Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele leków celuje w szlaki naprawy DNA i indukuje zabijanie komórek poprzez tworzenie uszkodzeń DNA. W związku z tym procesy bezpośredniego pomiaru uszkodzeń DNA zostały szeroko ocenione. Tradycyjne metody są czasochłonne, kosztowne, zasobochłonne i wymagają replikacji komórek. W przeciwieństwie do tego, test komet, test elektroforezy w żelu jednokomórkowym, jest szybszą, nieinwazyjną, niedrogą, bezpośrednią i czułą miarą uszkodzenia i naprawy DNA. Wszystkie formy uszkodzenia DNA, a także naprawa DNA mogą być wizualizowane na poziomie pojedynczej komórki za pomocą tej potężnej techniki.
Zasada leżąca u podstaw testu komety polega na tym, że nienaruszone DNA jest wysoce uporządkowane, podczas gdy uszkodzenie DNA zakłóca tę organizację. Uszkodzone DNA przenika do matrycy agarozy, a pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane DNA migruje w kierunku katody, która jest naładowana dodatnio. Duże nieuszkodzone nici DNA nie są w stanie migrować daleko od jądra. Uszkodzenie DNA tworzy mniejsze fragmenty DNA, które przemieszczają się dalej niż nienaruszone DNA. Comet Assay, oprogramowanie do analizy obrazu, mierzy i porównuje ogólną intensywność fluorescencji DNA w jądrze z DNA, które wyemigrowało z jądra. Sygnał fluorescencyjny z migrowanego DNA jest proporcjonalny do uszkodzenia DNA. Dłuższy, jaśniejszy ogon DNA oznacza zwiększone uszkodzenia DNA. Niektóre z mierzonych parametrów to moment ogonowy, który jest miarą zarówno ilości DNA, jak i rozmieszczenia DNA w ogonie, długości ogona i procentowej zawartości DNA w ogonie. Ten test pozwala również zmierzyć naprawę DNA, ponieważ ustąpienie uszkodzenia DNA oznacza, że naprawa miała miejsce. Granica czułości wynosi około 50 pęknięć nici na diploidalną komórkę ssaka 1,2. Komórki poddane działaniu jakichkolwiek czynników uszkadzających DNA, takich jak etopozyd, mogą być stosowane jako kontrola pozytywna. Tak więc test kometarny jest szybką i skuteczną procedurą pomiaru uszkodzeń DNA.
Protokół
1. Hodowla komórkowa
- Hodować komórki neuronalne i poddać je niezbędnym zabiegom.
- Zebrać komórki do probówek 15 ml: odessać pożywkę, wypłukać solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS, bez wapnia i magnezu), dodać trypsynę, zebrać do probówek 15 ml i zneutralizować trypsynę odpowiednią pożywką z surowicą.
- Wirować przy 1,000 x g przez 5 min.
- Odessać pożywkę.
- Resuspender komórki w PBS.
- Wirować przy 1,000 x g przez 5 min.
- Odessać pożywkę i resuspender komórki w świeżym PBS.
- Policzyć komórki za pomocą hemacytometru lub preferowanego licznika komórek.
- Próbki komórek należy przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy.
- Wszystkie próbki należy obchodzić w ciemności lub w świetle żółtym, aby zapobiec uszkodzeniom DNA przez światło ultrafioletowe.
2. Test kometowy
1. Przygotowanie preparatu
- Rozpuść 1% agarozę (1 g / 100 ml w 1X Tris Base, Boric acid, EDTA, TBE) w mikrofalówce przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną.
- Zanurz szkiełka w roztopionej agarozie, a następnie przetrzyj krawędź chusteczką Kimwipe. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na powietrzu, aż powstanie przezroczysta warstwa. Czynność tę można wykonać z wyprzedzeniem, a szkiełka mogą być przechowywane.
2. Neutralny test kometowy
- Schłodzić roztwór do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarkozynianu sodio-laurylowego i 1% Triton X-100, pH 10) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 h przed użyciem.
- 2.2.2. Rozpuścić 1% agarozę niskotopliwą (1 g / 100ml w 1X Tris Base, kwas borowy, EDTA) w kuchence mikrofalowej przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną. Agarozę należy schłodzić do 37 °C w kąpieli wodnej, aby uniknąć sztucznego indukowania ogona komety. Idealnie agarozę należy schłodzić przez pół godziny przed użyciem.
