Rozwój optogenetyki dostarcza teraz środków do precyzyjnej stymulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów i obwodów, zarówno in vitro, jak i in vivo. Tutaj opisujemy montaż i wszczepienie światłowodu do przewlekłej fotostymulacji tkanki mózgowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wyjaśnienie wzorców połączeń neuronalnych było wyzwaniem zarówno dla klinicznej, jak i podstawowej neuronauki. Elektrofizjologia jest złotym standardem w analizie wzorców połączeń synaptycznych, ale sparowane zapisy elektrofizjologiczne mogą być zarówno kłopotliwe, jak i eksperymentalnie ograniczające. Rozwój optogenetyki wprowadził elegancką metodę stymulacji neuronów i obwodów, zarówno in vitro1, jak i in vivo2,3. Wykorzystując aktywność promotora specyficznego dla typu komórki do napędzania ekspresji opsyny w dyskretnych populacjach neuronów, można precyzyjnie stymulować genetycznie zdefiniowane podtypy neuronów w odrębnych obwodach4-6. Dobrze opisane metody stymulacji neuronów, w tym stymulacja elektryczna i/lub manipulacje farmakologiczne, są często bezkrytyczne, inwazyjne i mogą uszkadzać otaczające tkanki. Ograniczenia te mogą zmienić normalną funkcję synaptyczną i/lub zachowanie obwodu. Ponadto, ze względu na charakter manipulacji, obecne metody są często ostre i terminalne. Optogenetyka daje możliwość stymulowania neuronów w stosunkowo nieszkodliwy sposób i w neuronach ukierunkowanych genetycznie. W większości badań z udziałem optogenetyki in vivo wykorzystuje się obecnie światłowód prowadzony przez wszczepioną kaniulę6,7; Jednak ograniczenia tej metody obejmują uszkodzoną tkankę mózgową przy wielokrotnym wprowadzaniu światłowodu oraz potencjalne pęknięcie włókna wewnątrz kaniuli. Biorąc pod uwagę rozwijającą się dziedzinę optogenetyki, konieczna jest bardziej niezawodna metoda przewlekłej stymulacji, aby ułatwić długoterminowe badania przy minimalnym przypadkowym uszkodzeniu tkanek. W tym miejscu udostępniamy nasz zmodyfikowany protokół w formie artykułu wideo, aby skutecznie i elegancko uzupełnić metodę opisaną w Sparta i wsp. 8 do wytworzenia implantu światłowodowego i jego trwałego zamocowania na czaszce znieczulonych myszy, a także montażu łącznika światłowodowego łączącego implant ze źródłem światła. Implant, połączony światłowodami z laserem na ciele stałym, pozwala na skuteczną metodę chronicznej fotostymulacji funkcjonalnych obwodów neuronalnych przy mniejszym uszkodzeniu tkanek9 przy użyciu małych, odłączanych pasów. Trwałe mocowanie implantów światłowodowych zapewnia spójne, długoterminowe badania optogenetyczne in vivo obwodów neuronalnych u obudzonych, zachowujących się myszy10 przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.
Protokół
*Wszystkie materiały wraz z odpowiednimi producentami i/lub dostawcami są wymienione poniżej protokołu.
1. Montaż implantu
- Przygotować mieszaninę utwardzalnej termicznie żywicy epoksydowej do światłowodów, dodając 100 mg utwardzacza do 1 g żywicy.
- Odmierzyć i odciąć około 35 mm światłowodu o średnicy 125 μm i rdzeniu 100 μm, nacinając go węglikowym skryberem z klinowym grotem. Ustawić skryber prostopadle do światłowodu i naciąć go jednym, jednokierunkowym ruchem. Całkowite przecięcie światłowodu uszkodzi jego rdzeń.
- Włożyć ceramiczną ferrulę LC o średnicy otworu 127 μm do imadła, stroną wypukłą skierowaną w dół.
- Wsunąć światłowód do ferruli. Światłowód powinien gładko wejść do środka i nieznacznie wystawać poza wypukły koniec ferruli (Rysunek 1a).
- Nanieść jedną kroplę utwardzalnej termicznie żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzewać opalarką, aż żywica stanie się czarna. Żywica powinna wypełnić ferrulę podczas podgrzewania i przed utwardzeniem. Utwardzanie żywicy powinno nastąpić w ciągu ~1 min stałego przykładania ciepła.
- Usunąć nadmiar żywicy z boków ferruli, ponieważ będzie ona utrudniać połączenie ze sprzęgaelem.
- Wypolerować wypukły koniec ferruli za pomocą dysku polerskiego do światłowodów LC (FOPD) na arkuszach polerskich z tlenku glinu umieszczonych na podkładce polerskiej (Rysunek 1b). Wykonywać okrężne ruchy obrotowe i polerować na czterech stopniach ziarnistości w następującej kolejności: 5, 3, 1 i 0,3 μm.
