Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Ocena wzorca ekspresji genu, jak również właściwości lokalizacji subkomórkowej jego transkrybowanego RNA, są kluczowymi cechami dla zrozumienia jego biologicznej funkcji podczas rozwoju. Hybrydyzacja RNA in situ (RNA-ISH) to potężna metoda stosowana do wizualizacji właściwości dystrybucji RNA, zarówno na poziomie organizmu, komórki, jak i subkomórkowym ¹. RNA-ISH opiera się na hybrydyzacji znakowanej sondy kwasu nukleinowego (np. antysensownego RNA, oligonukleotydów) komplementarnej do sekwencji mRNA lub niekodującego celu RNA będącego przedmiotem zainteresowania ². Ponieważ procedura wymaga samych informacji o sekwencji pierwotnej do wygenerowania sond specyficznych dla sekwencji, może być uniwersalnie stosowana do szerokiego zakresu organizmów i próbek tkanek ³. Rzeczywiście, wdrożono szereg badań ISH na dużą skalę w celu udokumentowania ekspresji genów i dynamiki lokalizacji RNA w różnych organizmach modelowych, co doprowadziło do ustanowienia ważnych zasobów społecznościowych ^4-11. Chociaż na przestrzeni lat opracowano wiele strategii znakowania i wykrywania sond, połączone zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie odczynników detekcyjnych i etapów enzymatycznego wzmacniania sygnału zapewnia znaczne zwiększenie czułości i rozdzielczości procedury ¹². W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) wykorzystującą wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) do wizualizacji ekspresji i dynamiki lokalizacji RNA w stadizowanych zarodkach Drosophila. Procedura przeprowadzana jest w formacie 96-dołkowej płytki PCR, co znacznie ułatwia jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek.

Protokół

1. Przygotowanie sondy RNA

Przegląd: Poniższa sekcja opisuje kroki wymagane do stworzenia sond RNA znakowanych digoksygeniną (Dig) odpowiednich dla FISH. Pierwszy krok polega na klonowaniu lub amplifikacji PCR sekwencji odpowiadającej transkrybowanemu regionowi genu będącego przedmiotem zainteresowania, który zostanie wykorzystany do wygenerowania sondy specyficznej dla sekwencji. Można to osiągnąć, najpierw klonując segment genu do plazmidu, w którym wielokrotne miejsce klonowania jest otoczone elementami promotora bakteriofagów (T7, T3 lub Sp6), które mogą następnie służyć jako matryca do PCR przy użyciu starterów flankujących, które zawierają sekwencje promotorowe, generując w ten sposób liniowy produkt PCR z różnymi sekwencjami promotorowymi na każdym końcu (Figura 1A). Alternatywnie, aby uniknąć etapu klonowania, można również przeprowadzić amplifikację PCR z genomowego DNA lub cDNA przy użyciu oligonukleotydów, które zawierają sekwencje T7, T3 lub Sp6 na ich końcach 5' (np. T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGAGA-3'; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'). Liniowe produkty PCR są następnie wykorzystywane jako matryce do tworzenia sond RNA z sensem lub antysensem znakowanych Dig poprzez spływ transkrypcji in vitro z odpowiednią polimerazą (Figura 1B). Podczas wykonywania sond dla określonych genów zalecamy przygotowanie zarówno sond RNA sensownych, jak i antysensownych przy użyciu odrębnych polimeraz, które będą pomocne w ocenie specyficzności sygnału FISH (tj. jeśli interesujący nas gen nie zostanie przepisany w orientacji antysensownej, sonda sensownego RNA ujawni poziom sygnału tła). We wszystkich poniższych krokach należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć potencjalnej degradacji przez zanieczyszczenie rybonukleaz (RNA), najpierw czyszcząc wszystkie obszary stołu i sprzęt 70% etanolem lub dostępnymi w handlu roztworami do odkażania RNAzy oraz używając materiałów niezawierających RNAzy (np. wody, końcówek, probówek do mikrowirówek).

Materiały

• Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (Abgene, Rochester, NY, USA Kat. Nr 0900)
• Zestawy do ekstrakcji żelu (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada; Kot. Nr 28706).
• Woda wolna od RNA (Bisent, Inc. Kat. Nr 809-115-CL)
• Polimerazy RNA (T7, T3 lub SP6). (20 U/ μl, Fermentas Biosciences. Kot. Nie. EP0101, EP0111, EP0131).
• Inhibitory rybonukleazy RNAse-OUT (40 U/μl), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr 10777-019).
• Mieszaniny nukleotydów digoksygeniny (DIG) (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Kot. Nr 11209256910).

