Artykuł metodologiczny

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

DOI:

10.3791/50053

⸱

19 listopada 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, University of California, Riverside , 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optyczna tomografia koherentna (OCT) to technika obrazowania biomedycznego o wysokiej rozdzielczości przestrzenno-czasowej. Dzięki minimalnie inwazyjnemu podejściu OCT jest szeroko stosowany w okulistyce, dermatologii i gastroenterologii1-3. Korzystając z okienka korowego z cieńszą czaszką (TSCW), wykorzystujemy modalność OCT w domenie spektralnej (SD-OCT) jako narzędzie do obrazowania kory mózgowej in vivo. Powszechnie otwarta czaszka jest używana do obrazowania neurologicznego, ponieważ zapewnia większą wszechstronność, jednak podejście TSCW jest mniej inwazyjne i jest skutecznym środkiem do długoterminowego obrazowania w badaniach neuropatologicznych. W niniejszej pracy przedstawiono metodę tworzenia TSCW w modelu mysim do obrazowania OCT in vivo kory mózgowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu jego wprowadzenia na początku lat 90-tych, OCT jest szeroko stosowany do biologicznego obrazowania struktury i funkcji tkanek2. OCT generuje obrazy przekroju poprzecznego, mierząc opóźnienie czasowe echa światła wstecznie rozproszonego4, wdrażając źródło światła o niskiej koherencji ze światłowodowym interferometrem Michelsona2,4. SD-OCT, znany również jako OCT W DOMENIE FOURIERA (FD-OCT), został po raz pierwszy wprowadzony w 1995 roku5 i oferuje lepszą modalność obrazowania w porównaniu z tradycyjnym OCT W DZIEDZINIE CZASU (TD-OCT). W SD-OCT ramię referencyjne jest utrzymywane nieruchomo, co skutkuje szybką akwizycją obrazu o ultrawysokiej rozdzielczości6-9.

Obecnie, modele TSCW są głównie używane do obrazowania mózgu in vivo w mikroskopii dwufotonowej zamiast tradycyjnej kraniotomii. Te TSCW były używane jednocześnie z niestandardową płytką czaszki lub szklanym szkiełkiem nakrywkowym10-13, aby zapewnić dodatkową stabilność obrazowania. W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że akcesoria takie jak te nie są konieczne do obrazowania OCT, gdy używany jest TSCW. W związku z tym brak płytki czaszki lub szklanych szkiełek nakrywkowych pozwala na szerszy zakres rozmiarów okien obrazowania, ponieważ mogą one zakłócać wiązkę optyczną i zmieniać obrazy OCT.

Preparat z rozrzedzoną czaszką okazał się korzystny w badaniach obrazowych mózgu przy użyciu mikroskopii dwufotonowej10-13. W naszych eksperymentach wykorzystujemy system SD-OCT do obrazowania kory mózgowej in vivo za pomocą TSCW. Nasz niestandardowy zestaw do obrazowania SD-OCT zawiera szerokopasmowe, niskokoherentne źródło światła składające się z dwóch diod superluminescencyjnych (SLD) wyśrodkowanych pod kątem 1295 nm i szerokości pasma 97 nm, co daje rozdzielczość osiową i poprzeczną odpowiednio 8 μm i 20 μm,14. Dzięki naszemu urządzeniu do obrazowania optycznego wyobrażamy sobie, że obrazowanie za pomocą TSCW ma ogromny potencjał w identyfikacji i wizualizacji struktur i funkcji w optycznie gęstej tkance mózgowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. W naszych eksperymentach wykorzystano samice myszy CD 1 w wieku 6-8 tygodni.
  2. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym kombinacji ketaminy i ksylazyny (80 mg/kg ketaminy/10 mg/kg ksylazyny). Umieść mysz na podkładce homeotermicznej, aby zapewnić optymalną temperaturę ciała na poziomie ~37 °C. Stale monitoruj poziom znieczulenia, testując odruchy zwierzęcia (np. szczypanie stopy kleszczami) i w razie potrzeby wstrzyknij więcej znieczulenia.
  3. Nasmaruj oba oczy maścią na sztuczne łzy. Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą maszynki do golenia i usuń resztki włosów za pomocą płatków nasączonych 70% alkoholem. Nałóż cienką warstwę kremu do depilacji Nair na skórę głowy i odczekaj 2 minuty, aż zacznie działać. Delikatnie zetrzyj Naira i pozostałe włosy za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną i wacików nasączonych alkoholem. Skóra głowy powinna być teraz całkowicie pozbawiona włosów.
  4. Zdezynfekuj skórę głowy za pomocą patyczka do wacików z betadyną i wyczyść płatkami przygotowawczymi z 70% etanolu.
  5. Ostrożnie owiń zwierzę w obłożenia chirurgiczne, aby zapewnić optymalną temperaturę ciała ~37 °C i zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, aby unieruchomić czaszkę. Lekko postukaj w czaszkę, aby zapewnić jej stabilność. Wykaz użytych materiałów znajduje się w tabeli 1.

