Opisano nowatorską technikę tworzenia powtarzalnego modelu in vivo uszkodzenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym u myszy. Technika ta opiera się na stabilizacji kręgosłupa poprzez unieruchomienie fasetek szyjnych i uszkodzenie rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza z dokładnością do ±0,01 mm.
Artykuł metodologiczny
Kontrolowane uszkodzenie szyjki macicy u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Użycie genetycznie modyfikowanych myszy poszerza nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kilku zaburzeń neurologicznych, takich jak uraz rdzenia kręgowego (SCI). Ręczna kontrola z wolnej ręki stosowana do tworzenia modelu rany szarpanej SCI powoduje niespójne obrażenia, często związane z komponentem zmiażdżenia lub stłuczenia, dlatego opracowano nową technikę. Nasz model uszkodzenia szyjki macicy SCI rozwiązał nieodłączne trudności związane z metodą odręczną, włączając 1) stabilizację kręgów szyjnych poprzez unieruchomienie fasety kręgu, 2) zwiększoną ekspozycję rdzenia kręgowego oraz 3) stworzenie powtarzalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza z dokładnością do ±0,01 mm głębokości bez związanego z tym stłuczenia. W porównaniu ze standardowymi metodami tworzenia rany szarpanej po SCI, takimi jak odręczne użycie skalpela lub nożyczek, nasza metoda wytworzyła spójną zmianę. Metoda ta jest przydatna w badaniach nad regeneracją aksonów kory mózgowo-rdzeniowej, rubrordzeniowej i grzbietowej drogi wstępującej.
Wprowadzenie
Dostępność genetycznie modyfikowanych myszy jest potężnym narzędziem do identyfikacji efektów działania określonych genów, które odgrywają rolę w mechanizmach SCI. SCI jest ważnym modelem używanym do badania środków terapeutycznych lub molekuł, które mogą zapewnić skuteczne leczenie po tym urazie 8. Unieruchomienie wyrostków kolczystych podczas tworzenia urazu szarpanego u myszy jest nieprecyzyjne ze względu na trudności w uchwyceniu cienkich i delikatnych wyrostków kolczystych związanych z utrzymaniem stabilizacji kręgosłupa 5,11. Zmienność głębokości rany wynosząca zaledwie 0,2 mm (10% średnicy rdzenia kręgowego myszy) powoduje mylącą interpretację danych. Charakter i rozległość uszkodzenia rdzenia kręgowego muszą być dokładnie określone 10. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy nowatorską technikę polegającą na stabilizacji kręgów i użyliśmy spreparowanych ostrzy przymocowanych do Louisville Injury System Apparatus (LISA) w celu wytworzenia rany szarpanej SCI 7,14. Uraz ten powstał przy użyciu ostrego ostrza oscylacyjnego, które pozwoliło uniknąć deformacji tkanki podczas procesu szarpania. Głębokość rany została określona z dokładnością do 0,01 mm dzięki zastosowaniu mikroprzetworników, które kontrolują głębokość skaleczenia. Ostrza tnące są wykonywane na zamówienie pod określone kształty i szerokości, aby stworzyć pożądany kontur rany 9. Pokazujemy: 1) metodę odsłaniania odcinka szyjnego kręgosłupa, 2) technikę stabilizacji kręgów za pomocą obustronnego urządzenia do stabilizacji fasetowej oraz 3) tworzenie uszkodzenia szyjki macicy za pomocą wibrującego ostrza.