Wyposażenie

• Mikrowirówka stołowa
• Aparatura do elektroforezy żelowej

1. PCR amplifikuje sekwencję specyficzną dla genu z genomowego DNA, cDNA lub plazmidowego DNA w celu wytworzenia liniowego produktu PCR otoczonego sekwencjami promotora bakteriofagów T7, T3 lub Sp6. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi warunków PCR.
2. Sprawdź jakość i rozmiar produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wyciąć i oczyścić produkt PCR za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z zaleceniami producenta i wymyć produkt w 50 μl buforu.
3. Wytrącić produkt PCR, dodając 5 μl octanu sodu 3M (pH 5,2) i 150 μl lodowatego 100% etanolu i umieścić probówki w temperaturze -70 °C na noc. Probówki wirować o sile 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przemyć granulki 70% etanolem. Ponownie zawiruj, usuń wszelkie ślady etanolu i wysusz granulkę na powietrzu. Zawiesić ponownie w 25-50 μl wody wolnej od RNAzy.
4. Transkrybować sondę znakowaną Dig przy użyciu 200-500 ng oczyszczonego produktu PCR w reakcji 20 μl w następujący sposób: 2 μl 10X buforu transkrypcyjnego T7 (Invitrogen), 1 μl (20 U / μl) inhibitora RNAzy, 2 μl mieszaniny Dig-NTP i 2 μl polimerazy T7 RNA (20 U / μl). Doprowadzić ostateczną objętość do 20 μl wodą bez RNAse. Inkubować reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny.
5. Dostosuj mieszaninę transkrypcyjną do 50 μl wodą wolną od RNAzy i wytrącić sondę RNA znakowaną Dig, jak opisano w kroku 4. Ponownie zawiesić przemyty osad RNA w 100 μl wody wolnej od RNAse. Zawieszone próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C.
6. Określ ilościowo sondę za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Aby zweryfikować jakość sondy, należy przeprowadzić próbkę o objętości 1-2 μl na 1-2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.

2. Pobieranie i utrwalanie zarodków Drosophila

Przegląd: Ta sekcja opisuje etapy pobierania i przetwarzania zarodków Drosophila. W zależności od liczby potrzebnych zarodków muchy mogą być trzymane w klatkach populacyjnych o różnych rozmiarach. Poniższe kroki dotyczą zbiorów wykonywanych przy użyciu³ cylindrycznych klatek o długości 900 cm przy użyciu talerzy do zbierania soku jabłkowego o średnicy 100 mm. Prawidłowe utrwalenie wymaga usunięcia dwóch warstw ochronnych otaczających zarodek: kosmówki zewnętrznej i błony wewnętrznej błony witelinowej ¹³. Po zebraniu zarodki są najpierw kąpane w 50% roztworze wybielacza w celu usunięcia kosmówki, a następnie są mieszane w dwufazowym roztworze zawierającym heptan (przenika przez błonę witeliny) i PBS zawierającym 3,7% formaldehydu. Błona witeliny jest następnie pękana i usuwana poprzez przeniesienie zarodków do dwufazowej mieszaniny heptanu i metanolu. Prawidłowe utrwalenie zarodka i usunięcie błony witelinowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia dalszej procedury FISH.

Materiały

• Talerze agarowe z sokiem jabłkowym (40% soku jabłkowego, 4% sacharozy, 3,5% agaru, 0,3% metyloparabenu) z pastą drożdżową wielkości dziesięciocentówki (drożdże piekarskie zmieszane z wodą do konsystencji masła)
• Sproszkowany paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA; Kot. Nr 19208)
• heptan
• metanol
• 3% roztwór wybielacza
• Szklane fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada; Kot. Nr 03-337-15).

Wyposażenie

• Klatki dla populacji
• Kosze zbiorcze (wykonane z siatki Nitex i górnej części wyciętej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml, w której wycięto otwór w pokrywie).
• Mały pędzel
• Wir na blacie stołu

