In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Podsumowanie

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

Streszczenie

Niekodujące RNA są dodatkowymi graczami w regulacji ekspresji genów. Ukierunkowana elektroporacja in ovo określonych obszarów stanowi unikalne narzędzie do przestrzennej i czasowej kontroli ektopowej ekspresji mikroRNA. Jednak brzuszne struktury mózgu, takie jak brzuszne śródmózgowie, są raczej trudne do osiągnięcia w celu jakichkolwiek manipulacji. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób elektroportowania miRNA do brzusznego śródmózgowia za pomocą cienkich elektrod platynowych. Metoda ta oferuje niezawodny sposób transfekcji określonych obszarów śródmózgowia i jest użytecznym narzędziem do badań in vivo.

Wprowadzenie

Uznanie małych niekodujących RNA za dodatkowe elementy wpływające na ekspresję genów wprowadziło nową warstwę złożoności do programowania genomowego i regulacji genów. Różne rodzaje niekodujących RNA mają istotne znaczenie funkcjonalne w komórkach nerwowych, w tym małe niekodujące RNA^1-4. MikroRNA (miR lub miRNA) wykazują na przykład wyraźne i zmienne profile ekspresji w rozwijających się mózgach⁵. Celowana elektroporacja in ovo embrionów kurzych stwarza wyjątkową możliwość czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji i wyciszania genów podczas rozwoju.

W niniejszym materiale wideo przedstawiono poszczególne etapy przeprowadzania ekspresji ektopowej miRs w określonych obszarach śródmózgowia kurczaka przy użyciu in ovo elektroporacja^6-10Aby zapewnić długotrwały efekt działania tych małych niekodujących RNA w komórkach, sekwencje DNA miRs sklonowano do wektorów mono- lub bicistronowych. Dla in ovo elektroporacja, wektor zawierający miR jest wstrzykiwany do neuralnej rurki śródmózgowia poprzez odsłonięcie zarodka po wykonaniu małego otworu w skorupce jaja. Aby przeprowadzić transfekcję konkretnych obszarów śródmózgowia, małe elektrody platynowe dodatnie (anoda) i ujemne (katoda) umieszcza się w określonych pozycjach. W przypadku transfekcji brzusznej części śródmózgowia, przed przyłożeniem prądu, anodę umieszcza się pod lewą brzuszną częścią śródmózgowia, a katodę nad prawą połową śródmózgowia. Otwór w skorupce jaja zamyka się taśmą, a zarodki inkubuje się przez czas niezbędny do przeprowadzenia analizy. Metoda ta została pierwotnie opisana przez Muramatsuu. i wsp..⁶ i udoskonalone przez Momose i wsp..⁸ do transfekcji obszarowej.

Przegląd schematu.

1. Zarodek w jajku zostaje odsłonięty poprzez wycięcie małego okna w skorupce.
2. Rozpuszczony wektor (lub wektory) jest wstrzykiwany do śródmózgowia przy użyciu mikrokapilary.
3. Dwie elektrody – umieszczone równolegle lub pod zarodkiem i nad nim – generują impulsowe pole elektryczne.
4. Pole elektryczne tymczasowo tworzy pory w błonie komórkowej, co ułatwia wniknięcie do komórki ujemnie naładowanego DNA (lub RNA) przyciąganego do anody^11,12.

Protokół

1. Wymagania dotyczące elektroporacji in ovo

1. Przygotowanie konstrukcji wektora: Startery sens i antysens miR zaprojektowano zgodnie z instrukcjami firmy Ambion, następnie poddano hybrydyzacji i ligowano do wektora pSilencer U6.1 trawionego enzymami ApaI/EcoRI. Po udanej transformacji wyhodowano jeden z otrzymanych klonów i wyizolowano plazmid pSilencer metodą lizy alkalicznej przy użyciu zestawu do preparacji midi firmy Quiagen.
2. Elektrody: Elektrody można kupić lub łatwo wykonać samodzielnie¹³. Stosujemy własnoręcznie wykonane elektrody z drutu platynowego (Φ = 0,2, 0,25 lub 0,5 mm średnicy), a w niektórych przypadkach, w zależności od obszaru poddawanego elektroporacji, jeszcze cieńsze elektrody z drutu wolframowego (Φ = 0,1 mm)⁸. Aby uniknąć przypalenia tkanki, stosujemy zasadę, że im bliżej tkanki, tym cieńsze powinny być elektrody. Do szerokiej elektroporacji śródmózgowia używamy drutów platynowych o średnicy 0,5 mm, przylutowanych do mosiężnego lub stalowego trzpienia rurkowego i zamocowanych w uchwycie elektrod w odległości 3-5 mm (Rysunek 1). Do elektroporacji specyficznych obszarów stosujemy anody z drutu platynowego 0,25 mm oraz katody z drutu platynowego 0,2 mm lub wolframowego 0,1 mm, w przybliżonej odległości 1 mm lub mniejszej.
3. Roztwory: Należy przygotować następujące roztwory:
   1. Autoklawowany roztwór Ringera dla kurcząt, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, rozpuścić w 1 L wody destylowanej).
   2. PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH₂PO4, 1,44 g Na₂HPO₄, rozpuścić w 1 l destylowanej H₂O).
   3. Fast Green: roztwór stokowy 10 mg/ml w destylowanej H₂O
   4. Atrament wolno schnący (zawierający mniej szelaku, a tym samym mniej toksyczny dla embrionu). Uwaga: niebieski filtr dichroiczny zamocowany do lampy światłowodowej, opisany przez Canto-Solera i Adlera¹⁴, zwiększa kontrast i może wyeliminować konieczność wstrzykiwania atramentu.

