmentacji może zatem służyć do rozróżnienia strony grzbietowej od brzusznej. Po trzecie, pierwsza bruzda podziałowa w większości embrionów odpowiada płaszczyźnie pośrodkowej strzałkowej, a zatem może być wykorzystana do identyfikacji prawej i lewej strony embrionu. Mapy przeznaczenia opierają się również na fakcie, że naturalnie zapłodnione jaja często dzielą się według regularnych wzorców, co sprawia, że każdy blastomer jest identyfikowalny w dużej populacji embrionów. Chociaż występuje zmienność w obrębie i pomiędzy partiami jaj w zakresie pigmentacji i wzorców podziału, zastosowanie opisanych tutaj procedur selekcyjnych pozwala na identyfikację komórek o określonym przeznaczeniu z dokładnością około 90%.

Losy komórek mogą być determinowane podczas embriogenezy przez kilka mechanizmów. Czynniki wewnętrzne, takie jak różnicowo dziedziczone mRNA cytoplazmatyczne lub białka, przyczyniają się do wielu aspektów wczesnego wzorowania. Na przykład specyficzne macierzyńskie mRNA determinują, które komórki utworzą linię zarodkową, staną się endodermą lub przyczynią się do powstania grzbietowej osi ciała (przegląd w ⁷). Czynniki zewnętrzne dostarczane lokalnie przez sąsiednie komórki lub z większej odległości z embrionalnego centrum sygnalizacyjnego odpowiadają za indukcję specyficznych typów tkanek i wzorowanie niemal każdego układu narządowego. Przykładami centrów sygnalizacyjnych są organizator/węzeł w gastruli, który indukuje ektodermę neuralną i wzoruje mezodermę, oraz strefa aktywności polaryzującej, która wzoruje oś przednio-tylną pączka kończyny. Chociaż mapy losów pozwalają zidentyfikować prekursory różnych narządów i ujawniają ścieżkę rozwojową ich potomstwa w normalnym embrionie, nie potrafią one odróżnić wpływu czynników wewnętrznych od zewnętrznych na te komórki. Nie ujawniają one również pełnego potencjału rozwojowego komórki, której potomstwo różnicuje się w złożonym środowisku sygnalizacyjnym embrionu. Dwa podejścia eksperymentalne pozwalają sprawdzić, czy los komórki jest determinowany przez czynniki wewnętrzne, czy jest następnie modyfikowany przez czynniki zewnętrzne: 1) transplantacja komórki w nowe miejsce w embrionie; lub 2) usunięcie komórki z embrionu, a następnie hodowla w warunkach braku egzogennych sygnałów.

Oba podejścia eksperymentalne są możliwe do zastosowania u Xenopus, ponieważ komórki są wystarczająco duże, aby można było je rozdzielić ręcznie. Na przykład w licznych badaniach usuwano pojedyncze komórki z embrionów (aby zmienić oddziaływania międzykomórkowe) lub przeszczepiano komórki w nowe miejsca w embrionach biorcy w celu przetestowania zmian w ich losie (przegląd w ^{7, 8, 9}). Ponadto drugie podejście, polegające na eksplantacji niewielkiej liczby komórek z różnych regionów embrionu do hodowli w celu wyjaśnienia indukcyjnych oddziaływań tkankowych w przypadku braku czynników egzogennych, jest możliwe dzięki temu, że komórki embrionu Xenopus są wypełnione wewnątrzkomórkowym zapasem składników odżywczych – płytkami żółtka. W związku z tym mogą być one hodowane przez kilka dni w zdefiniowanym medium solnym bez konieczności uzupełniania pożywki o składniki odżywcze lub czynniki wzrostu. Wykorzystaliśmy to podejście, aby wykazać, że grzbietowe blastomery zwierzęce posiadają autonomiczną zdolność do wytwarzania tkanek neuronalnych i grzbietowych mezo-dermalnych dzięki matczynie dziedziczonym mRNA ^{10, 11}, a inni wykazali, że specyfikacja mezodermy blastomerów w stadium 32 komórek zależy zarówno od informacji wewnętrznych, jak i zewnętrznych ¹². Zaletą hodowania komórek jako eksplantów jest możliwość uzupełnienia medium o zdefiniowane czynniki sygnałowe, aby określić, która ścieżka komunikacji międzykomórkowej może wpływać na los eksplantowanej komórki ^{12, 13, 14}. Dodatkowo, przed rozpoczęciem hodowli, do blastomeru można wstrzyknąć mRNA w celu nadekspresji genu lub oligonukleotydy antysensowne, aby zapobiec translacji endogennych mRNA. Takie analizy funkcji zyskanej (gain-of-function) i utraconej (loss-of-function) pozwalają zidentyfikować cząsteczki niezbędne do autonomicznie wyrażanego losu komórki. Aby przeanalizować los eksplantu, identyfikację specyficznych typów komórek można przeprowadzić za pomocą standardowych metod badania ekspresji genów (np. hybrydyzacja in situ, RT-PCR) oraz testów immunocytochemicznych. Niniejszy protokół stanowi prosty, a zarazem skuteczny sposób rozróżnienia między mechanizmami wewnętrznymi a zewnętrznymi, które regulują proces przekształcania się komórki embrionalnej w specyficzne tkanki.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek i naczyń hodowlanych