- Odciąć światłowód na płaskim końcu do odpowiedniej długości, tak aby celował w obszar zainteresowania. Długość można określić korzystając z atlasu stereotaktycznego.
- Przetestować implant, podłączając go do lasera za pomocą przewodu sprzęgającego opisanego poniżej. Wypolerowany koniec implantu należy wsunąć w tuleję sprzęgała, tak aby stykał się bezpośrednio z przeciwległą ferrulą. Implant powinien być w stanie utrzymać moc wyjściową światła 10 mW, mierzoną na końcówce światłowodu implantu. Wadliwy implant będzie miał słabo zogniskowany punkt w pobliżu końcówki światłowodu.
- Przechowywać gotowe implanty (Rysunek 1c) w piance do momentu użycia.
2. Montaż przewodu sprzęgacza światłowodowego
- Przygotować mieszaninę utwardzalnej ciepłem żywicy epoksydowej do światłowodów zgodnie z powyższą instrukcją.
- Odmierzyć i odciąć odpowiednią długość światłowodu 220 μm z rdzeniem 200 μm, nacinając go rysikiem z węglika o klinowym grocie. Długość światłowodu powinna umożliwiać myszy swobodne poruszanie się wokół obudowy, ale nie pozwalać jej na przegryzienie światłowodu.
- Wsunąć światłowód do odcinka rurki rozdzielczej o długości nieco większej niż długość światłowodu. Rurka powinna mieć średnicę wewnętrzną nieco większą niż średnica światłowodu.
- Zdjąć izolację z ok. 25 mm jednego końca światłowodu i wsunąć go do metalowej części zespołu ferula FC MM dla światłowodów wielomodowych z otworem 230 μm, aż do oporu. Światłowód powinien wystawać przez koniec ferula (Rysunek 2a).
- Zabezpieczyć połączenie cyjanoakrylanem (super glue) przy metalnym końcu. Przykryć połączenie osłoną złącza (Connector Boot) i wypolerować koniec ferula za pomocą FC FOPD. Wykonywać ruchy obrotowe, polerując na czterech stopniach ziarnistości w następującej kolejności: 5, 3, 1, 0.3 μm (Rysunek 2b).
- Zdjąć izolację z drugiego końca światłowodu i wsunąć go do ceramicznego ferula LC (średnica wewnętrzna otworu 230 μm) końcem wypukłym skierowanym na zewnątrz. Nanieść kroplę żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzać do utwardzenia.
- Wypolerować wypukły koniec ferula za pomocą FC FOPD na arkuszach polerskich z tlenku glinu, zgodnie z powyższym opisem.
- Nasunąć tulejkę ferula LC na wypukły koniec ferula do połowy długości tulejki.
- Nałożyć rurkę termokurczliwą na rurkę rozdzielczą i tulejkę, a następnie podgrzać w celu zabezpieczenia i ochrony połączenia (Rysunek 2c).
- Przetestować sprzęgacz, podłączając go do źródła laserowego i mierząc wyjście światła przez sprzęgacz za pomocą spektrofotometru. Strata światła między wyjściem lasera a zmierzonym wyjściem sprzęgacza nie powinna przekraczać 30%.
3. Implantacja chirurgiczna
*Jest to procedura zawierająca wyłącznie wskazówki. Instrumenty są sterylne, jednak rękawiczki nie muszą takie być ze względu na ciągłe manipulacje między instrumentami a sprzętem.
- Zanurz mysz w narkozie poprzez podanie dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 i 10 mg/kg za pomocą igły 30G.
- hãy Wygoń skórę głowy za pomocą trymera. Przetrzyj skórę głowy 70% alkoholem izopropylowym, a następnie gazikiem Betasept (4% roztwór chlorheksydyny) przez dwie minuty, powtarzając czynność raz.
- Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym i unieruchom głowę, upewniając się, że czaszka jest w poziomie. Nałóż do oczu maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu i bólowi pooperacyjnemu. Podtrzymuj narkozę za pomocą odparowanego izofluranu (1-3% rozcieńczonego tlenem, zależnie od stanu fizjologicznego myszy, który należy stale monitorować, sprawdzając reakcję na uszczypnięcie w ogon).
- Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od oczodołów do lambda. W razie potrzeby odsuń tkankę łączną.
- Użyj klamer Serafina, aby odsunąć skórę i utrzymać dostęp do czaszki (Rysunek 3a).
- Za pomocą zgłębika stomatologicznego wykonaj rytowanie w kratkę na całej powierzchni czaszki. Wypłucz odpryski sterylną solą fizjologiczną. Dokładnie osusz.
