Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Podsumowanie

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI ¹.

Streszczenie

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), która obrazuje produkcję cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta umożliwia zliczanie ilości cząsteczek białka wytworzonych w jednej komórce w sekwencyjnych, pięciominutowych oknach czasowych. Wymaga mikroskopu fluorescencyjnego o gęstości mocy wzbudzenia laserowego od ~0,5 do 1 kW/^cm2, który jest wystarczająco czuły, aby wykryć pojedyncze cząsteczki białka fluorescencyjnego w żywych komórkach. Reporter fluorescencyjny stosowany w tej metodzie składa się z trzech części: sekwencji celującej w błonę, szybko dojrzewającego, żółtego białka fluorescencyjnego oraz sekwencji rozpoznawania proteazy. Reporter jest translacyjnie połączony z N-końcem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Komórki są hodowane na stoliku mikroskopowym o kontrolowanej temperaturze. Co pięć minut cząsteczki fluorescencyjne w komórkach są obrazowane (a następnie zliczane przez analizę obrazów fluorescencyjnych), a następnie fotowybielane, tak aby w następnym pomiarze zliczane były tylko nowo translowane białka.

Obrazy fluorescencyjne wynikające z tej metody mogą być analizowane poprzez wykrywanie plamek fluorescencyjnych na każdym obrazie, przypisywanie ich do poszczególnych komórek, a następnie przypisywanie komórek do linii komórkowych. Liczbę białek wytworzonych w oknie czasowym w danej komórce oblicza się, dzieląc zintegrowaną intensywność fluorescencji plamek przez średnią intensywność pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. Użyliśmy tej metody do pomiaru poziomów ekspresji w zakresie 0-45 cząsteczek w pojedynczych 5-minutowych oknach czasowych. Metoda ta umożliwiła nam zmierzenie szumu w ekspresji represora λ CI i ma wiele innych potencjalnych zastosowań w biologii systemów.

Protokół

1. Przepływ pracy w inżynierii odkształceń

1. Wstawić sekwencje kodujące (a) sekwencję lokalizacji błony, (b) szybko dojrzewające białko fluorescencyjne i (c) sekwencję rozpoznawania proteazy N-końcową do i w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (np. czynnikiem transkrypcyjnym). Użyliśmy ukierunkowanego na błonę reportera Tsr-Venus ² i połączyliśmy go z sekwencją rozpoznawania proteazy ubikwityną (Ub), aby policzyć liczbę eksprymowanych cząsteczek białka CI represora bakteriofagów λ. Szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób skonstruowaliśmy białko fuzyjne Tsr-Venus-Ub-CI, zastępując region kodujący CI typu dzikiego i włączając konstrukt do chromosomu E. coli za pomocą rekombinacji λ Red ³, opisano szczegółowo w odnośniku 1.
2. Sprawdź wszystkie modyfikacje przez sekwencjonowanie.
3. Przekształć plazmid kodujący proteazę specyficzną dla sekwencji rozpoznawania użytej powyżej w szczep wyrażający fluorescencyjny reporter i białko będące przedmiotem zainteresowania w fuzji translacyjnej. Użyliśmy proteazy Ubp1, która rozszczepia się natychmiast po C-końcowej reszcie ubikwityny ⁴.