1. Naostrz cztery pęsety za pomocą folii ściernej z tlenkiem glinu. Czynność tę wykonaj pod mikroskopem stereoskopowym, aby kontrolować wielkość końcówek. Jedna pęseta służy jako zapasowa na wypadek uszkodzenia końcówki podczas procedury. Wszystkie cztery pęsety wysterylizuj w autoklawie i przechowuj w sterylnym pojemniku.
2. Przygotuj po 500 ml pożywki hodowlanej o stężeniu 0.1X i 1.0X (może to być zmodyfikowany roztwór Ringera wg Marca [MMR] lub zmodyfikowana sól Bartha [MBS]; przepisy w ¹⁵) i wysterylizuj przez filtrację. Rutynowo stosujemy MBS (1X = 88 mM NaCl; 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 5 mM HEPES [pH 7.8], 2.5 mM NaHCO₃). Przechowywać w temperaturze 14-18 °C przez kilka miesięcy.
3. Przygotuj 2% roztwór agarozy w pożywce hodowlanej (2 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml pożywki hodowlanej 1X w szklanej butelce z zakrętką). Wysterylizuj w autoklawie, aby rozpuścić agarozę. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy i podgrzewać w kuchence mikrofalowej w celu upłynnienia agarozy przy kolejnym użyciu.
4. Gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, wlej około 0.5 ml na dno każdego dołka sterylnej płytki hodowlanej 24-dołkowej. Zapobiegnie to przywieraniu eksplantatów do plastiku.
5. Gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, wlej około 2-3 ml na dno dwóch lub trzech szalek Petriego o średnicy 60 mm i delikatnie zamieszaj okrężnie, aby upewnić się, że dno jest pokryte. Będą one służyć jako szalki do dyssekcji, a agaroza zapobiegnie przywieraniu zarodków do plastiku po usunięciu ich błon.
6. Po ochłodzeniu i stwardnieniu agarozy, opal końcówkę 6-calowej pipety Pasteura, aż stopi się ona w kulkę, a następnie lekko dotknij powierzchni agarozy w każdym dołku płytki hodowlanej. Utworzy to płytkie wgłębienie, w którym zostanie umieszczony eksplantat.
7. Napełnij każdy dołek płytki hodowlanej sterylną pożywką hodowlaną 1X.
8. Po ochłodzeniu i stwardnieniu agarozy, napełnij szalkę do dyssekcji rozcieńczoną pożywką hodowlaną (0.1X MMR lub 0.1X MBS), aby ułatwić separację blastomerów.

2. Selekcja embrionów

1. Pozyskać zapłodnione jaja i usunąć otoczki galaretowate zgodnie ze standardowymi protokołami ¹⁵. Przenieść je do 0,5X pożywki hodowlanej w 100 mm szalce Petriego.
2. Gdy embriony osiągną stadium 2 komórek, wyselekcjonować do oddzielnej szalki te, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina słabo pigmentowany obszar w półkuli zwierzęcej (Ryc. 1). Będą one służyć jako donory eksplantów. Pozostałe embriony w stadium 2 komórek przechowywać w oddzielnej szalce obok embrionów donora przez cały czas trwania procedury, aby służyły jako kontrole rodzeństwa do określania stadium rozwoju eksplantów.

