Method Article

Biochip z wieloma analitami (MAB) oparty na elektrodach jonoselektywnych w stanie stałym (ASSISE) do badań fizjologicznych

DOI:

10.3791/50020

⸱

April 18th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural and Biological Engineering, Birck-Bindley Physiological Sensing Facility, Purdue University, 2NASA Ames Research Center, 3Department of Chemistry, Pennsylvania State University Hazleton, 4Cooley LLP, 5NASA Life and Physical Sciences, Human Exploration and Operations Mission Directorate, NASA Headquarters

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrody jonoselektywne (ASSISE) w całości w stanie stałym, zbudowane z przetwornika z polimeru przewodzącego (CP), zapewniają kilka miesięcy funkcjonalnego życia w płynnych mediach. W tym miejscu opisujemy proces produkcji i kalibracji ASSISE w formacie lab-on-a-chip. Wykazano, że ASSISE zachował profil nachylenia zbliżony do nernstiańskiego po długotrwałym przechowywaniu w złożonych pożywkach biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowania lab-on-a-chip (LOC) w badaniach środowiskowych, biomedycznych, rolniczych, biologicznych i kosmicznych wymagają elektrody jonoselektywnej (ISE), która wytrzyma długotrwałe przechowywanie w złożonych podłożach biologicznych 1-4. Elektroda jonoselektywna w stanie stałym (ASSISE) jest szczególnie atrakcyjna dla wyżej wymienionych zastosowań. Elektroda powinna charakteryzować się następującymi korzystnymi cechami: łatwą konstrukcją, niskimi kosztami utrzymania i (potencjałem) miniaturyzacji, co pozwoli na przetwarzanie wsadowe. Skonstruowano mikrofabrykowany ASSISE przeznaczony do ilościowego oznaczania jonów H+, Ca2+ i CO32-. Składa się z warstwy elektrody z metalu szlachetnego (tj. Pt), warstwy transdukcyjnej i warstwy membrany jonoselektywnej (ISM). Warstwa transdukcyjna służy do przekształcania zależnego od stężenia potencjału chemicznego membrany jonoselektywnej w mierzalny sygnał elektryczny.

Stwierdzono, że żywotność ASSISE zależy od utrzymania potencjału na granicy faz warstwy przewodzącej/membrany 5-7. Aby przedłużyć żywotność ASSISE, a tym samym utrzymać stabilne potencjały w warstwach międzyfazowych, zastosowaliśmy polimer przewodzący (CP) poli(3,4-etylenodioksytiofen) (PEDOT) 7-9 zamiast srebra/chlorku srebra (Ag/AgCl) jako warstwę przetwornika. Zbudowaliśmy ASSISE w formacie lab-on-a-chip, który nazwaliśmy biochipem z wieloma analitami (MAB) (rysunek 1).

Kalibracje w roztworach testowych wykazały, że MAB może monitorować pH (zakres operacyjny pH 4-9), CO32- (zakres pomiarowy 0,01 mM - 1 mM) i Ca2+ (zakres logarytmiczno-liniowy 0,01 mM do 1 mM). MAB dla pH zapewnia reakcję nachylenia zbliżoną do nernstiańskiej po prawie miesięcznym przechowywaniu w pożywce z glonów. Biochipy węglanowe wykazują profil potencjometryczny podobny do konwencjonalnej elektrody jonoselektywnej. Pomiary fizjologiczne wykorzystano do monitorowania aktywności biologicznej systemu modelowego, mikroalgi Chlorella vulgaris.

MAB daje przewagę pod względem rozmiaru, wszechstronności i możliwości multipleksowanego wykrywania analitów, dzięki czemu ma zastosowanie w wielu ograniczonych sytuacjach monitorowania, na Ziemi lub w kosmosie.

Projektowanie biochipów i metody eksperymentalne

Biochip ma wymiary 10 x 11 mm i 9 ASSISE oznaczonych jako elektrody robocze (WEs) i 5 Ag/AgCl elektrod referencyjnych (REs). Każda elektroda robocza (WE) ma średnicę 240 μm i jest równomiernie oddalona o 1,4 mm od RE o średnicy 480 μm. Elektrody te są połączone z elektrostykami o wymiarach 0,5 mm x 0,5 mm. Schemat pokazano na rysunku 2.

