$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
*Wszystkie materiały wraz z odpowiednimi producentami i/lub sprzedawcami są wymienione poniżej protokołu.
1. Montaż implantu
- Przygotuj mieszaninę ciepłoutwardzalnej żywicy epoksydowej światłowodowej, dodając 100 mg utwardzacza do 1 g żywicy.
- Zmierz i wytnij około 35 mm światłowodu 125 μm z rdzeniem 100 μm, nacinając go rysikiem z węglika spiekanego z końcówką klinową. Ustaw rysę prostopadle do światłowodu i nacinaj pojedynczym, jednokierunkowym ruchem. Całkowite przecięcie włókna spowoduje uszkodzenie rdzenia włókna.
- Włóż ceramiczną tuleję LC z otworem 127 μm do imadła, wypukłą stroną skierowaną w dół.
- Włóż światłowód do tulejki. Światłowód powinien wsuwać się płynnie i nieznacznie wystawać poza wypukły koniec tulejki (rysunek 1a).
- Nałóż jedną kroplę utwardzanej na gorąco żywicy epoksydowej światłowodowej na płaski koniec i podgrzej opalarką, aż żywica epoksydowa zmieni kolor na. Żywica epoksydowa powinna wypełniać skuwkę podczas jej podgrzewania i przed utwardzeniem. Żywica epoksydowa powinna utwardzić się w ciągu ~1 minuty od nałożenia stałego ciepła.
- Oczyść żywicę epoksydową wzdłuż boków tulejki, ponieważ będzie ona utrudniać połączenie ze złączką.
- Wypoleruj wypukły koniec tulejki za pomocą światłowodowej tarczy polerskiej LC (FOPD) na arkuszach polerskich z tlenku glinu na podkładce polerskiej (rysunek 1b). Wykonaj okrągłe wzory rotacji i wypoleruj w czterech gatunkach w następującej kolejności: ziarnistość 5, 3, 1 0,3 μm.
- Przytnij światłowód na płaskim końcu na odpowiednią długość, tak aby był skierowany w obszar zainteresowania. Długość można określić za pomocą atlasu stereotaktycznego.
- Przetestuj implant, podłączając go do lasera za pomocą linki sprzęgającej opisanej poniżej. Wypolerowany koniec implantu jest wkładany do tulei łącznika i powinien mieć bezpośredni kontakt z przeciwległą tuleją. Implant powinien być w stanie utrzymać 10 mW strumienia świetlnego, mierzonego na końcu włókna implantu. Zły implant będzie miał słaby punkt ogniskowy w pobliżu końcówki światłowodu.
- Gotowe implanty (rysunek 1c) należy przechowywać w piance do czasu użycia.
2. Montaż przewodu światłowodowego
- Przygotuj mieszaninę ciepłoutwardzalnej żywicy epoksydowej światłowodowej, jak powyżej.
- Zmierz i przytnij światłowód o odpowiedniej długości 220 μm z rdzeniem 200 μm, nacinając go rysikiem z węglika spiekanego z końcówką klinową. Długość włókna powinna umożliwiać myszowi swobodne poruszanie się po obudowie, ale nie pozwalać myszy na przegryzanie włókna.
- Włóż światłowód do rurki furkacyjnej o długości nieco dłuższej niż długość światłowodu. Rurka powinna mieć średnicę wewnętrzną nieco większą niż światłowód.
- Zdejmij ~ 25 mm z jednego końca światłowodu i włóż go do metalowego końca wielomodowego zespołu tulejki FC MM z otworem 230 μm, aż się zatrzyma. Światłowód powinien wystawać przez końcówkę tulejki (rysunek 2a).
- Zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem (super klejem) na metalowym końcu. Zakryj połączenie osłoną złącza i wypoleruj końcówkę tulejki za pomocą FC FOPD. Wykonaj okrągłe wzory rotacji i wypoleruj w czterech gatunkach w następującej kolejności: ziarnistość 5, 3, 1, 0,3 μm (rysunek 2b).
- Zdejmij i włóż drugi koniec światłowodu do ceramicznej tulejki LC (otwór o średnicy wewnętrznej 230 μm) z wypukłym końcem dystalnie. Nałóż kroplę żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzewaj, aż się utwardzi.