- Nałóż nadtlenek wodoru (3%) na odsłoniętą czaszkę za pomocą patyczka kosmetycznego przez ok. 2-3 s, aby stworzyć mikropory. Wypłucz kilkukrotnie i dokładnie osusz. Alternatywnie, zgodnie z opisem u Sparta et al. (2012), do czaszki można wkręcić kotwice.
- Ponownie wykonaj rytowanie w kratkę na całej powierzchni czaszki zgłębikiem stomatologicznym i wypłucz odpryski solą fizjologiczną. Dokładnie osusz.
- Za pomocą narzędzia rotacyjnego wykonaj małą trepanację otworem wiertniczym (<1 mm średnicy), używając sterylnego wiertła (autoklawowanego), nad obszarem zainteresowania wyznaczonym za pomocą atlasu stereotaktycznego skalibrowanego do bregma i lambda. Należy uważać, aby nie przebić opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki. Wypłucz odpryski i dokładnie osusz.
- Włóż ferrulę światłowodową (implant) do uchwytu sondy i podłącz do ramienia stereotaktycznego.
- Za pomocą ramienia stereotaktycznego umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania (Rysunek 3b). W przypadku wprowadzania światłowodu w tkankę mózgową, należy go posuwać powoli z prędkością ok. 2 mm/min. Ferrula powinna opierać się o pozostałą część czaszki.
- Przygotuj mieszankę cementu stomatologicznego. Mieszanka powinna mieć dostatecznie niską lepkość, aby można ją było łatwo nałożyć na czaszkę. Mieszanka będzie zdatna do użycia przez 2-4 min.
- Używając sterylnej wykałaczki, nałóż cienką, równą warstwę cementu stomatologicznego na czaszkę oraz na dolną część implantu. Warstwa bazowa cementu stomatologicznego powinna pokrywać jak największą powierzchnię czaszki. Nie dopuść do kontaktu cementu stomatologicznego ze skórą myszy. Doprowadzi to do zwiększenia trudności przy szyciu oraz do podrażnienia zwierzęcia. Jeśli cement stomatologiczny dostanie się na skórę, odczekaj do jego częściowego wyschnięcia, tak aby całą warstwę cementu można było odkleić przed jego pełnym utwardzeniem.
- Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
- Nakładaj równomierne warstwy cementu stomatologicznego, formując niewielki kopczyk nad czaszką i wokół implantu, pozwalając każdej warstwie całkowicie wyschnąć (Rysunek 3c). Pozostaw ok. 3-5 mm wypukłego końca ferruli bez cementu, aby umożliwić gładkie i niezakłócone połączenie.
- Zaszyj skórę głowy nad kopczykiem cementu stomatologicznego i wokół implantu, używając sterylnych, jednorazowych jedwabnych nici plecionych (6-0) z igłą C22. Usuń szwy po 7 dniach. Opcjonalnie: użyj kleju Wet Bond do dodatkowego wiązania po zaszyciu. Należy użyć minimalnej ilości Wet Bond. Nadmiar może prowadzić do poważnych uszkodzeń skóry wskutek drapania.
- Bezpośrednio po operacji należy podać myszy podskórnie ketoprofen (5 mg/kg) w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego. Czynność tę należy powtórzyć po 24 h. Na zaszytą skórę oraz wokół podstawy implantu nałóż miejscowe środki przeciwbólowe (bupiwakaina) i antybiotyki (Neosporin).
- Umieść mysz w klatce na macie grzewczej w celu wybudzenia z narkozy. Umieść mysz w sterylnej klatce do rekonwalescencji pooperacyjnej. Klatka ta nie powinna zawierać ściółki, aby utrzymać temperaturę i uniknąć uduszenia. Po przebudzeniu mysz można przenieść do pierwotnej klatki lub nowej.
Prawidłowy montaż implantu światłowodowego i sprzęgacza skutkuje minimalną stratą fotonów pomiędzy źródłem światła a końcem światłowodu w obszarze zainteresowania. Dobrze wypolerowane światłowody powinny transmitować światło w postaci równomiernego, koncentrycznego okręgu (Rysunek 2d). Przy starannym implantowaniu i szyciu implant nie powoduje widocznych podrażnień u myszy i może pozostać na miejscu podczas długoterminowych badań (Rysunek 3d, >1 miesiąc, obserwacje niepublikowane) bez istotnej degradacji światłowodu lub ilości transmitowanego światła. Nieprawidłowa implantacja lub szycie mogą powodować podrażnienia i prowadzić do drapania przez mysz skóry głowy, odsłonięcia cementu dentystycznego lub odłamania tulei od cementu dentystycznego w wyniku ciągłych manipulacji. Schemat zmontowanego systemu przedstawiono na Rysunku 4.
