Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ivan Liadi; Jason Roszik; Gabrielle Romain; Laurence J.N. Cooper; Navin Varadarajan

doi:10.3791/50058

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50058

⸱

2 lutego 2013

Ivan Liadi¹ , Jason Roszik² , Gabrielle Romain¹ , Laurence J.N. Cooper² , Navin Varadarajan¹

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston , ²Division of Pediatrics, Research Unit 907, University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Streszczenie

Immunoterapia nowotworów może wykorzystać specyfikę odpowiedzi immunologicznej do zwalczania i eliminowania nowotworów. Adoptywna terapia komórkowa (ACT) oparta na adoptywnym transferze limfocytów T zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji chimerycznego receptora antygenowego (CAR) okazała się bardzo obiecująca w badaniach klinicznych^1-4. Istnieje kilka zalet stosowania limfocytów T CAR⁺ w leczeniu nowotworów, w tym zdolność do celowania w antygeny nieograniczone MHC i funkcjonalizacji limfocytów T w celu optymalnego przeżycia, naprowadzania i trwałości w gospodarzu; i wreszcie do indukowania apoptozy limfocytów T CAR⁺ w przypadku toksyczności gospodarza⁵.

Określenie optymalnych funkcji limfocytów T CAR⁺ związanych z korzyściami klinicznymi jest niezbędne do zaprojektowania następnej generacji badań klinicznych. Ostatnie postępy w obrazowaniu żywych zwierząt, takie jak mikroskopia wielofotonowa, zrewolucjonizowały badania funkcji komórek odpornościowych in vivo^6,7. Podczas gdy badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat funkcji komórek T in vivo, ACT oparty na komórkach T w badaniach klinicznych wymaga powiązania cech molekularnych i funkcjonalnych preparatów z komórek T przed infuzją ze skutecznością kliniczną po infuzji, poprzez wykorzystanie testów in vitro monitorujących funkcje komórek T, takie jak cytotoksyczność i wydzielanie cytokin. Opracowano standardowe testy oparte na cytometrii przepływowej, które określają ogólne funkcjonowanie populacji limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, ale nie są one odpowiednie do monitorowania powstawania koniugatów i czasu życia lub zdolności tej samej komórki do zabijania wielu celów⁸.

Mikrofabrykowane matryce zaprojektowane z biokompatybilnych polimerów, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS), są szczególnie atrakcyjną metodą do przestrzennego ograniczania efektorów i celów w małych objętościach⁹. W połączeniu z automatyczną poklatkową mikroskopią fluorescencyjną, tysiące interakcji efektor-cel mogą być monitorowane jednocześnie poprzez obrazowanie pojedynczych dołków macierzy nanostudzienek. Przedstawiamy tutaj wysokoprzepustową metodologię monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, która może być szeroko stosowana do badania cytolitycznej funkcjonalności limfocytów T.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

Przygotuj RPMI-PLGH, mieszając po 500 ml RPMI-1640 i po 5 ml roztworu penicyliny-streptomycyny, L-glutaminy i HEPES.
Przygotować roztwór R10, mieszając RPMI-PLGH z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). FBS jest inaktywowany termicznie w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed dodaniem.
Wstępnie podgrzać w temperaturze 37 °C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS i 15 ml R10 w sterylnych stożkowych probówkach.
Wytwarzanie matryc nanodołków w PDMS: Krzemowy wzorzec jest wytwarzany przy użyciu fotolitografii, zasadniczo tak, jak opisano wcześniej¹⁰. Dokładnie wymieszaj bazę zestawu elastomerowego Sylgard 184 i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 w jednorazowym kubku za pomocą plastikowego noża. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez 1 godzinę. Wlej mieszaninę na matrycę nanostudzienek, zamknij szkiełkiem i pozostaw na 30 minut. Przenieść zestaw do piekarnika nastawionego na 80 °C na 2 godziny i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Elastomer utwardzi się w tym okresie i zwiąże się ze szkiełkiem. Szklane szkiełko zawierające matrycę nanostudzienek PDMS jest ostrożnie zdejmowane z matrycy silikonowej, przykrywane taśmą klejącą i przechowywane do przyszłego użycia.