- 2.2.3. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową tak, aby uzyskać 100 000 komórek na ml. Połączyć zawiesinę komórkową z agarozą niskotopliwą (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), krótko wymieszać na wortexie i niezwłocznie nanieść 50 μl pipetą na slajd do testu komet. Użyć bocznej ścianki końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową na obszarze próbki. Każda grupa badawcza powinna być wykonana w co najmniej trzech powtórzeniach.
- Umieścić slajdy na płasko w lodówce na 30 min, aż na obwodzie slajdu pojawi się okrąg.
- Wcześniej schłodzony roztwór do lizy przygotować i zanurzyć w nim slajdy na 30 min w ciemności w temperaturze 4 °C (lub w lodówce).
- Odlać lub odessać roztwór do lizy i dodać 1X neutralny bufor do elektroforezy (Tris base, kwas borowy, EDTA, 1X TBE). Pozostawić slajdy w tym buforze przez pół godziny w lodówce.
- Dodać uprzednio schłodzony 1X neutralny bufor do elektroforezy (TBE) do komory elektroforetycznej, a następnie umieścić slajdy w tacy do elektroforezy. Ustawić slajdy tak, aby znajdowały się w równej odległości od elektrod.
- Nalać 1X neutralny bufor do elektroforezy tak, aby poziom cieczy znajdował się 0,2 cala powyżej slajdów. Nadmiar buforu będzie zakłócał przebieg elektroforezy.
- Ustawić napięcie zasilacza na 1 V na cm (mierzone od elektrody do elektrody) i prowadzić proces przez 30 min w temperaturze 4 °C (lub w chłodni) w ciemności.
3. Alkaliczna próba kometowa
- Schłodzić roztwór lizujący (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sodium lauryl sarcosinate i 1% Triton X-100, pH 10) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 h przed użyciem.
- Roztopić 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (1 g / 100 ml w 1X Tris Base, kwas borowy, EDTA) w mikrofalówce przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną. Następnie schłodzić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min.
- Połączyć komórki w stężeniu 1 x 105 / ml z roztopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), krótko wymieszać na wortexie i niezwłocznie nanieść 50 μl na szkiełko do testu Comet. Użyć boku końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową po obszarze próbki. Każda grupa badawcza powinna być wykonana w co najmniej trzech powtórzeniach.
- Umieścić szkiełka płasko w lodówce na 30 min, aż na obrzeżach szkiełka pojawi się okrąg.
- Zanurzyć szkiełka w schłodzonym roztworze lizującym i pozostawić w temperaturze 4 °C od 1 h do całej nocy w ciemności.
- Wyjąć szkiełka z roztworu lizującego, odcedzić i jednokrotnie przepłukać zimnym buforem neutralizującym przez 5 min, aby usunąć pozostałości detergentu i soli przed etapem rozplatania alkalicznego.
- Umieścić szkiełka w komorze do elektroforezy żelowej wypełnionej schłodzonym, świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13), tak aby poziom cieczy nie przekraczał 0,5 cm ponad szkiełkami. Ułożyć szkiełka w taki sposób, aby znajdowały się w równej odległości od elektrod.
- Pozostawić szkiełka w buforze alkalicznym przez 30 min w ciemności, aby umożliwić rozplatanie DNA i ujawnienie uszkodzeń wrażliwych na działanie alkaliów.
- Ustawić napięcie zasilacza na 1 V na cm (mierzone od elektrody do elektrody) i prowadzić elektroforezę przez 30 min w temperaturze 4 °C (lub w chłodni).
4. Fixacja i barwienie komórek
- Odlać nadmiar buforu do elektroforezy
- Zanurzyć preparaty w schłodzonej wodzie destylowanej na 5 min w temperaturze pokojowej.
- Zanurzyć preparaty w schłodzonym 70% etanolu na 5 min w temperaturze pokojowej.
- Suszyć próbki przez noc. Nie wystawiać preparatów na silne światło. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze pokojowej przed oceną.
- Przebarwić preparaty, zanurzając je w Sybr green (rozcieńczonym 1X w PBS) na 20 min w lodówce.
- Wyjąć preparaty i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w ciemności. Agaroza stanie się przezroczysta po całkowitym wyschnięciu.
4. Akwizycja i analiza obrazu
- Nabyć obrazy przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z ustawionym filtrem zielonym (Zeiss AxioVision) i przeanalizować je za pomocą oprogramowania Comet Assay (Perceptive Instruments).