Metody cyklicznego woltamperometrii (CV) i osadzania galwanostatycznego są używane do elektropolimeryzacji folii PEDOT przy użyciu podstawki ogniwa C3 firmy Bioanalytical Systems Inc. (BASI) (Rysunek 3). Przeciwjon dla folii PEDOT jest dostosowany do interesującego nas jonu analitowego. PEDOT z przeciwjonem poli(styrenosulfonianu) (PEDOT / PSS) jest stosowany do H+ i CO32-, podczas gdy jeden z siarczanem (dodawany do roztworu jako CaSO4) jest używany do Ca2+. Właściwości elektrochemiczne WE pokrytego PEDOT są analizowane przy użyciu CV w roztworze redoks (tj. 2 mM żelazocyjanku potasu (K3Fe(CN)6)). Na podstawie profilu CV wykorzystano analizę Randlesa-Sevcika do określenia powierzchni efektywnej 10. Powlekanie wirowe przy 1,500 obr./min służy do odlewania membran jonoselektywnych (ISM) o grubości ~2 μm na elektrody robocze MAB (WE).

MAB znajduje się w mikroprzepływowej komorze przepływowej wypełnionej 150 μl objętości medium z glonów; podkładki kontaktowe są elektrycznie podłączone do systemu BASI (Rysunek 4). Aktywność fotosyntetyczna Chlorella vulgaris jest monitorowana w warunkach oświetlenia i ciemności otoczenia.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu do elektropolimeryzacji poli(3,4-etylenodioksytiofen):P oly(4-styrenosulfonianu sodu) (PEDOT:PSS) dla jonów H+ i CO32-

  1. Dodać 70 mg poli(4-styrenosulfonianu sodu) (Na+PSS-) do 10 ml wody dejonizowanej (DI) i mieszać aż do całkowitego rozproszenia (ok. 10 sekund).
  2. Dodać 10,7 μl 3,4-etylenodioksytiofenu (EDOT) do roztworu w 1.1 i wirować aż do całkowitego wymieszania roztworu.

2. Przygotowanie roztworu do elektropolimeryzacji poli(3,4-etylenodioksytiofen):Siarczan wapnia (PEDOT:CaSO4) dla jonów Ca2+

  1. Dodać 136 mg siarczanu wapnia (CaSO4) do 10 ml wody demineralizowanej i odwirować; roztwór nie rozproszy się całkowicie i będzie miał mleczną konsystencję.
  2. Dodać 10,7 μl EDOT do roztworu w 2.1 i wirować aż do całkowitego wymieszania.

3. Elektropolimeryzacja polimeru przewodzącego na bazie PEDOT

  1. Podstawa ogniwa C3 firmy Bioanalytical Systems Inc. (BASI) (rysunek 3) oraz potencjostat/galwanostat EC epsilon są używane do formowania ogniwa elektrochemicznego do elektropolimeryzacji. Umieść roztwór do elektropolimeryzacji EDOT:PSS w ogniwie elektrochemicznym i pęcherzyku azotu na 20 minut, aby usunąć rozpuszczony tlen.
  2. Teraz przypnij gazę platynową w pozycji przeciwelektrody ogniwa elektrochemicznego. Następnie przypnij MAB w pozycji elektrody roboczej ogniwa elektrochemicznego z elektrodami roboczymi skierowanymi w stronę gazy platynowej. Dostosuj głębokość MAB tak, aby tylko okrągłe elektrody były zanurzone w roztworze elektropolimeryzacyjnym PEDOT:PSS. Unikać kontaktu roztworu z kwadratowymi elektroklockami.
  3. Umieść elektrodę BASI nasyconą srebrem/chlorkiem srebra (Ag/AgCl) w pozycji elektrody odniesienia ogniwa elektrochemicznego. Upewnij się, że elektroda referencyjna nie znajduje się pomiędzy elektrodą roboczą a przeciwelektrodą.
  4. Do osadzania PEDOT: PSS: Pęcherzyk ogniwa elektrochemicznego przez 20 minut i użyj potencjostatu EC epsilon/galwanostatu, aby uruchomić pojedynczy cykliczny woltogram od 0 V do 1,1 V z szybkością skanowania 20 mV/s w skali ±100 μA.
  5. Do osadzania PEDOT:CaSO4: Pęcherzykować ogniwo elektrochemiczne przez 20 minut i użyć potencjostatu EC epsilon/galwanostatu do przeprowadzenia chronopotencjometrii przy 814 nA przez 30 minut.

4. Woltamperometria cykliczna koniugatów polimerowych na bazie PEDOT w K3Fe(CN)6

  1. Wykonaj kroki 3.1-3.3 powyżej.
  2. Potencjostat/galwanostat EC epsilon służy do wykonywania pojedynczych cyklicznych woltammogram od -653 mV do 853 mV z różnymi szybkościami skanowania (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV/s w skali ±10 μA.