2. Etykietowanie komórek docelowych (T)

Policz 5 milionów komórek docelowych z hodowli komórkowej za pomocą hemocytometru i umieść komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut. Hodowlę komórkową dzieli się poprzedniego dnia na 5 ml całkowitej objętości (gęstość = 1 milion/ml) i hoduje w kolbie T-25 (VWR). Protokoły zliczania komórek za pomocą hemocytometru zostały szczegółowo opisane wcześniej¹¹
Odessać nadmiar pożywki, pozostawiając około 50 μl pożywki.
Przygotuj roztwór roboczy Cell Tracker Red (CTR), mieszając 0,5 μl materiału CTR (1 mM) z 150 μl RPMI-PLGH (stężenie końcowe 2,5 μM). Dodać 150 μl roztworu roboczego do komórek docelowych i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P200. Alternatywnie można użyć PKH 26 (stężenie końcowe 2 μM) do oznakowania komórek docelowych zgodnie z instrukcjami producenta.
Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 20 minut.

3. Etykietowanie komórek efektora (E)

Odliczyć 5 milionów komórek efektorowych z hodowli komórkowej za pomocą hemacytometru i umieścić komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut.
Odsysanie nadmiaru pożywki
Przygotować roztwór roboczy roztworu Vybrant DyeCycleViolet Stain poprzez dodanie 1 μl 5 mM bulionu Vybrant Violet do 1 ml pożywki R10 (końcowe stężenie 5 μM). Dodać roztwór roboczy do komórek i ponownie zawiesić za pomocą pipety P200. Alternatywnie można użyć PKH 67 (stężenie końcowe 2 μM) oznaczając komórki docelowe zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli używany jest PKH 67, nie należy stosować SYTOX Green, ponieważ znajdują się one w tym samym kanale fluorescencyjnym. Wyliczanie celów apoptotycznych odbywa się w tym przypadku wyłącznie przy użyciu barwienia AnnexinV.
nuta: W przypadku wykonywania pomiarów poklatkowych, a nie końcowych, należy unikać barwników UV, takich jak Vybrant Violet.
Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 20 minut.

4. Oddzielanie żywych i martwych komórek za pomocą gradientu gęstości

Dodać 6,8 ml i 6,0 ml RPMI-PLGH odpowiednio do komórek docelowych i efektorowych, a następnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
Nałożyć 3,5 ml FICOLL-Paque Plus na spód każdej stożkowej probówki zawierającej komórki docelowe i efektorowe. Nakładaj FICOLL powoli, aby zapewnić dobre tworzenie warstw między FICOLL a podłożem.
Odwirować obie probówki przy ciśnieniu 340 x g przez 30 minut bez hamowania i przyspieszania.
Podczas wirowania przenieść 7 ml wstępnie podgrzanego PBS na płytkę 4-dołkową. Przygotuj matrycę nanostudzienek (wyprodukowaną w PDMS): oczyść dno szkiełka etanolem i utlenij PDMS przy wysokim ustawieniu RF za pomocą utleniacza plazmowego przez 1 minutę. Ten krok wysterylizuje matrycę nanostudzienek, jednocześnie sprawiając, że PDMS stanie się hydrofilowy. Natychmiast przenieś matrycę nanostudzienek do płytki zawierającej PBS.
Przenieść płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessać nadmiar PBS. Przygotuj 10 ml 1% szlachetnego agaru, dodając 100 mg proszku agarowego do 10 ml wody DI, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 30-45 sekund. Nałóż ciepły 1% szlachetny agar na górną i dolną krawędź szkiełka zawierającego matrycę nanostudzienek, aby unieruchomić matrycę i odczekaj 10 minut, aż agar zastygnie. Dodać 3 ml PBS i odessać nadmiar agaru.
Dodaj 3 ml R10 na wierzch matrycy nanostudzienek i pozwól mu się zrównoważyć przez ~ 10 minut.
Po odwirowaniu FICOLL należy odessać 5 ml pożywki z górnej warstwy każdej probówki. Uważaj, aby nie zassać warstwy zawierającej komórki.
Pobrać komórki (biała warstwa), odzyskując 1-2 ml z warstwy między FICOLL a pożywką za pomocą pipety P1,000 i przenieść do nowych sterylnych probówek stożkowych. Powtórz to dla obu zestawów komórek, upewniając się, że maksymalizujesz komórki odzyskiwania.
Dodać 3 ml wstępnie podgrzanego RPMI-PLGH do każdej probówki, wymieszać pipetując i osad przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut przy pełnym przyspieszeniu i hamowaniu.
Odessać nadmiar pożywki, dodać 5 ml wstępnie podgrzanego RPMI-PLGH do każdej probówki i powtarzać wirowanie przy 340 x g przez 5 minut.
Odessać nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl R10.
Policz żywe komórki za pomocą metody wykluczenia błękitu trypana na hemacytometrze.