2. Hodowla komórek i przygotowanie próbki

1. Wybierz jedną interesującą kolonię E. coli ze świeżo pokrytej płytki agarowej do 1 ml minimalnej pożywki ^{M9 5} uzupełnionej 1X aminokwasami MEM i odpowiednimi antybiotykami. Inkubować w wytrząsarce w żądanej temperaturze wystarczająco długo, aby osiągnąć OD₆₀₀ > 1,0 (gęstość optyczna przy 600 nm).
2. Rozcieńczyć kulturę w 1 ml świeżej pożywki M9 odpowiednimi antybiotykami do OD₆₀₀ = 0,02. Inkubować w wytrząsarce w odpowiedniej temperaturze. Początkową gęstość komórkową można zwiększyć, jeśli jest to konieczne do wzrostu w niskiej temperaturze.
3. Gdy OD₆₀₀ = 0,2-0,3 (w 37 °C z początkową hodowlą komórkową w OD₆₀₀ = 0,02, zajmie to 3-4 godziny), zacznij przygotowywać podkładkę z żelu agarozowego (krok 3).
4. Komórki są gotowe do obrazowania, gdy OD₆₀₀ = 0,3-0,4.
5. Przenieść 1 ml inkubowanej kultury do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce stołowej.
6. Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml świeżej pożywki M9 i delikatnie zawiesić osad.
7. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
8. Powtórz kroki 1.6 i 1.7. Odrzucić supernatant.
9. Delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml pożywki M9. Komórki mogą być bezpośrednio używane do obrazowania mikroskopowego lub rozcieńczane od 10 do 100 razy, aby zapewnić niską gęstość komórek do obrazowania poklatkowego. Należy pamiętać, że niskie gęstości komórek są ważne w przypadku rozszerzonego obrazowania poklatkowego. Komora obrazowania (krok 4) jest uszczelniona podczas eksperymentu. Ze względu na wykładniczy wzrost komórek, wysokie początkowe stężenia komórek mogą znacznie zubożyć tlen w komorze po długotrwałym wzroście w podkładce żelowej, zmniejszając dojrzewanie białek fluorescencyjnych i wpływając na wzrost komórek.

3. Przygotuj roztwór agarozy

1. Odważyć 10-20 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.
2. Dodaj odpowiednią objętość minimalnej pożywki M9 bez antybiotyków, aby uzyskać 3% roztwór agarozy.
3. Podgrzewać roztwór agarozy przez 30 minut w temperaturze 70 °C do stopienia, odwracając probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest całkowicie stopiony i jednorodny. W tym momencie można wylać wkładkę żelową (krok 4) lub obniżyć temperaturę do 50 °C i trzymać przez kilka godzin do późniejszego użycia.

4. Przygotuj podkładkę żelową na komorze

1. Około 50 minut przed obrazowaniem spłucz zjeżdżalnię Microaqueduct wodą.
2. Opłucz jedną oczyszczoną szklankę nakrywkową (przy użyciu rygorystycznej metody czyszczenia, takiej jak opisana w ^{punkcie 6}) i szkiełko Microaqueduct sterylną wodą i wysusz, przedmuchując sprężonym powietrzem.
3. Umieść gumową uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakrywała wloty i wyloty po szklanej stronie zjeżdżalni mikroakweduktu (można ją zmodyfikować w przypadku zastosowań, w których media są przepuszczane przez próbkę). Nałóż 50 μl roztworu agarozy (krok 3) na środek zjeżdżalni mikroakweduktu.
4. Na wierzch roztworu agarozy wyczyszczoną, suchą szklanką nakrywkową.
5. Pozostaw roztwór agarozy w temperaturze pokojowej na 30 minut.
6. W międzyczasie przygotuj próbkę komórki (krok 2).
7. Ostrożnie zdejmij szklankę nakrywkową z górnej części podkładki żelowej. Dodaj 1,0 μl przemytej kultury komórkowej na wierzch podkładki żelowej. Odczekaj ~2 min, aż kultura zostanie wchłonięta przez podkładkę żelową. Ważne jest, aby nie czekać tak długo, aby podkładka żelowa wyschła, ale wystarczająco długo, aby komórki prawidłowo przylegały do podkładki żelowej. Idealny czas oczekiwania będzie się różnić w zależności od temperatury i wilgotności.
8. Czekając, wysusz kolejną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową.
9. Przykryj próbkę nową szklaną pokrywą, upewniając się, że szkło nakrywkowe i suwak mikroakweduktu są dobrze wyrównane.
10. Zmontuj komorę wzrostu z kontrolowaną temperaturą zgodnie z instrukcjami producenta. Można go teraz używać do obrazowania pod mikroskopem (krok 5).