5. Protokół funkcjonalności powierzchni

  1. Osadzanie koniugatu polimeru przewodzącego specyficznego dla jonów będących przedmiotem zainteresowania, jak w kroku 3.
  2. Zastosuj membranę jonoselektywną, jak w kroku 6.

6. Zastosowanie membrany jonoselektywnej

  1. Wyśrodkuj MAB na uchwycie wirnika próżniowego.
  2. Umieść 100 μl membrany na środku MAB i uruchom.
  3. Membrana jonoselektywna typu spin-coat z powlekarką wirową przy 1 500 obr./min przez 30 sekund z 5-sekundowym stopniem narastania w górę iw dół.
  4. Odkurz wirujący MAB przez 30 minut i piecz frytki w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 20 minut.

7. Kalibracja koniugatu polimeru przewodzącego PEDOT-PSS z membraną jonoselektywną pH i węglanową (CO32-)

  1. Kondycjonować MAB przez noc w 10 μM wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 5 mM chlorku potasu (KCl) w pożywce z algami.
  2. Włóż MAB do uchwytu na chipy mikroprzepływowej komórki przepływowej.
  3. Wstrzyknąć 5 ml roztworu testowego o początkowej wartości pH lub stężeniu (np. pH 4 lub 10 μM dla CO32-). Usuń bąbelki z uchwytu na wióry w komórce przepływowej.
  4. Umieść uchwyt na wióry komory przepływowej na uchwycie elektrycznym komory przepływowej.
  5. Otwórz oprogramowanie EC epsilon i wejdź w tryb potencjału obwodu otwartego (OP). Ustaw czas na 300 min, skalę napięcia na ± 1 V, a częstotliwość odcięcia na 10 kHz i zapisuj wartość co 2 sekundy.
  6. Poczekaj, aż MAB ustabilizuje się (poszukaj płaskiej linii) przed kontynuowaniem procesu kalibracji.
  7. Po ustabilizowaniu MAB przepłukać celę przepływową roztworem testowym i wstrzyknąć następne stężenie do kalibracji (pH 5 lub 25 μM CO32-). Upewnij się, że żadne pęcherzyki nie mogą dostać się do komory przepływowej. Powtórz kroki 7.5 i 7.6 dla stężeń pH 6, 7, 8 i 9 lub CO32- 50, 75, 100, 250, 500, 750 i 1 000 μM.
  8. Po upływie ostatniego stężenia usunąć MAB i wysuszyć powietrzem azotowym.
  9. Umieść MAB z powrotem w świeżym roztworze kondycjonującym do następnego użycia.

8. Kalibracja koniugatu polimeru przewodzącego PEDOT:CaSO4 w CaCl2

  1. Kondycjonować MAB przez noc w 7 ml 0,1 M CaCl2 i 10 μM NaNO3.
  2. Wykonaj czynności podobne do 7.2 - 7.10. W kroku 8.3 zastąpić roztwór testowy węglanowy początkowym stężeniem 0,01 mM CaCl2. Powtórzyć dla roztworu testowego o stężeniach 0,05, 0,1, 0,5, 1 i 10 mM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład wyniku cyklicznego woltammogogramu (CV) PEDOT:PSS i odpowiadającego mu katodowego prądu szczytowego (i p) w porównaniu z szybkością skanowania (v1/2) są pokazane odpowiednio na rysunkach 5a i 5b. PEDOT:CaSO4 przy różnych szybkościach skanowania i jego katodowy prąd szczytowy nie są pokazane. Korzystając z analizy Randlesa-Sevcika 10, stwierdzono, że efektywne powierzchnie stałego kontaktu PEDOT:PSS i PEDOT:CaSO4<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochip MAB składa się z ASSISE, które są zbudowane z ISM na szczycie sprzężonej warstwy transdukcji CP opartej na PEDOT na elektrodzie Pt, której połączenie przekształca interesujące stężenie jonów na mierzalny sygnał elektryczny. Stabilny potencjał elektrody jest definiowany zarówno przez warstwę CP, jak i warstwę ISM. Obie warstwy określają również żywotność MAB oraz jakość (szum, dryft) mierzonego sygnału elektrycznego.