1. Wstępnie wyczyść dobrze odżywione klatki populacyjne za pomocą świeżego soku jabłkowego/talerza drożdżowego przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
2. Dodaj nowy talerz soku jabłkowego/drożdży do klatki, aby zebrać zarodki we wczesnym stadium rozwoju. Inkubować klatkę przez 4 godziny w temperaturze 25 °C (należy pamiętać, że czas zbierania można dostosować w zależności od pożądanych etapów).
3. Przygotuj świeży 37% roztwór formaldehydu, łącząc 3,7 g proszku paraformaldehydu, 70 μl 2N KOH i 7,3 ml wody miliQ w szklanej fiolce scyntylacyjnej pod kapturem chemicznym. Gotować roztwór, aż proszek paraformaldehydu całkowicie się rozpuści, następnie schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować do nowej fiolki scyntylacyjnej.
4. Przygotować dwufazowy roztwór utrwalający, łącząc 2,25 ml 1X PBS z 250 ml 37% formaldehydu w fiolce scyntylacyjnej, a następnie dodając 7,5 ml heptanu.
5. Zbierz talerz z sokiem jabłkowym z klatki i zbierz zarodki, dodając trochę wody z kranu o temperaturze pokojowej i delikatnie strzepując zarodki z talerza pędzlem. Przenieś zawieszone zarodki do koszyka i spłucz letnią wodą z kranu.
6. Dekorionuj zarodki przez 90 sekund, kąpiąc kosze zbiorcze w roztworze wybielacza, a następnie dokładnie spłucz letnią wodą z kranu (aż zapach wybielacza zniknie).
7. Zdemontuj kosz do pobierania zarodków, delikatnie zbierz zarodki za pomocą pędzla i przenieś je do dwufazowego roztworu utrwalającego. Zarodki gromadzą się na granicy między warstwami PBS i heptanu.
8. Uszczelnić fiolki scyntylacyjne i przymocować do mieszalnika wirowego. Wstrząsaj przez 20 minut na najniższym ustawieniu.
9. Usunąć i wyrzucić większość dolnych PBS i górnych faz heptanu za pomocą pipety Pasteura. Odessać pozostałą mieszaninę PBS/heptanu/zarodków do pipety. Kroplami wyrzuć dolną fazę PBS z pipety, uważając, aby nie wyeliminować zarodków. Umieścić zarodki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej dwufazowy roztwór 500 μl heptanu (górna faza) i 500 μl metanolu (dolna faza).
10. Potrząsaj energicznie probówkami ręcznie przez 30-45 sekund, aby rozbić błony witelinowe. Po pęknięciu zarodki zatopią się w metanolu.
11. Odrzucić górną fazę heptanu i niepęknięte zarodki na skrzyżowaniu heptan/metanol i dodać 500 μl metanolu. Wstrząsaj przez 5 sekund.
12. Umyj 3 razy metanolem i przechowuj zarodki w temperaturze -20 °C (w tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez tygodnie/miesiące).

3. Przetwarzanie po utrwaleniu, hybrydyzacja i mycie po hybrydyzacji

Przegląd: Ta sekcja szczegółowo opisuje etapy przetwarzania permeabilizacji zarodków przed FISH, przed hybrydyzacją, hybrydyzacją za pomocą sond RNA i myciem po hybrydyzacji. W początkowych etapach przepuszczalności zarodki są traktowane jako pula w pojedynczej probówce (kroki 1-9 poniżej, dążąc do 10-15 μl osiadłych zarodków/próbki), ale są one rozdzielane na porcje do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki PCR przed przejściem do etapu wstępnej hybrydyzacji (krok 10 poniżej). Pomaga to zapewnić równomierne traktowanie wszystkich zarodków w początkowych fazach eksperymentu. Podczas przygotowywania eksperymentu FISH ważne jest, aby uwzględnić kontrole ujemne w celu określenia poziomu sygnału tła w poszczególnych eksperymentach. W tym celu zalecamy dołączenie próbki "bez sondy" i, jak wspomniano w sekcji 1, próbki zhybrydyzowanej z sondą RNA "sense", która zazwyczaj daje sygnał porównywalny do stanu "bez sondy".

Materiały:

• metanol
• Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% Tween-20 (PBT)
• Proteinaza-K 1 mg/ml roztwór podstawowy (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Nr katalogowy P2308)
• Glicyna (20 mg/ml roztworu podstawowego)
• Roztwór hybrydyzacyjny: 50% formamidu, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g/ml DNA nasienia strzyżenia łososia, 100 μg/ml heparyny.
• 0,2 ml 96-dołkowe płytki PCR z półspódniczką, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Nr 0900)

Wyposażenie

• Piec do hybrydyzacji, cyfrowy blok grzewczy lub łaźnia wodna regulowana do 56 °C, 80 °C lub 100 °C lub maszyna do PCR.
• Pipety wielokanałowe (zalecane w celu uproszczenia etapów mycia)
• Mieszalnik nutujący