- Kliknąć w „główkę komety” (jądro komórkowe), a oprogramowanie obliczy parametry, w tym średni moment ogona oraz ilość DNA w jądrze.
- Przeanalizować co najmniej 200 komórek dla każdej serii badawczej.
- Wyeksportować dane do programu Microsoft Excel.
- Obliczyć średni moment ogona dla każdej grupy badawczej i przedstawić dane na odpowiednim wykresie.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy testu kometowego na komórkach neuronalnych przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3. W tym przypadku napromieniowanie komórek neuronalnych indukuje uszkodzenia DNA. Pod wpływem pola elektrycznego DNA migruje z różną prędkością ze względu na różnice w wielkości fragmentów, co jest następnie analizowane przy użyciu oprogramowania Comet Assay. Im większe uszkodzenia DNA, tym dalej DNA migruje poza jądro komórkowe. Powoduje to spadek intensywności fluorescencji w jądrze, co jest rejestrowane przez oprogramowanie i skutkuje wyższą wartością momentu ogona. Tabela 1 przedstawia reprezentatywną tabelę z analizy testu kometowego, a Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny wykres porównujący uszkodzenia DNA w komórkach neuronalnych po napromieniowaniu, zmierzone za pomocą testu kometowego.
Rysunek 1. Schemat przebiegu testu kometowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy komórek neuronalnych (A) bez oraz (B) z ogonem komety.
Rycina 3. Analiza testu kometowego przy użyciu oprogramowania Comet Assay. (A) Reprezentatywne zrzuty ekranu obrazów pozyskanych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Carl Zeiss i przeanalizowanych w oprogramowaniu Comet Assay. (B) Kliknięcie w jądro komórkowe lub „główkę komety” (obwiedzione zieloną linią) generuje mapę fluorescencji i wykres (obwiedzione żółtą linią) oraz (C) tabelę danych (obwiedzioną czerwoną linią). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.
Rycina 4. Reprezentatywny wykres przedstawiający średni moment ogona uzyskany w analizie uszkodzeń DNA w napromieniowanych i nienapromieniowanych komórkach neuronalnych z zastosowaniem neutralnego testu kometowego. Zgodnie z oczekiwaniami, promieniowanie 3Gy (promienie rentgenowskie) indukuje uszkodzenia DNA, co przejawia się wyższym średnim momentem ogona w napromieniowanych komórkach neuronalnych. Przedstawiono średni moment ogona (+/- błąd standardowy), **P<0.01.
Tabela 1. Reprezentatywna tabela uzyskana w wyniku analizy testem kometowym na naświetlonych i nienaświetlonych komórkach neuronalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną figurę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test kometarny ma unikalną zdolność analizowania pojedynczych komórek. Jest to korzystne w identyfikacji subpopulacji komórek, które wykazują zróżnicowaną odpowiedź na czynniki cytotoksyczne. Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń praktycznych. Liczba komórek, które można ocenić indywidualnie, może się różnić w zależności od osoby. Wielkość próby należy zwiększyć, jeśli istnieje wariancja uszkodzeń DNA w populacji. Żywotna zawiesina jednokomórkowa ma kluczowe znaczenie dla tego testu, ponieważ dominująca obecność komóre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została wsparta nagrodą IMPACT Award od Departamentu Radioterapii Onkologicznej, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Children's Cancer Foundation oraz Fundacji Gabrielle's Angel (do ESY.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki 1,5 ml | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (zasada Tris, kwas borowy, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| Tubka 15 ml | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agaroza | Sigma | A5093 | |
| Folia aluminiowa | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Zlewka | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Wirówka | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Oprogramowanie do oznaczania komety | komety IV System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Komora do elektroforezy | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Etanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss Axio Vision | Wystarczy dowolny mikroskop fluorescencyjny z zielonym filtrem | |
| Hemacytometr | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Promega | V2111 | |
| Kuchenki | |||
| mikrofaloweSól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez wapnia, bez magnezu | HyClone | SH3025601 | |
| Zasilacz | BioRad | 1645050 | |
| Lodówka | Piec | ||
| Linijka | Zszywki | ||
| Slide Fisher Scientific | 12550143 | ||
| Chlorek sodu | Sigma | S7653 | |
| Sód wodorotlenek | Sigma | S5881 | |
| Lauryl sarkozynian sodu | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr zielony | Invitrogen | S7585 | |
| Taca | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| HyClon | trypsyny | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Kąpiel wodna | Fisher Scientific | 154622Q |
Bibliografia
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