2. Przygotowanie okna korowego z przerzedzoną czaszką

  1. Rozpocznij nacięcie w punkcie linii środkowej między oczami. Kontynuuj doogonowo do punktu linii środkowej między uszami. Rozchyl skórę kleszczami.
  2. Zlokalizuj obszar do przerzedzenia pod mikroskopem preparacyjnym i delikatnie usuń powięź za pomocą pęsety. Osusz czaszkę sterylnymi wacikami przed utworzeniem cienkiego okienka korowego. W naszych eksperymentach stworzyliśmy 4 × 4 mm cieńsze okno czaszki ~1 mm z tyłu i boczne do bregmy.
  3. Rozpocznij przerzedzanie czaszki za pomocą okrągłego wiertła z węglika spiekanego o rozmiarze wiertła 0,75 mm w chirurgicznej wiertarce ręcznej, używając tylko lekkich ruchów zamiatania. Nie wywieraj bezpośredniego nacisku na czaszkę. Przerywaj wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sterylnego soli fizjologicznej i wacików bawełnianych oraz uniknąć przegrzania czaszki. Sól fizjologiczna pomoże również w rozpraszaniu ciepła w całej czaszce.
  4. Gdy zewnętrzna warstwa zwartej kości zostanie całkowicie usunięta, środkowa gąbczasta warstwa kości powinna być teraz widoczna. Może wystąpić niewielkie krwawienie, ponieważ naczynia krwionośne są bardziej widoczne w gąbczastej warstwie kości. Przełącz się na zielony wiertarz kamienny i kontynuuj wiercenie, zachowując szczególną ostrożność, ponieważ gąbczasta warstwa jest delikatniejsza. Zielony kamienny wiertło usunie mniej materiału kostnego, tworząc równość w całym oknie czaszki. Od czasu do czasu przerwij wiercenie, aby usunąć pył kostny i schłodzić czaszkę.
  5. Wreszcie, gdy czaszka stanie się bardziej przezroczysta, a unaczynienie na mózgu będzie teraz widoczne, zacznij polerować czaszkę za pomocą wiertła do polerowania. Pozwoli to na bardziej precyzyjne przerzedzenie przy jednoczesnym wygładzeniu czaszki. Sprawdź cienkość czaszki, delikatnie stukając w nią kleszczami. Przestań polerować, gdy czaszka stanie się lekko elastyczna.
  6. Cieńsze okno czaszki powinno być teraz całkowicie gładkie i odblaskowe oraz gotowe do obrazowania (ryc. 1). Ze względu na charakter silnie rozpraszających się tkanek mózgu, czaszka powinna być rozrzedzona do co najmniej 55 μm, aby uzyskać optymalną penetrację na głębokość. Wykaz użytych materiałów znajduje się w tabeli 1.

3. Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii

  1. Po zakończeniu operacji należy sprawdzić częstość oddechów i odruchy zwierzęcia, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia i w razie potrzeby podać dodatkowe znieczulenie. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej, trzymaj zwierzę owinięte w serwety chirurgiczne i przetransportuj zwierzę do stacji obrazowania.
  2. Przed obrazowaniem sprawdź objawy odruchów i w razie potrzeby zastosuj dodatkowe sztuczne łzy. Zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, aby zabezpieczyć czaszkę.
  3. Umieść zwierzę pod kamerą OCT i umieść TSCW pod wiązką optyczną (rysunek 2). Można teraz zwizualizować przekrój poprzeczny czaszki i mózgu (ryc. 3).
  4. Zbieranie danych można rozpocząć po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania. Do celów obrazowania używamy luster galvo, aby uzyskać okno obrazowania o szerokości 4,0 mm. Uzyskano głębokość obrazowania 2 mm przy mocy padającej 6 mW i ognisku znajdującym się 1 mm poniżej cieńszej czaszki. Każdy obszar przekroju składał się z 2 048 skanów osiowych z szybkością akwizycji 0,14 sekundy na obraz.
  5. Wolumetryczne skany mózgu można również uzyskać, zbierając serię obrazów przekroju poprzecznego 2D przy użyciu dwóch zestawów luster galvo do skanowania x-y, przy czym pierwsze lustro galvo skanuje wiązkę w kierunku strzałkowym, a drugie skanowanie zwierciadła galvo w kierunku koronalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po stworzeniu cieńszego okna nad korą mózgową, układ naczyniowy powinien być teraz bardziej widoczny wizualnie (Rysunek 1) i pozwoli na głębszą głębokość obrazowania (do 1 mm). Prawa kora jest cieńsza do około 55 μm w porównaniu z normalną czaszką mierzoną przy 140 μm (ryc. 1) i zapewnia większą przejrzystość optyczną. Dalsze rozcieńczanie do 10-15 μm jest możliwe11, jednak nie jest to konieczne, ponieważ w naszych eksperymentach nie stosuje się szklanych szkiełek nakrywkowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie za pomocą OCT i rozrzedzonej czaszki jest nowatorską techniką neuroobrazowania, która została zbadana dopiero niedawno15, 16. W naszych eksperymentach wykazaliśmy wykonalność obrazowania SD-OCT za pomocą TSCW w modelu mysim in vivo. Z naszych wyników wynika, że czaszka jest przerzedzona do około 55 μm, a głębokość penetracji uzyskuje się na poziomie około 1 mm przy rozdzielczości obrazu 8 μm i 20 μm odpowiednio w kierunku osiowym i bocznym. W profilu intensywności sygnału, obrazowanie OCT ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant UC Discovery Proof of Concept oraz przez NIH (R00 EB007241). Autorzy chcieliby również podziękować Jacqueline Hubbard za jej pomoc w tym eksperymencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KetaminaPhoenix Pharmaceuticals57319-542-02
KsylazynaAkorn, Inc.139-236
Maść na sztuczne łzyRugby0536-6550-91
NairChurch Dwight Co., Inc.
Sterylna podkładka nasączona alkoholemKendall Healthcare6818
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisherbrand23-400-115
Roztwór betadyny SwabstickPurdue Products67618-153-01
Roztwór soli fizjologicznej, .9%Phoenix Pharmaceuticals57319-555-08
Stereotaktyczne przechowywanie ramek
Szybkobieżna chirurgiczna wiertarka ręcznaForedom38 000 obr./min
Okrągłe wiertło z węglika spiekanegoStoelting0,75 mm
Dura-Green StonesTrzpień Shofu: HP
Kształt: BA1
CompoMaster Coarse & Polerka CompoMasterShofu: Mini-Pt.
SpaceDrapesBraintree Scientific, Inc.
4010130 Kształt

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
  2. Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
  3. Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
  4. Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  5. Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
  6. de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
  7. de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
  8. Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
  9. Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
  10. Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  11. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742(2012).
  12. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
  13. Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).
  14. Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
  15. Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
  16. Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
  17. Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
  18. Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
  19. Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
  20. Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
  21. Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
  22. Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie OCT in vivoOCT w dziedzinie widmowejobrazowanie m zgu w modelu mysimtechnika cie czania czaszkizastosowanie wiert a dentystycznegoobrazowanie w przekroju poprzecznymwolumetryczne skanowanie m zgudiagnostyka zaburze neurologicznych

Powiązane artykuły