Rycina 1. Schemat elektrod i uchwytu elektrod. (A, B, C) Drut platynowy został przylutowany do jednej strony stalowego wału rurkowego. Po drugiej stronie wału rurkowego nawiercono otwór, w którym mieszczą się wtyki pinowe. (A) Do wtyków pinowych podłączono przewody w kolorze czerwonym i niebieskim. Na przeciwległym końcu przewód został dopasowany do wtyków bananowych, które współpracują z gniazdami elektrycznymi elektroporatora. (A, C) Drut platynowy został zgięty pod kątem 90°. Warstwa lakieru do paznokci odizolowała wał powyżej zgięcia.

2. Przygotowania bezpośrednio przed elektroporacją in ovo

1. Przygotować następujące materiały:
   1. Rozcieńczyć Ink w roztworze Ringera dla kurcząt w stosunku 1:6, dodać roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x od Gibco) w stosunku 1:100.
   2. Przygotować roztwór wektora: 1-2 μg/μl konkretnego DNA w H₂O z dodatkiem Fast Green (1:20).
   3. Zisterylizować pęsetę, nożyczki, igłę wolframową i elektrody za pomocą 70% etanolu.
   4. Wytworzyć mikropipety do iniekcji kwasów nukleinowych z kapilar borokrzemianowych (długość do średnicy zewnętrznej: 100 mm x 0.9 mm). Stosujemy prosty wyciągacz PUL-1 (WPI, Berlin) z ustawieniami przedstawionymi w Tabeli 1.
   5. Ustawić parametry elektroporatora zgodnie z Tabelą 2.

Parametry	Wartości
Ciepło	350
Pociągnij	100
Prędkość	50
Opóźnienie	200

Tabela 1. Ustawienia dla PUL-1

Parametry	Wartości
Częstotliwość	50 Hz
Opóźnienie	20 - 50 msec*
Szerokość	20 msec
Napięcie	8-25 V *
Impuls	3 - 5 razy
*W zależności od średnicy i odległości elektrod. Prosimy wziąć to pod uwagę przy zmianie jednego z parametrów.

Tabela 2. Ustawienia stymulatora impulsowego

2. Przygotowanie embrionów kurzych do elektroporacji:
   1. Inkubować zapłodnione jaja kurze ułożone na dłuższym boku w temperaturze 37 °C przy 65% wilgotności przez 39 hr, aby uzyskać embriony w stadium Hamburger & Hamilton (HH)¹⁵ 9-11. Embrion osiada w najwyższej części jaja, dlatego należy go zaznaczyć linią ołówka.
   2. Zdezynfekować jaja 70% etanolem.
   3. Przebić jajko z szerszej strony, w miejscu znajdującej się komory powietrznej.
   4. Usunąć 1-2 ml białka jaja. Pozwoli to oddzielić embrion od skorupki.
   5. Okleić skorupkę taśmą klejącą, aby zapobiec wpadaniu odłamków skorupki na embrion. Za pomocą nożyczek wyciąć w skorupce małe okno wzdłuż linii zaznaczonej ołówkiem.
   6. Wstrzyknąć niewielką ilość tuszu pod area opaca w celu wizualizacji embrionu.
   7. Naciąć błonę witelinową zaostrzoną igłą wolframową, aby zapewnić lepszy dostęp do embrionu podczas wstrzykiwania kwasów nukleinowych i elektroporacji.