PEDOT jest szczególnie atrakcyjny jako warstwa transdukcyjna zarówno z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Programowi NASA Astrobiology Science and Technology Instrument Development (ASTID) za wsparcie finansowe (granty numery 103498 i 103692), Gale'owi Lockwoodowi z Birck Nantechnology Center na Uniwersytecie Purdue za wireconnection urządzeń MAB oraz Joon Hyeong Park za rysunek CAD komory przepływowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,4-EtylenodioksytiofenSigma-Aldrich483028
Poli(4-styrenosulfonian sodu)Sigma-Aldrich243051
EC epsilon galwanostat/potencjostatBioanalytical Systems Inc.e2P
Nasycona elektroda referencyjna Ag/AgClBioanalytical Systems Inc.MF-2052
Gaza PtAlfa Aesar10283
Żelazocyjanek potasuSigma-AldrichP-8131
Azotan potasuJ.T. Baker3190-01
Wodorowęglan soduMallinckrodt/ Macron7412-12
Węglan soduSigma-AldrichS-7127
Chlorek wapniaJ.T. Baker1311-01
Chlorek potasuSigma-AldrichP9541
Siarczan wapniaSigma-Aldrich237132
C3 stojak na ogniwaBioanalytical Systems Inc.EF-1085
na chip do ogniw przepływowychNiestandardowy, dzięki uprzejmości NASA Ames
elektryczna ogniwa przepływowegoNiestandardowa, dzięki uprzejmości NASA Ames
Tabela 2. Specjalne odczynniki i sprzęt.
Uchwyt Oprawa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Migdalski, J., Bas, B., Blaz, T., Golimowski, J., Lewenstam, A. A Miniaturized and Integrated Galvanic Cell for the Potentiometric Measurement of Ions in Biological Liquids. J. Solid State Electrochem. 13, 149-155 (2009).
  2. Designing a Water-quality Monitor with Ion-selective-electrodes. Buehler, M. G., Kounaves, S. P., Martin, D. P. Proceedings of the IEEE Aerospace Conference, 1, 331-338 (2001).
  3. Adamchuk, V. I., Lund, E. D., Sethuramasamyraja, B., Morgan, M. T., Doberman, A., Marx, D. B. Direct Measurement of Soil Chemical Properties on-the-go using Ion-selective-electrodes. Journal Computers and Electronics in Agriculture. 48 (3), 272-294 (2005).
  4. Oelβner, W., Hermann, S., Kaden, H. Electrochemical Sensors and Sensor Module for Studying Biological Systems in Space Vehicles. Aerospace Science and Technology. 1, 291-296 (1997).
  5. Bobacka, J. Conducting Polymer-based Solid-state Ion-selective Electrodes. Electroanalysis. 18 (1), 7-18 (2006).
  6. Buck, R. Ion Selective Electrodes in Analytical Chemistry. , Plenum Press. New York. (1980).
  7. Nam, H., Cha, G. S. Chapter 18. Biosensors and their Applications. Yang, V. C., Ngo, T. T. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. N.Y. (2000).
  8. Anatova-Ivanova, S., Mattinen, U., Radu, A., Bobacka, J., Lewenstem, A., Migdalski, J., Danielewski, M., Diamond, D. Development of Miniature All-solid-state Potentiometric Sensing System. Sensors and Actuators B. 146, 199-205 (2010).
  9. Michalska, A., Galuszkiewicz, A., Ogonowska, M., Ocypa, M., Maksymiuk, K. PEDOT Films: Multifunctional Membranes for Electrochemical Ion sensing. J. Solid State Electrochem. 8, 381-389 (2004).
  10. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. ed, 2nd , 2nd ed, Wiley. New York. (2000).
  11. Claussen, J. C., Artiles, M. S., McLamore, E. S., Mohanty, S., Shi, J., Rickus, J., Fisher, T. S., Porterfield, D. M. Electrochemical Glutamate Biosensing with Naanocube and Nanosphere Augmented Single-walled Carbon Nanotube Networks: A Comparative Study. J. Mater. Chem. 21, 11224-11231 (2011).
  12. Bobacka, J. Potential Stability of All-solid-state Ion-selective Electrodes using Conducting Polymers as Ion-to-electron Transducers. Anal. Chem. 71, 4932-4937 (1999).
  13. Lee, J. H., Yoon, I. J., Yoo, C. L., Pyun, H. J., Cha, G. S., Nam, H. Potentiometric Evaluation of Solvent Polymeric Carbonate-selective Membranes based on Molecular Tweezer-type Neutral Carriers. Anal. Chem. 72, 4694-4699 (2000).
  14. Song, F., Ha, J., Park, B., Kwak, T. H., Kim, I. T., Nam, H., Cha, G. S. All-solid-state Carbonate Selective Electrode based on a Molecular Tweezer-type Neutral Carrier with Solvent-soluble Conducting Polymer Solid Contact. Talanta. 57, 263-270 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

All solid state Ion selective ElectrodesMulti analyte BiochipIon selective MembranePEDOT Transducer LayerCyclic VoltammetrySpin coatingMicrofluidic Flow cellPhysiological ResearchChlorella vulgarisIon Activity Monitoring

Related Articles