Protokół
1. Przygotowanie i zastosowanie stabilizatora kręgosłupa u zwierząt
Kręgosłup szyjny myszy jest wklęsły brzusznie widziany z boku. Wyrostki kolczyste od C3 do T1 są małe i kruche, a zatem nie nadają się do stabilizacji kręgów, jak powszechnie się określa 3,4. Zalecamy, aby stabilizacja kręgosłupa była wykonywana poprzez boczne zespolenie wyrostka. Urządzenie mocujące składa się z metalowego kanału w kształcie litery U, który podtrzymuje mysz i dwóch regulowanych ramion ze stali nierdzewnej, które zaciskają się bocznie na każdym fasetie. Zapewnia to doskonałe unieruchomienie kręgu docelowego. Po ustabilizowaniu kręgosłupa kręgosłup jest lekko uniesiony, aby spłaszczyć krzywiznę kręgosłupa szyjnego, aby zapewnić lepszą ekspozycję rdzenia kręgowego.
- Wysterylizuj następujące narzędzia chirurgiczne: 2-3 pary kleszczy, 2 pary mikronożyczek, igłę 30 G, uchwyt do szwów i igieł, klipsy do skóry i aplikator do klipsów. Zdezynfekuj stabilizator kręgosłupa. Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego koktajlu ketaminy/ksylazyny (100 mg / 10 mg / kg). Zgol włosy z szyi myszy.
- Po oczyszczeniu skóry roztworem jodu powidonu i 70% alkoholem należy przesunąć mysz na stół operacyjny ogrzany poduszką grzewczą. Zakryj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Po indukcji znieczulenia (osiąganej, gdy mysz nie reaguje na uszczypnięcie ogona), wykonaj nacięcie skóry w tylnej linii środkowej szyjki macicy od potylicy do podskórnej poduszeczki tłuszczowej dolnego odcinka szyjnego kręgosłupa. W powiększeniu wykonaj nacięcie w linii środkowej między mięśniami czworobocznymi w C2 i rozdziel mięśnie półrdzeniowe główki. Identyfikacja podmięśniowej poduszeczki tłuszczowej ułatwia rozwarstwienie w odpowiedniej warstwie.
- Rozszerz doogonowo rozwarstwienie mięśni linii środkowej do wyrostka kolczystego T2, który służy jako niezawodny punkt orientacyjny. Przetnij mięśnie przyczepione do kręgu T2 i usuń chrzęstną część wyrostka kolczystego T2.
- Wypreparuj mięśnie przykręgosłupowe od C2 przez blaszki T2 za pomocą mikronożyczek. Rozwarstwienie mięśni rozpoczyna się w sąsiedztwie wyrostków kolczystych i rozciąga się obustronnie do stawów międzywyrostkowych. Oddziel mięśnie bezpośrednio przylegające do wyrostków kolczystych i blaszek (w warstwie okostnej), aby zminimalizować krwawienie. Po odsłonięciu bocznych fasetek umieść mysz na kanale w kształcie litery U stolika LISA.
- Przymocuj ramiona ze stali nierdzewnej pod odsłoniętymi fasetami dwustronnie. Gdy ramiona znajdą się na miejscu, dokręć skrzydełkowe stalowych ramion, aby unieruchomić kręgosłup. Utrzymuje to mocne mocowanie kręgu docelowego i zapewnia doskonałą ekspozycję. Ramiona można regulować, aby zapewnić precyzyjną orientację poziomą kręgosłupa.
- Naciąć więzadło żółte między C5 i C6, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Pomiędzy przestrzenią międzywarstwową użyj igły 30 G, aby utworzyć małą durotomię, przez którą umieszcza się mikronożyczki w celu przedłużenia durotomii. Rdzeń kręgowy jest teraz przygotowany do poddania się kontrolowanej zmianie szarpanej.
2. Uszkodzenie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym za pomocą urządzenia LISA
- Szerokość powiększenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym różni się na różnych poziomach. Wykonaj zmianę półwyciętą grzbietu w C5-6 za pomocą płaskiego ostrza 2,3 mm i ustaw amplitudę drgań tak, aby obejmowała całą szerokość rdzenia kręgowego. Ostrza są pozyskiwane od Fine Science Tools Inc. (Foster City, Kalifornia) i modyfikowane pod kątem uszkodzenia rdzenia kręgowego. Utrzymuj amplitudę oscylacji ostrza na poziomie ≥ 0.5 mm, ponieważ niższe poziomy amplitudy zmniejszą łatwość skaleczenia sznurka.