5. Obrazowanie i pozyskiwanie filmów poklatkowych

1. Włącz laser i mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta (np. laser może wymagać rozgrzania przez ~0.5 godziny przed eksperymentem).
2. Zablokuj zmontowaną komorę do stage wkładka mikroskopu. Ustawić temperaturę komory wzrostowej i grzałki obiektywu na 37 °C lub inną żądaną temperaturę wzrostu.
3. W przypadku obrazowania powyżej temperatury pokojowej ostrość lub podkładka żelowa zwykle znacznie dryfują przez ~15 minut po początkowej zmianie temperatury. W praktyce wykorzystaj ten czas na znalezienie interesujących obszarów i zmodyfikowanie skryptów obrazowania zgodnie z potrzebami eksperymentu.
4. Znajdź komórki w mikroskopie i zapisz pozycję każdej komórki po wyśrodkowaniu jej w predefiniowanym i wyrównanym regionie obrazowania. W każdym oknie czasu pozyskiwania obrazu można obrazować więcej niż jedną komórkę. W przypadku obrazowania poklatkowego przez wiele pokoleń należy upewnić się, że obrazowane komórki są początkowo oddzielone od innych komórek o co najmniej kilkaset μm, aby inne kolonie nie weszły do obszaru obrazowania podczas wzrostu.
5. Dostosuj intensywność wzbudzenia lasera tak, aby prawie wszystkie cząsteczki fluorescencyjne uległy fotowybielaniu w ciągu 6 ekspozycji (ryc. 5).
6. Korzystając z automatycznego skryptu/dziennika obrazowania, uzyskaj dane poklatkowe przy użyciu algorytmu opisanego w eksperymentalnym przepływie pracy na rysunku 3.

Wyniki

Typowe wyniki eksperymentu CoTrAC śledzącego produkcję represora λ CI są pokazane na rysunkach 4 i 5. W tym eksperymencie 12 kolonii obrazowano w odstępach 5-minutowych. W każdym punkcie czasowym kolonia była najpierw automatycznie ogniskowana i centralizowana w regionie obrazowania. Następnie zapisano wyśrodkowaną/zogniskowaną pozycję i uzyskano obraz w jasnym polu. Stolik został następnie przemieszczony o ~0,5 μm wzdłuż osi z, aby przesunąć się z płaszczyzny ogniskowej jasnego pola do ...

Dyskusja

Metodę CoTrAC można uogólnić w celu pomiaru produkcji innych białek, w przypadku których konwencjonalne N- lub C-końcowe fuzje białek fluorescencyjnych mogą zakłócać aktywność białek. Strategia CoTrAC ma trzy unikalne zalety w porównaniu z obecnymi metodami. Po pierwsze, fuzja kotranslacyjna zapewnia, że dla każdej cząsteczki białka będącego przedmiotem zainteresowania wytwarzana jest jedna cząsteczka reportera fluorescencyjnego, co umożliwia dokładne zliczanie produkcji białka w czasie rzeczywistym. Po drugie, ukierunko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza (niska temperatura topnienia)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5× Sole			Zgodnie z przepisem opisanym w 9
20% glukozy
MgSO4
CaCl2
50× Roztwór aminokwasów MEM	Invitrogen	11130-051
Komora wzrostowa z kontrolowaną temperaturą Adapter stolika	Bioptechs	FCS-2
Podgrzewacz obiektywu	Bioptechs	Model zależy od obiektywu
Zjeżdżalnia mikroakweduktu	Bioptechs	130119-5
Mikro okulary nakrywkowe	VWR	40CIR-1	Może być trudny do pozyskania; dostępne również w Bioptechs
Szkło osłonowe/uszczelka przesuwna	Bioptechs	FCS2 0,75 mm
	Różne	Przykładowa konfiguracja: Koherentny laser argono-jonowy Innova 308C, mikroskop Olympus IX-81, obiektyw Olympus PlanApo 100X NA 1.45, oprogramowanie Metamorph	Musi mieć wzbudzenie laserowe, zautomatyzowany stolik xyz, oprogramowanie do automatyzacji zdolne do obrazowania skryptowego i autofokusa, optykę zdolną do rozdzielczości pojedynczej fluorescencji białka Kamera
EM-CCD	Różne	Przykładowa konfiguracja: Andor Ixon DU-898	Musi mieć wystarczająco niski poziom szumów, aby wykryć pojedyncze białka fluorescencyjne powyżej tła