5. Ładowanie komórek do Nanowell Array

Odessać nadmiar pożywki z matrycy nanostudzienek i dodać 2 ml świeżego R10 do matrycy. Odessać ponownie, upewniając się, że górna część matrycy nanostudzienek nie jest zbyt mokra/sucha, ponieważ wpłynie to na rozmieszczenie komórek.
Umieść 1 x 10⁵ komórek efektorowych w 200 μl R10 na powierzchni matrycy nanostudzienkowej (gęstość = 5 x 10⁵ komórek/ml).
Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut i za pomocą standardowego mikroskopu kultur tkankowych sprawdź, czy rozmieszczenie komórek jest pożądane. W razie potrzeby dodaj więcej komórek.
Umieść 1 x 10⁵ komórek docelowych w 200 μl R10 na powierzchni nanostudzienki (gęstość = 5 x 10⁵ komórek/ml).
Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut i za pomocą standardowego mikroskopu kultur tkankowych sprawdź, czy rozmieszczenie komórek jest pożądane. W razie potrzeby dodaj więcej komórek.
Ostrożnie przepłukać układ nanostudzienek 2 ml R10 i odessać nadmiar pożywki.
Przygotuj 3 ml wstępnie podgrzanego R10 w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 3 μl 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (końcowe stężenie 0,5 μM) i 60 μl Annexin V-Alexa Fluor 647, aby przygotować roztwór roboczy. Ostrożnie dodaj roztwór roboczy na płytkę 4-dołkową, upewniając się, że komórki nie są przemieszczane z dołków.
Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 15 minut.

6. Obrazowanie 1

Uzyskanie obrazów matrycy nanostudzienkowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego: W tym przykładzie używamy mikroskopu ZEISS Observer Z-1 wyposażonego w zmotoryzowany stolik i Lambda-DG4.
Zainicjuj oprogramowanie i mikroskop i sprawdź natężenie sygnału w przesyłanym świetle i innych kanałach fluorescencyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, będzie pięć kanałów odpowiadających: światłu przechodzącemu, Annexin V-647 (filtr Cy5), CTR (filtr DsRed), SYTOX Green (filtr FITC) i Vybrant Violet (filtr DAPI). Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony tak, aby zapewnić maksymalny stosunek sygnału do szumu, unikając nasycenia.
Ustaw pozycje X i Y dla macierzy nanostudzienek. Rozpocznij proces od ustawienia pozycji zerowej i zainicjowania ostrości na środku bloku matrycy nanodołkowej 7 x 7 w lewym górnym rogu stempla macierzy nanowell. Ustaw pozycje x,y tak, aby pokrywały się ze środkiem każdego bloku, a wartość z dokładnie odzwierciedlała ostrość na każdym bloku.
Po ustawieniu pozycji i ostrości upewnij się, że akwizycja obrazu jest ustawiona w trybie liniowym i rejestruje obrazy. nuta: W razie potrzeby włączyć inkubator i CO₂ pod mikroskopem co najmniej 30 minut przed eksperymentem.