- Ustaw stabilizator kręgosłupa i mysz na stoliku LISA. Ostrze jest przymocowane do LISA, a jego położenie jest kontrolowane przez mikrosterowniki zdolne do trzech zakresów ruchu. Elementy składowe LISA i ich funkcje opisano na rysunku 1.
- Włącz przełącznik wibracyjny ostrza. W powiększeniu przesuń mysz tak, aby odsłonięty rdzeń kręgowy znajdował się bezpośrednio pod wibrującym ostrzem.
- Podnieś stolik podpierający mysz w kierunku ostrza oscylacyjnego. Pozycja "0" jest rejestrowana, gdy ostrze ledwo dotyka żyły grzbietowej rdzenia kręgowego. Zmierz głębokość uszkodzenia rdzenia kręgowego w stosunku do pozycji "0".
- Podnieś pozycję sceny za pomocą sterowania mikrosterownikiem: obrót pokrętła mikroprzetwornika o 360° podnosi scenę o 0,25 mm. W ten sposób zmiana połowicza grzbietowego o średnicy 0,75 mm powstaje poprzez 3-krotne przekręcenie pokrętła mikroprzetwornika. Dokładność zmiany wynosi ± 0,01 mm. Gdy ostrze zacznie ranić rdzeń kręgowy, nasmaruj pole operacyjne irygacją soli fizjologicznej. Głębokość cięcia rdzenia kręgowego jest kontrolowana przez pionowy mikrosterownik i jest niezależna od wskazówek wizualnych.
- Po osiągnięciu ustalonej głębokości wyłącz przełącznik wibracyjny. Idealnie byłoby, gdyby oscylujące ostrze było umieszczone w szczelinie zmiany chorobowej bez oznak deformacji tkanki. Opuść stolik z ostrza tnącego i usuń krew i sól fizjologiczną z pola operacyjnego za pomocą bawełnianych patyczków higienicznych. Hemostaza występuje samoistnie w ciągu < 1 min.
- Zdejmij mysz ze stabilizatora kręgosłupa. Przybliż mięśnie przykręgosłupowe za pomocą jedwabnego szwu 6-0 i zamknij ranę skóry za pomocą klipsów Michela ze stali nierdzewnej.
3. Opieka nad zwierzętami
- Podskórnie wstrzyknij łącznie 1-2 ml soli fizjologicznej, aby utrzymać odpowiednie nawodnienie i umieść mysz w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej podczas odzyskiwania przytomności.
- Dostarczaj wodę i miękkie pokarmy ad lib i podawaj leki przeciwbólowe przez 48 godzin po operacji. Nie ma potrzeby pielęgnacji pęcherza moczowego po grzbietowej półsekcji rdzenia kręgowego.
Wyniki
Unieruchomienie docelowego kręgu ma kluczowe znaczenie dla wygenerowania precyzyjnych uszkodzeń rdzenia kręgowego myszy. Nasze urządzenie do stabilizacji kręgosłupa rozwiązuje problemy anatomiczne związane z krótkimi wyrostkami kolczystymi i lordozą brzuchną szyjnego odcinka kręgosłupa myszy. Kręgi szyjne są dobrze wyeksponowane dzięki zastosowaniu naszego stabilizatora kręgosłupa szyjnego (Rycina 2). Nasze urządzenie do stabilizacji kręgosłupa myszy jest niezawodną techniką przygotowania kręgosłupa do zabiegów w obrębie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym. Głębokość uszkodzenia przy użyciu LISA jest dokładna do 0,01 mm 6,13. Precyzyjne nacięcie nie powoduje stłuczenia na styku uszkodzenia i tkanki (Rycina 3). Precyzja uszkodzeń w formie grzbietowej hemisekcji została wykazana u myszy C57BL/6 w badaniu nad regeneracją aksonów, w którym nacięcie o głębokości 0,9 mm przechodziło tuż poza kanał centralny w każdym preparacie, co potwierdzono w przekrojach patomorfologicznych rdzenia kręgowego 1. U wszystkich tych zwierząt odzyskano zdolność lokomocyjną po tym urazie nacięcia rdzenia kręgowego.