3. Elektroporacja i inkubacja

1. Nanieś kilka kropel ciepłego roztworu Ringera na zarodki. Pozwoli to obniżyć pozycję zarodków, zapobiegnie ich przegrzaniu oraz przywieraniu elektrod do tkanek, a także zapewni medium dla prądu między obiema elektrodami.
2. Wstrzyknij roztwór wektora do światła rurki neuralnej na poziomie śródmózgowia. Jeśli wektor ekspresyjny DNA nie zawiera genu reporterowego (np. EGFP), dodaj do roztworu DNA wektor genu reporterowego o nieco niższym stężeniu (1 μg/μl wektora ekspresyjnego miR do 0,9 μg/μl wektora genu reporterowego). Dzięki temu możliwe będzie późniejsze rozpoznanie transfekowanych komórek⁸. Używamy tzw. wektora pCAX, otrzymanego w uprzejmym darze od C. Krull ¹³.
3. Aby przeprowadzić szeroką transfekcję śródmózgowia, umieść elektrody po lewej i prawej stronie zarodka na wysokości śródmózgowia. Odległość między elektrodami powinna wynosić około 3-5 mm. Pozostałe ustawienia dla stadium HH 10 to 15V, impulsy 20 msec i opóźnienie 50 msec. Lekka zmiana położenia obu elektrod wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej (DV) śródmózgowia zapewnia szerszą transfekcję komórek wzdłuż osi DV.
4. W celu transfekcji brzusznej dodaj nieco roztworu Ringera, aby unieść głowę z błony żółtkowej, i umieść anodę pod brzuszną częścią śródmózgowia. Jeśli głowa nie uniesie się, wprowadź elektrodę pod błonę oddzielającą żółtko od zarodka, aby uniknąć przypalenia rurki neuralnej. Katodę należy umieścić nad śródmózgowiem, grzbietowo-bocznie przeciwlegle do anody. Nie dotykaj rurki neuralnej. Transfekujemy lewą brzuszną połowę śródmózgowia, aby uniknąć problemów z rozwojem serca. Odległość między elektrodami wynosi około 1-0,5 mm, a pozostałe ustawienia to 10V, szerokość impulsu 20 msec i opóźnienie 50 msec.
5. Nanieś kolejną kroplę soli fizjologicznej na wierzch zarodków, aby je ochłodzić i usunąć pęcherzyki powietrza.
6. Uszczelnij jaja taśmą i inkubuj przez co najmniej 4 hr; jest to minimalny czas wymagany do ekspresji wektora.

4. Fixacja embrionów kurcz own

1. Wyjąć zarodki z jaj.
2. Oczyścić zarodki pod stereomikroskopem i ocenić zakres transfekcji za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu.
3. Utrwalić zarodki przez noc w 4% PFA w temperaturze 4°C. Przystąpić do sekcjonowania i/lub barwienia (hybrydyzacja in situ, immunohistochemia), aby przeanalizować zmiany w obszarze poddanym transfekcji.

Wyniki

Zakres obszaru śródmózgowia przetransfekowanego miR jest widoczny dzięki ekspresji GFP z wektora reporterowego, który został wstrzyknięty wraz z wektorem wykazującym ekspresję miR (Rysunek 2). Zastosowanie elektrod platynowych o średnicy 0,5 mm, umieszczonych równolegle do osi AP śródmózgowia, zazwyczaj prowadzi do transfekcji szerokiego obszaru wzdłuż osi DV i AP, obejmującego rdzeń przedłużony, śródmózowie i niekiedy wzgórze (Rysunki 2A i B). Rozmiar elektrod skutkuje przyłożeniem szer...

Dyskusja

Ten film pokazuje skuteczną metodę transfekcji plazmidu do komórek neuroepitelialnych określonych obszarów śródmózgowia pisklęcia. Prostokątne impulsy elektryczne o niskim napięciu mogą wprowadzić DNA do komórek cewy nerwowej pisklęcia w ovo^6,16. Jednak dokładność celowania w DNA jest często utrudniona przez szerokie pole elektryczne, które unosi się przez stosunkowo duże elektrody (Φ = 0,5 mm). Próbowaliśmy rozwiązać ten problem, stosując elektrody o mniejszej średnicy, zgodnie z wytycznymi Momose

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Hartenstein		Model: 0,9 mm
Ściągacz do mikrokapilar	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Elektroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomikroskop - fluorescencyjny	LEICA		Model: MZFLIII
Mikroskop stereoskopowy	Zeiss		Model: Stemi
Kamera i oprogramowanie	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8