3. Przygotowanie eksplantatów

1. Umieść 5-10 embrionów w naczyniu do sekcji, jednak pracuj nad jednym embrionem w danym czasie.
2. Ustaw pierwszy embrion tak, aby widoczna była przezroczysta błona witelinowa; jest ona oddzielona wyraźną przestrzenią (przestrzenią periwitelinową) nad powierzchnią bieguna zwierzęcego embrionu. Używając zaostrzonej pęsety w niedominującej ręce (lewej, jeśli osoba jest praworęczna), uchwyć błonę witelinową powyżej przestrzeni periwitelinowej. Używając zaostrzonej pęsety w drugiej ręce, uchwyć błonę blisko końcówki pierwszej pęsety i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby odwarstwić błonę. Pierwszy chwyt wykonaj w pewnej odległości od komórki przeznaczonej do sekcji, aby komórka docelowa nie została uszkodzona podczas usuwania błony. O usunięciu błony można się dowiedzieć po tym, że embrion spłaszczy się.
3. Uchwyć jedną sąsiednią komórkę pęsetą w niedominującej ręce i wykorzystaj tę komórkę jako „uchwyt”, aby nie dotykać bezpośrednio komórki przeznaczonej do sekcji. Pęsetą w drugiej ręce delikatnie odsun pozostałe sąsiednie komórki od pożądanego blastomeru. Jeśli celem są komórki linii środkowej, które mają ten sam los, można je usunąć razem w parze. Na koniec wysekcjonuj komórkę pełniąca rolę „uchwytu”.
4. Pobierz blastomer (lub parę blastomerów) za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego ssania. Pipetę można wypalić w płomieniu, aby usunąć ostre krawędzie, które mogłyby uszkodzić komórkę, choć nie robimy tego rutynowo. Umieść końcówkę pipety Pasteura pod powierzchnią pożywki w dołku naczynia do hodowli eksplantów i delikatnie wypuść blastomer. Powinien on pod wpływem grawitacji wsunąć się do płytkiego wgłębienia. Te same blastomery z więcej niż jednego embrionu można połączyć w jeden eksplant.
5. Powtórz tę procedurę z pozostałymi embrionami w naczyniu do sekcji, jeden po drugim. Po około 10 embrionach naczynie do sekcji zapełni się szczątkami komórkowymi. W takim przypadku zmień naczynie na nowe.
6. Po zakończeniu wszystkich sekcji sprawdź, czy eksplanty znajdują się w płytkich wgłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie wsunąć do wgłębienia za pomocą pętelki z włosa, która została wysterylizowana w 70% etanolu i wysuszona powietrzem.
7. Około godzinę po ostatniej sekcji usuń szczątki otaczające przytwierdzone eksplanty za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura.
8. Inkubuj płytkę z eksplantami w temperaturze 14-20 °C obok szalki Petriego zawierającej rodzeńskie embriony kontrolne. Embriony rodzeńskie będą wskazywać stadium rozwoju eksplantów blastomerowych.

4. Pobieranie eksplantatów do analizy

1. Zabierz eksplanty, gdy rodzeństwo osiągnie pożądany stopień rozwoju. Eksplanty te przeżywają całkiem dobrze, nawet jeśli niektóre z komórek ulegną dezintegracji. Dlatego, jeśli w studni hodowlanej znajduje się mętna masa, należy zbadać ją za pomocą pętelki z włosa lub pęsety, aby sprawdzić, czy wewnątrz znajduje się zdrowy eksplant.
2. Pobierz eksplanty wraz z niewielką objętością roztworu hodowlanego za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie delikatnie przenieś je do utrwalacza lub buforu lizującego odpowiedniego dla planowanego testu.

Wyniki

Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki opiera się na wypreparowaniu odpowiedniego blastomeru na podstawie map losów komórkowych ^{1, 2, 3, 4, 5, 6}. Dlatego kluczowe jest wybranie embrionów o prawidłowym wzorcu pigmentacji w stadium 2-komórkowym, jak pokazano na Rysunku 1, które następnie wykazują prawidłowe wzorce podziałów, jak pokazano na Rysunku 2. Dokładność znacznie wzrasta, jeśli obserwuje się posortowane embriony w momencie osiągnięcia wymag...

Dyskusja

Kluczowe kroki dla pomyślnego hodowania pojedynczych blastomerów to: 1) prawidłowa identyfikacja wybranego blastomeru; 2) utrzymanie sterylnej i prawidłowej hodowli; 3) wyizolowanie komórek w odpowiedniej fazie cyklu komórkowego; oraz 4) wypracowanie niezbędnej sprawności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas dyssekcji i przenoszenia do dołka hodowlanego.

Aby manipulować konkretnymi blastomerami, niezbędna jest możliwość zidentyfikowania głównych osi. W embrionach Xenopus stron...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ścierna folia tlenkowa (alumina)	Thomas Scientific	#6775E-38	Gruboziarnista (12 μm), do głównych napraw końcówek pęset
Ścierna folia tlenkowa (alumina)	Thomas Scientific	#6775E-46	Średnioziarnista (3 μm), do precyzyjnego ostrzenia końcówek pęset
Ścierna folia tlenkowa (alumina)	Thomas Scientific	#6775E-54	Drobnoziarnista (0.3 μm), do polerowania końcówek pęset
Pęseta: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	Posiadają precyzyjne końcówki, które nie wymagają ostrzenia bezpośrednio po zakupie. Odporne na korozję, co umożliwia ich autoklawowanie.
Roztwór gentamycyny	Sigma	G1397	Dodać do pożywki w dniu użycia