Rycina 1. (A) Mysz w stabilizatorze kręgosłupa umieszczona na platformie LISA. Wibracyjne ostrze jest skierowane w stronę rdzenia kręgowego, który ma zostać nacięty. Sterowniki mikropopychacza znajdują się pod platformą i służą do pozycjonowania myszy w odpowiednim miejscu. Pionowy mikropopychacz kontroluje głębokość uszkodzenia, a pokrętło nachylenia kontroluje płaszczyznę poziomą rdzenia kręgowego, aby zapobiec kątowaniu nacięcia. Przełącznik włącz/wyłącz steruje silnikiem wibracyjnym, a kolejne pokrętło reguluje jego amplitudę. (B) Lesja w postaci nacięcia grzbietowej hemisekcji o szerokości 0,75 mm wykonana pod nienaruszonymi łukami blaszkowymi.
Rysunek 2. (A) Stabilizator kręgosłupa myszy składający się z kanału w kształcie litery U oraz dwóch ramion i łączników. Mysz jest umieszczana w rynnie C stosowanej przy urazach rdzenia kręgowego (SCI) w odcinku szyjnym oraz w rynnie T przy urazach SCI w odcinku piersiowym. (B) Odcinek szyjny kręgosłupa zostaje unieruchomiony poprzez umieszczenie ramion pod wyrostkami bocznymi, a następnie zablokowanie śrub motylkowych. Opona twarda zostaje odsłonięta pomiędzy blaszkami C5-6, C6-7 i C7-T1 bez usuwania tkanki kostnej.
Rycina 3. Cztery nacięcia grzbietowej części rdzenia kręgowego na głębokościach 0,5, 0,8, 1,1 i 1,4 mm obserwowane w widoku strzałkowym (barwienie fioletem krezylem i eozyną), obrazujące wysoki stopień precyzji zastosowania tej techniki.
Dyskusja
Stabilizację kręgów przed urazami rdzenia kręgowego uzyskuje się poprzez unieruchomienie wyrostków kolczystych. Zarówno krzywa lordotyczna kręgosłupa szyjnego, jak i przymocowanie klamer do kruchych krótkich wyrostków kolczystych szyjnych od C3 do T1 u myszy uniemożliwiają skuteczną stabilizację kręgosłupa. Ponadto użycie żyletki lub mikronożyczek używanych pod kontrolą ręczną powoduje znaczną deformację tkanki, która powoduje zmienność głębokości zmiany 6. Może to prowadzić do błędnej interpretacji danych, szczególnie gdy badana jest regeneracja aksonów określonych szlaków. Na przykład oszczędzone aksony grzbietowo-rdzeniowe mogą być błędnie interpretowane jako zregenerowane aksony, jeśli grzbietowy odcinek korowo-rdzeniowy nie był całkowicie przecięty w momencie uszkodzenia. Wyzwania te można przezwyciężyć poprzez zastosowanie urządzenia do stabilizacji kręgosłupa z mocowaniem do fasetek na jednym poziomie i precyzyjnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Dodatkowo, użycie ostrza oscylacyjnego o wysokiej częstotliwości powoduje ostre skaleczenie bez miażdżenia lub kontuzjowania sąsiedniego rdzenia kręgowego. Metoda ta została wykorzystana do wywołania uszkodzeń rdzenia kręgowego u szczurów 9,12,14, z późniejszymi modyfikacjami w celu wytworzenia uszkodzeń rdzenia kręgowego w klatce piersiowej u myszy 6. W niniejszym komunikacie opisujemy metodę tworzenia wiarygodnych zmian szarpanych szyjki macicy u myszy.