- Wypoleruj wypukły koniec tulejki za pomocą FC FOPD na arkuszach polerskich z tlenku glinu, jak opisano powyżej.
- Nasuń tuleję tulejki tulejowej LC na wypukły koniec tulejki aż do punktu środkowego tulei.
- Umieść rurkę termokurczliwą na rurce furkacyjnej i tulei i podgrzej, aby zabezpieczyć i chronić połączenie (Rysunek 2c).
- Przetestuj łącznik, podłączając go do źródła lasera i mierząc strumień świetlny przez łącznik za pomocą spektrofotometru. Strata światła między wyjściem lasera a zmierzoną mocą sprzęgacza nie powinna przekraczać 30%.
3. Implantacja chirurgiczna
*To jest procedura tylko dla napiwków. Narzędzia są sterylne, ale rękawiczki nie muszą takie być ze względu na ciągłą manipulację między narzędziami a sprzętem.
- Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy/ksylazyny odpowiednio 100 i 10 mg/kg za pomocą igły o rozmiarze 30.
- Ogol skórę głowy maszynką do strzyżenia. Przetrzyj skórę głowy 70% alkoholem izopropylowym, a następnie przetrzyj Betasept (4% roztwór chlorheksydyny) przez dwie minuty, powtarzając raz.
- Umieść mysz w urządzeniu sterotaksyjnym i zabezpiecz głowę, upewniając się, że czaszka jest wypoziomowana. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i bólowi pooperacyjnemu. Utrzymuj znieczulenie za pomocą ulatniającego się izofluranu (1-3% rozcieńczonego tlenem w zależności od stanu fizjologicznego myszy, który powinien być stale monitorowany przez reakcję na uszczypnięcie ogona).
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę z oczodołów na lambda. W razie potrzeby odsuń na bok tkankę łączną.
- Użyj klamer Serafin, aby zatrzymać skórę i utrzymać dostęp do czaszki (ryc. 3a).
- Wytraw wzór w kratkę na całej powierzchni czaszki za pomocą wykałaczki dentystycznej. Zmyj zanieczyszczenia sterylną solą fizjologiczną. Dokładnie wysuszyć.
- Nałóż nadtlenek wodoru (3%) na odsłoniętą czaszkę za pomocą bawełnianego wacika na ~ 2-3 sekundy, aby utworzyć mikropory. Umyj kilka razy i dokładnie wysusz. Alternatywnie kotwy można wkręcić w czaszkę, jak opisano w Sparta i wsp. (2012).
- Ponownie wytraw wzór w kratkę w całej czaszce za pomocą wykałaczki dentystycznej i zmyj zanieczyszczenia solą fizjologiczną. Dokładnie wysuszyć.
- Za pomocą narzędzia obrotowego wykonaj kraniotomię z małym otworem w kształcie zadziorów (o średnicy <1 mm) sterylnym wiertłem (autoklawizowanym) powyżej obszaru zainteresowania, określonego przez atlas stereotaktyczny skalibrowany do bregmy i lambdy. Uważaj, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki. Zmyj zanieczyszczenia i dokładnie wysusz.
- Włóż tuleję światłowodową (implant) do uchwytu sondy i podłącz do ramienia stereotaktycznego.
- Umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania za pomocą ramienia stereotaktycznego (ryc. 3b). W przypadku wprowadzania światłowodu do tkanki mózgowej, światłowód powinien być przesuwany powoli z prędkością ~2 mm / min. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce.
- Przygotuj mieszaninę cementu dentystycznego. Mieszanina powinna mieć wystarczająco niską lepkość, aby można ją było łatwo rozprowadzić po całej czaszce. Mieszanina będzie zdatna do użytku przez 2-4 minuty.
- Za pomocą sterylnej wykałaczki nałóż cienką, równą warstwę cementu dentystycznego w poprzek czaszki i na dolną część implantu. Podstawowa warstwa cementu dentystycznego powinna pokrywać jak największą powierzchnię czaszki. Nie pozwól, aby cement dentystyczny miał kontakt ze skórą myszy. Doprowadzi to do zwiększonych trudności w szyciu, a także podrażnienia myszy. Jeśli cement dentystyczny wejdzie w kontakt ze skórą, pozwól mu częściowo wyschnąć, tak aby cała warstwa cementu mogła zostać złuszczona przed związaniem.
- Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
- Nałóż równe warstwy cementu dentystycznego, aby utworzyć mały wzgórek nad czaszką i wokół implantu, pozwalając każdej warstwie całkowicie wyschnąć (ryc. 3c). Pozostaw ~3-5 mm wypukłego końca tulejki z dala od cementu, aby umożliwić gładkie, niezakłócone połączenie.
- Zszyj skórę głowy nad wzgórkiem cementu dentystycznego i wokół implantu za pomocą sterylnych, jednorazowych jedwabnych szwów plecionych (6-0) za pomocą igły C22. Usuń po 7 dniach. Opcjonalnie: Użyj Vet Bond do dodatkowego wiązania po zszyciu. Upewnij się, że używasz minimalnej ilości Vet Bond. Nadmiar może prowadzić do poważnych uszkodzeń skóry z powodu drapania.
- Bezpośrednio po zabiegu myszom należy wstrzyknąć podskórnie Ketprophen (5 mg/kg) w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego. Należy to powtórzyć 24 godziny później. Stosować miejscowo leki przeciwbólowe (bupiwakaina) i antybiotyki (Neosporin) na zszytą skórę i wokół podstawy implantu.
- Umieść mysz w klatce na kocu grzewczym, aby odzyskać siły po znieczuleniu. Umieść mysz w sterylnej, pooperacyjnej klatce rekonwalescencyjnej. Klatka rekonwalescencyjna nie powinna zawierać żadnej ściółki, aby utrzymać temperaturę i uniknąć uduszenia. Mysz można przywrócić do oryginalnej klatki lub nowej klatki po przebudzeniu.
Prawidłowy montaż implantu światłowodowego i łącznika powoduje minimalne straty fotonów między źródłem światła a końcem światłowodu w obszarze zainteresowania. Dobrze wypolerowane światłowody powinny przepuszczać światło w jednolitym, koncentrycznym okręgu (rysunek 2d). Dzięki starannemu wszczepieniu implantu i zszyciu implant nie powoduje widocznego podrażnienia myszy i może pozostać na miejscu przez długotrwałe badania (ryc. 3d, >1 miesiąc, niepublikowane obserwacje) bez znaczącej degradacji światłowodu lub ilości przesyłanego światła. Niewłaściwa implantacja lub szycie może powodować podrażnienie i może spowodować drapanie skóry głowy przez mysz, odsłonięcie cementu dentystycznego lub pęknięcie skuwki od cementu dentystycznego z powodu uporczywej manipulacji. Schemat ideowy zmontowanego systemu można zobaczyć na rysunku 4.
Rysunek 1. Montaż wszczepialnych światłowodów. (a) Światłowód jest wkładany do tulejki, nieznacznie wystający poza wypukły koniec wskazany przez grot strzałki. (b) Wypukły koniec tulejki jest polerowany za pomocą FOPD na coraz drobniejszych gatunkach blach polerskich. (c) Gotowy wszczepialny światłowód. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.
Rysunek 2. Montaż łącznika światłowodowego służącego do przywiązania światłowodowego złącza obrotowego do implantu. (a) Światłowód przechodzący przez zespół tulejki. (b) Strona tulejowa zespołu jest wkładana do FOPD i polerowana przy użyciu coraz drobniejszych gatunków papieru polerskiego. (c) Tuleja tulejowa jest mocowana na tulejce i zabezpieczona rurką termokurczliwą. (d) Gotowy łącznik światłowodowy powinien wytwarzać koncentryczne światło przy minimalnych stratach fotonów.
Rysunek 3. Chirurgiczne wszczepienie implantów światłowodowych. a) Cała powierzchnia czaszki zostaje odsłonięta, a tkanka łączna oczyszczona. (b) Implant światłowodowy jest utrzymywany w pozycji z ramieniem stereotaktycznym. (c) Cement dentystyczny jest nakładany mocując implant światłowodowy do czaszki. d) >1 miesiąc po implantacji skóra wokół implantu zagoiła się i nie ma żadnych oznak podrażnienia.
Rysunek 4. Schemat ideowy układu funkcjonalnego