7. Po obrazowaniu

Przenieś 4-dołkową płytkę zawierającą matrycę nanowell do inkubatora (37 °C/5% CO₂) na 6 godzin.

8. Obrazowanie 2

Zdobądź obrazy w drugim punkcie czasowym, jak opisano w kroku 6.

9. Analiza obrazu

Zajętość komórek w nanostudzienkach jest określana przez zastosowanie odpowiednich programów do segmentacji obrazu (np. ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/) zasadniczo tak, jak opisano wcześniej^9,12 .
Analiza początkowego zestawu obrazów mikroskopowych (t = 0 godz.; t₀) służy do generowania bazy danych poszczególnych nanostudzienek zawierających dokładnie jedną żywą komórkę docelową (zidentyfikowaną przez CellTracker Red; czerwoną) i brak martwych komórek (zidentyfikowanych przez barwienie Aneksyną V, kolor zielony) [nanostudzienki T1t₀].
Analiza drugiego zestawu obrazów mikroskopowych (t = 6 godz.; t₆) służy do niezależnego określenia drugiej bazy danych nanodołków zawierających 1 komórkę docelową (czerwoną) [T1t₆ nanostudzienek]. Kontrola integralności (zapytanie do bazy danych) jest implementowana w celu zapewnienia, że wszystkie żywe cele w t₀ są dopasowywane do celów w t₆ w celu wytworzenia końcowego zestawu dopasowanych celów (zaimplementowanych jako nanodołki, które mają T1t₀ = T1t₆, oznaczone jako T1match)
Liczbę komórek efektorowych w nanostudzienkach określa się za pomocą barwienia fioletem Vybrant w t₀ [E1 nanostudzienkach]
Zadane zapytanie do bazy danych jest implementowane w celu identyfikacji nanodołków zawierających pojedyncze efektory współinkubowane z pojedynczymi celami (zdefiniowanymi jako nanodołki, które mają_dopasowanie E1 i T1, oznaczone jako E1T1)
Apoptozę indukowaną efektorem ocenia się, identyfikując cele, które są ujemne pod względem anektyny V przy t₀ i dodatnie pod względem anektyny V przy t₄ (E1T1 z barwieniem celu anektyny V przy t₆).

10. Opcjonalne obrazowanie poklatkowe zabijania za pomocą komunikatora BioStation firmy Nikon

Weź szalkę Petriego z dnem szkiełka nakrywkowego i wytnij mały kawałek chipa nanowell (przygotowanego w kroku 5), który dokładnie zmieści się na szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że wiór pozostaje mokry podczas cięcia.
Wymieszać 1 x 10⁶ tarcz i 1 x 10⁶ limfocytów T w pożywce o objętości 100 μl i pipetować na szkiełko nakrywkowe.
Odczekaj około 15-30 minut, aby komórki się uspokoiły.
Szybko odwróć mały chip nanowell i umieść go na szkiełku nakrywkowym.
Aby upewnić się, że chip nie będzie mógł się poruszać podczas obrazowania, umieść jedno lub dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 20 mm x 20 mm na górze chipa. Delikatnie dociśnij, aby docisnąć frytek do dna naczynia.

Uwaga: Spód układu nanowell array jest zbyt gruby do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i dlatego musi być odwrócony do góry nogami. W tym czasie wiele komórek jest wypłukiwanych. Ponieważ nie można tego łatwo kontrolować, liczba komórek w kroku 9.2 i czas inkubacji w kroku 9.3 muszą zostać zoptymalizowane.