O ile przednio-tylna średnica rdzenia kręgowego wynosi <2 mm u myszy, dokładne głębokości uszkodzenia szarpanego mają kluczowe znaczenie dla stworzenia wiarygodnego modelu eksperymentalnego. Minimalna zmienność głębokości zmiany znacząco wpłynie na wyniki eksperymentów oceniających regenerację aksonów, a także badań wolumetrycznych i behawioralnych. Dokładność głębokości zmiany przy użyciu tej metody wynosi ± 0,01 mm, ponieważ użyliśmy bardzo precyzyjnych mikroprzetworników do kontrolowania położenia ostrza tnącego. Metoda ta zmniejszyła niespójność nieodłącznie związaną z innymi modelami tworzenia SCI rany szarpanej. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniu regeneracji aksonów długich ścieżek rdzenia kręgowego znajdujących się w grzbietowej połowie rdzenia kręgowego, takich jak droga korowo-rdzeniowa, droga rubrordzeniowa i grzbietowa droga wstępująca. Dzięki tej metodzie te szlaki światłowodowe mogą być całkowicie i niezawodnie transektowane. W związku z tym błędy interpretacji danych są zminimalizowane, co poprawia wiarygodność raportowania badań eksperymentalnych dotyczących SCI.
Podsumowując, opisaliśmy nowatorską technikę tworzenia powtarzalnego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym u myszy in vivo . Technika ta opiera się na stabilizacji kręgosłupa poprzez unieruchomienie fasetek szyjnych i uszkodzenie rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza. Stosując tę metodę w modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w klatce piersiowej grzbietowej u myszy 6, wykazaliśmy ścisłą korelację między głębokością rany szarpanej, histologią i odzyskiwaniem zachowania. Taka technika została również uznana za niezawodną przez kilka innych laboratoriów 2,12.
Oświadczenia
- Kilku autorów (YPZ, XMX, CBS) ma finansowe udziały w Louisville Impactor System, Inc.
- Autorzy, Yi Ping Zhang, Lisa B. E. Shields i Christopher B. Shields, są pracownikami Norton Healthcare, Louisville, KY. Inni autorzy są zatrudnieni przez Indiana University, Indianapolis, IN.
- Autorzy nie otrzymali dofinansowania od żadnej firmy produkującej odczynniki lub instrumenty wykorzystane w tym artykule.
Podziękowania
Rozwój tego urządzenia był wspierany przez LISA Co., Louisville, Kentucky. Doceniamy również ciągłe wsparcie Norton Healthcare, Louisville, KY dla CBS oraz NIH NS050243, NS052290 i NS059622 dla XMX.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stabilizator kręgów myszy | impektorowy Louisville Ustabilizuj | i odsłoń kręg szyjny | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Spowodowaj uraz szarpany rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Nacięcie mięśnia czworobocznego i czworobocznego |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Oddziel mięśnie od blaszek |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Nacięcie opony twardej |
| Kleszcze Graefe | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Wycofaj skórę |
| Kleszcze Dumont #7 | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Retrakcja mięśni (zmodyfikowana końcówka)(Rys. A) |
| Kleszcze Dumont SS | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Mocowanie kręgu (zmodyfikowana końcówka) (Ryc.B) |
| Igła 30G | Becton Dickenson | 305106 | Stwórz otwór opony twardej |
| 6-0 szew | Ethicon | 8806H | Zamknij warstwy mięśni i powięzi |
| klips do ran | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Zamknięcie skóry |
| Tribrom– thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Środek znieczulający |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (Stany Zjednoczone), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com | |||
| Figure A to zmodyfikowane kleszcze Dumont #7; B to zmodyfikowane kleszcze Dumont SS. |
Bibliografia
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348(2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517(2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430(2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141(2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1(2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853(2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225(2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25(2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449(2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337(2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261(2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38(2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343(2004).
Przedruki i uprawnienia