1. Opłucz zarodki w metanolu, następnie w mieszaninie metanolu:PBT w stosunku 1:1, a następnie dwukrotnie w PBT.
2. Utrwal zarodki przez 20 minut w 1 ml PBT zawierającym 3,7% formaldehydu (świeżo przygotowanym zgodnie z opisem w kroku 11) przy ciągłym kołysaniu na nutatorze.
3. Myj zarodki 3 razy przez 2 minuty w PBT podczas bujania.
4. Przygotować roztwór 3 μg/ml proteinazy K (PK) rozcieńczonej w PBT i dodać 500 μl roztworu do próbek. Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Mieszaj zarodki co 2 minuty, spryskując je pipetą lub delikatnie odwracając probówki.
5. Próbki zarodków należy przenieść na lód przez 1 godzinę.
6. Przenieść próbki do temperatury pokojowej i usunąć roztwór farmakokineki. Przemyć 2 razy przez 2 minuty 1 ml PBT + 2 mg/ml glicyny.
7. Utrwal próbki 20 minut w 1 ml PBT + 3,7% formaldehydu z kołysaniem. Opłucz zarodki 5 razy w PBT.
8. Opłucz zarodki 1 ml mieszaniny PBT i roztworu Hyb w stosunku 1:1. Zastąp 0,5-1 ml 100% roztworu Hyb (na tym etapie zarodki mogą być przechowywane przez kilka dni/tygodni w temperaturze -20 °C).
9. Podziel zarodki na pojedyncze dołki na 96-dołkowej płytce (celuj w ~10-15 μl osiadłych zarodków/studzienkę, należy uważać, aby używać końcówek o szerokim otworze, aby uniknąć uszkodzenia zarodków).
10. Gotować 100 μl / próbkę roztworu Hyb przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut. Roztwór ten służy do wstępnej hybrydyzacji próbki (Pre-Hyb).
11. Dodać 100 μl/próbkę roztworu Pre-Hyb i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 56 °C.
12. Dla każdej próbki rozcieńczyć ~100 ng sondy w 100 μl roztworu Hyb. Podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 3 minuty, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut (podgrzane sondy można przechowywać na lodzie przez kilka godzin).
13. Usuń roztwór Pre-Hyb z zarodków i zastąp go roztworem sondy RNA.
14. Hybrydyzować w temperaturze 56 °C przez 12-16 godzin.
15. W temperaturze 56 °C należy wstępnie podgrzać następujące roztwory do mycia: (A) 200 μl/próbkę roztworu Hyb; B) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 3:1; C) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 1:1; D) 100 μl/próbkę mieszaniny Hyb:PBT w stosunku 1:3; (E) 400 μl/próbkę PBT.
16. Przepłukać próbki 100 μl roztworu myjącego A, a następnie przeprowadzić etap płukania roztworami A-D w temperaturze 100 μl/D w temperaturze 56 °C przez 15 minut każdy. Następnie przemywać próbki 4 razy przez 5 minut w 100 μl/próbkę roztworu E w temperaturze 56 °C.
17. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej.

4. Wykrywanie sondy

Przegląd: Ta sekcja opisuje przeciwciała i odczynniki wykrywające używane do wykrywania i wizualizacji rozkładu sygnału sondy RNA po hybrydyzacji. Kroki te przedstawiono schematycznie na rysunku 2. Tutaj przedstawiamy tylko standardowe odczynniki detekcyjne, których używamy do solidnego wzmacniania sygnału, ale istnieje wiele dostępnych na rynku odczynników, które mogą być używane jako alternatywa, zwłaszcza podczas wykonywania eksperymentów z podwójnymi FISH w celu jednoczesnego jednoczesnego wykrywania różnych RNA w celu podwójnego barwienia białka-RNA. Przykłady wyników uzyskanych za pomocą tego protokołu przedstawiono w mozaice wzorca ekspresji/lokalizacji mRNA na rysunku 3.

Materiały

• Mysi monoklonalny anty-DIG sprzężony z HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Kat. Nr 200-032-156)
• Mysi monoklonalny anty-DIG sprzężony z biotyną (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Kat. Nr 200-062-156)
• koniugat streptawidyna-HRP (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Kat. Nr S991)
• Koniugaty Cy3-tyramidu (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Kat. Nie. SAT704A)
• Roztwór montażowy DABCO: W probówce o pojemności 50 ml rozcieńczyć 1,25 grama DABCO (1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktanu; Sigma D-2522) w 15 ml 1X PBS, następnie dodać 35 ml glicerolu i mieszać do uzyskania pełnej jednorodności. Dzięki wstępnemu zmieszaniu z PBS, proszek DABCO rozpuszcza się bardzo szybko. Roztwór montażowy przechowywać w temperaturze -20 °C.
• Szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe

Wyposażenie

• Mieszalnik nutujący
• Pipetor wielokanałowy
• Mikroskop fluorescencyjny

1. Przygotować roztwór PBTB, zawierający PBT + 1% odtłuszczonego mleka w proszku (zwykle 50-100 ml wystarcza na wszystkie etapy inkubacji odczynnika do wykrywania i płukania).
2. Blokuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w 100 μl PBTB/próbkę, kołysząc się na nutatorze.
3. Usunąć roztwór blokujący z zarodków i inkubować próbki przez 1,5-2 godziny w temperaturze pokojowej ze 100 μl/próbkę roztworu przeciwciała monoklonalnego biotyny anty-DIG (rozcieńczonego w stosunku 1/400 z podstaw do PBTB) z kołysaniem.
4. Próbki należy przemywać 6 razy przez 5 minut za pomocą 100 μl PBTB/próbkę z kołysaniem.
5. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z 75 ml/próbkę roztworu streptawidyny-HRP (rozcieńczonego w stosunku 1:100 z zapasu w PBTB, 10 μg/ml stężenia końcowego) z kołysaniem.
6. Próbki należy przemywać 6 razy przez 5 minut po każde 100 μl PBTB/próbkę z kołysaniem (w celu barwienia przeciwstawnego DNA należy rozcieńczyć DAPI do 1X stężenia roboczego w PBTB i użyć tego roztworu w pierwszym etapie mycia).
7. Opłucz zarodki PBT, a następnie umyj 2 razy przez 5 minut PBS.
8. Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na nutatorze z 50 μl/próbkę roztworu Cy3-tyramidu (rozcieńczonego w stosunku 1:50 w buforze do amplifikacji tyramdu). Od tego kroku upewnij się, że przechowujesz próbki w pojemniku z osłoną światła.
9. Przemyć próbki 6 razy przez 5 minut każda, używając 100 μl PBS/próbkę na nutatorze.
10. Usunąć PBS i dodać 100-125 μl/próbkę roztworu montażowego zawierającego 70% glicerolu i 2,5% (DABCO). Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Próbki te mogą być przechowywane przez kilka lat.
11. Za pomocą końcówki o szerokim otworze ponownie zawiesić zarodki, delikatnie pipetując próbki i przenieść 25 μl zarodków na szkiełko podstawowe, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na zarodki i zamknąć na szkiełku lakierem do paznokci
.
12. Analizuj próbki zarodków za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

Prawidłowo wykonana procedura ta zapewnia znacznie wyższy poziom szczegółowości w analizie czasowo-przestrzennej dynamiki ekspresji genów i lokalizacji mRNA podczas wczesnej embriogenezy Drosophila. Rzeczywiście, jak zilustrowano na Rysunku 3A dla klasycznego genu parzystego runt (run), za pomocą tego protokołu można obserwować zdarzenia ekspresji genów poprzez detekcję ognisk powstających transkrypty w grupach eksponujących ją jąder. Ponadto, jak pokazano na mozaice embrionów ...

Dyskusja

Na etapach syntezy sondy zwykle generujemy spływające antysensowne sondy RNA przez transkrypcję in vitro z pełnowymiarowych cDNA Drosophila amplifikowanych z plazmidów znalezionych w Drosophila Gene Collection (DGC), zasobu szczegółowo opisanym na następującej stronie internetowej: http://www.fruitfly.org/DGC/index.html ^14,15. Podejście to jest szeroko stosowane w badaniach ISH na dużą skalę, mających na celu mapowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polimeraza RNA T7, T3 lub SP6	Fermentas Life Sciences	EP0101,EP0111,EP0131	Zestawy zawierają bufor reakcyjny.
DIG RNA Labeling Mix Roche	Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
3M octan
Zimny 100% etanol.
Zimny 70% etanol.
Roztwór wybielacza chlorowego rozcieńczony wodą w stosunku 1:1.
Heptan
Metanol
proteinaza K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Kanada	Nr katalogowy P2308
40% roztwór formaldehydu, świeżo przygotowany
roztwór PBS-Tween (PBT)		1xPBS, 0,1% Tween-20
Roztwór		2 mg / ml glicyny w monoklonalnym
HRP	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc	200-032-156	(1/400 rozcieńczenie roztworu podstawowego 1 mg / ml w PBTB
HRP-sprzężonym z owcami monoklonalnym anty-DIG	Roche Applied Science, Laval, QC	1 207 733	1/500 rozcieńczenie roztworu podstawowego w PBTB
Monoklonalny anty-DIG	myszy sprzężony z biotynąJackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	200-062-156	(1/400 rozcieńczenie roztworu podstawowego 1 mg / ml w
sprzężonych sondach molekularnych	PBTB Streptawidyna-HRP	S991	(1/100 rozcieńczenie 1 μ g/ml zapasu

sodu glicyny anty-DIG myszy sprzężonym z PBT , Eugene OR, USA