Rysunek 1. Montaż implantowalnych światłowodów. (a) Światłowód jest wkładany do tulejki, wystając nieznacznie poza wypukły koniec wskazany grotem strzałki. (b) Wypukły koniec tulejki jest polerowany za pomocą FOPD na arkuszach polerskich o progresywnie drobniejszej ziarnistości. (c) Gotowy implantowalny światłowód. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rysunek 2. Montaż sprzęgacza światłowodowego używanego do połączenia obrotowego złącza światłowodowego z implantem. (a) Światłowód wystający przez zespół tulei. (b) Strona tulei zespołu jest wkładana do FOPD i polerowana przy użyciu papieru ściernego o stopniowo drobniejszej ziarnistości. (c) Tulejka światłowodowa jest nakładana na tuleję i mocowana za pomocą rurki termokurczliwej. (d) Gotowy sprzęgacz światłowodowy powinien emitować koncentryczne światło z minimalną stratą fotonów.
Rysunek 3. Chirurgiczna implantacja światłowodów. (a) Cała powierzchnia czaszki zostaje odsłonięta, a tkanka łączna usunięta. (b) Implant światłowodowy jest utrzymywany w pozycji za pomocą ramienia stereotaktycznego. (c) Cement dentystyczny zostaje naniesiony w celu utrwalenia implantu światłowodowego do czaszki. (d) >1 miesiąc po implantacji skóra wokół implantu uległa zagojeniu i nie wykazuje oznak podrażnienia.
Rycina 4. Schemat funkcjonalny systemu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Optogenetyka to nowa, potężna technika, która pozwala na bezprecedensową kontrolę nad określonymi podtypami neuronów. Można to wykorzystać do modulowania obwodów neuronalnych z anatomiczną i czasową precyzją, unikając jednocześnie bezkrytycznych i inwazyjnych skutków stymulacji elektrycznej za pomocą elektrody dla typu komórkowego. Implantacja światłowodów pozwala na konsekwentną, przewlekłą stymulację obwodów nerwowych przez wiele sesji u rozbudzonych, zachowujących się myszy przy minimalnym uszkodzeniu tkanek. System t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Chcielibyśmy potwierdzić, że ta technika została pierwotnie opisana przez Sparta et al., 2012 i została łatwo zaadaptowana do użytku w naszym laboratorium.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
LC ze złączem obrotowym nauce proste imadło hemostat
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1,25 mm ID |
| FC MM Wstępnie zmontowane złącze | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μ m Tulejka |
| FC MM Złącze wstępnie konfekcjonowane | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μ m Tuleja |
| Miller FOPD-LC Tarcza | PFP | M1-80754 | Do tulejek LC |
| Rurki furkacyjne | PFP | FF9-250 | 900 μ m o.d., 250 &MU; m i.d. |
| Okucie sztyftowe MM LC 1,25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μ m Średnica wewnętrzna |
| MM LC Tuleja sztyftowa 1,25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μ m ID Bore |
| Heatutwardzalny żywica epoksydowa, utwardzacz i żywica | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC / PC i SC / PC Złącze Dysk polerski | ThorLabs | D50-FC | do okuć FC |
| Cyfrowy miernik mocy optycznej i energii | ThorLabs | PM100D | Spektrofotometr |
| Podkładka polerska | ThorLabs | NRS913 | 9 "x 13" 50 Twardość |
| Arkusze docierania (polerowania) tlenku glinu: 0,3, 1, 3, 5 i mu; m ziarnistości | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standardowa twarda okładzina Włókno wielomodowe | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μ m Rdzeń, 0,37 NA |
| Narzędzie do usuwania włókien | ThorLabs | T10S13 | Plater/Powłoka: 200 μ m / 300 μ m |
| Światłowód SILICA/SILICA | Polymicro Technologies | FVP100110125 | Wysoko-OH, wzmocnione promieniowaniem UV, 0,22 NA |
| 1x1 światłowodowe soczewki | doryczne | FRJ_FC-FC | |
| Mono Patchcord światłowodowy | soczewki doryckie | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Rurka termokurczliwa, 1/8 cala | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Opalarka | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 ° F |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| Klej tkankowy VetBond | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Podstawa protezy Flash akrylowa | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniaturowe nożyczki do irysowania | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8,9cm), proste, ostrza 15 mm |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2 "(3,8 cm), zakrzywiony |
| MEGA-Torque Elektryczny silnik laboratoryjny | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Fioletowy niebieski system laserowy | CrystaLaser | CK473-050-O | Długość fali: 473 nm |
| Zasilacz laserowy | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Kleszcze do laminektomii | Narzędzia do nauki o | 11223-20 | |
| Sonda | Narzędzia do nauki o naprawach | 10140-02 | |
| 5-calowe | Excelta | 35-PH | |
| z ważoną podstawą | Altex Electronics | PAN381 |
Bibliografia
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
