$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Narządy wewnętrzne, takie jak serce, mózg i jelita, mają asymetrie lewo-prawo (LR), które są krytyczne dla ich normalnych funkcji1. Ruchome rzęski biorą udział w tworzeniu asymetrii LR w zarodkach kręgowców, w tym myszy, żab i danio pręgowanych2-6. Te "rzęski LR" generują asymetryczny przepływ płynu, który jest niezbędny do wyzwolenia konserwatywnej kaskady sygnalizacyjnej asymetrycznych węzłów (nadrodziny TGF-β) w mezodermie lewej płytki bocznej, która, jak się uważa, dostarcza informacji o wzorcu LR dla rozwijających się narządów7. Dlatego, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wzorców LR, konieczne jest zidentyfikowanie genów, które regulują organizację komórek rzęskowych LR, ruchliwość i długość rzęsek LR oraz ich zdolność do generowania silnego asymetrycznego przepływu.
W zarodku danio pręgowanego, rzęski LR znajdują się w pęcherzyku Kupffera (KV)2,4,5. KV składa się z pojedynczej warstwy monorzęskowych komórek nabłonka, które otaczają światło wypełnione płynem. Mapowanie losu wykazało, że KV pochodzi z grupy ~ 20-30 komórek znanych jako grzbietowe komórki prekursorskie (DFC), które migrują na grzbietowym brzegu blastodermy podczas etapów epibolii8,9. We wczesnych stadiach somitowych DFC grupują się i różnicują w rzęskowe komórki nabłonkowe, tworząc KV w pąku ogonowym zarodka10,11. Zdolność do identyfikacji i śledzenia DFC - w połączeniu z przezroczystością optyczną i szybkim rozwojem zarodka danio pręgowanego - sprawia, że danio pręgowany KV jest doskonałym systemem modelowym do badania komórek rzęskowych LR.
Co ciekawe, przodkowie linii komórkowej DFC/KV zachowują mostki cytoplazmatyczne między komórką żółtka do 4 godzin po zapłodnieniu (hpf), podczas gdy mostki cytoplazmatyczne między komórką żółtka a innymi komórkami embrionalnymi zamykają się po 2 hpf8. Wykorzystując te mosty cytoplazmatyczne, opracowaliśmy specyficzną dla etapu strategię wstrzykiwania, aby dostarczyć oligonukleotydy morfolino (MO) wyłącznie do DFC i wyłączyć funkcję docelowego genu w tych komórkach12. Technika ta tworzy chimeryczne zarodki, w których funkcja genu jest zaburzona w linii DFC/KV rozwijającej się w kontekście zarodka typu dzikiego. Aby przeanalizować asymetryczny przepływ płynu w KV, wstrzykujemy mikrogranulki fluorescencyjne do światła KV i rejestrujemy ruch kulek za pomocą wideomikroskopii2. Przepływ płynu jest łatwy do wizualizacji i można go określić ilościowo, śledząc przemieszczenie ściegu w czasie.
Tutaj, korzystając z techniki eliminacji genów ukierunkowanej na DFC i wstrzykiwania fluorescencyjnych mikrogranulek do KV w celu wizualizacji przepływu, prezentujemy protokół, który zapewnia skuteczne podejście do scharakteryzowania roli konkretnego genu podczas rozwoju i funkcji KV.