Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Podsumowanie

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Streszczenie

Immunoterapia nowotworów może wykorzystać specyfikę odpowiedzi immunologicznej do zwalczania i eliminowania nowotworów. Adoptywna terapia komórkowa (ACT) oparta na adoptywnym transferze limfocytów T zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji chimerycznego receptora antygenowego (CAR) okazała się bardzo obiecująca w badaniach klinicznych^1-4. Istnieje kilka zalet stosowania limfocytów T CAR⁺ w leczeniu nowotworów, w tym zdolność do celowania w antygeny nieograniczone MHC i funkcjonalizacji limfocytów T w celu optymalnego przeżycia, naprowadzania i trwałości w gospodarzu; i wreszcie do indukowania apoptozy limfocytów T CAR⁺ w przypadku toksyczności gospodarza⁵.

Określenie optymalnych funkcji limfocytów T CAR⁺ związanych z korzyściami klinicznymi jest niezbędne do zaprojektowania następnej generacji badań klinicznych. Ostatnie postępy w obrazowaniu żywych zwierząt, takie jak mikroskopia wielofotonowa, zrewolucjonizowały badania funkcji komórek odpornościowych in vivo^6,7. Podczas gdy badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat funkcji komórek T in vivo, ACT oparty na komórkach T w badaniach klinicznych wymaga powiązania cech molekularnych i funkcjonalnych preparatów z komórek T przed infuzją ze skutecznością kliniczną po infuzji, poprzez wykorzystanie testów in vitro monitorujących funkcje komórek T, takie jak cytotoksyczność i wydzielanie cytokin. Opracowano standardowe testy oparte na cytometrii przepływowej, które określają ogólne funkcjonowanie populacji limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, ale nie są one odpowiednie do monitorowania powstawania koniugatów i czasu życia lub zdolności tej samej komórki do zabijania wielu celów⁸.

Mikrofabrykowane matryce zaprojektowane z biokompatybilnych polimerów, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS), są szczególnie atrakcyjną metodą do przestrzennego ograniczania efektorów i celów w małych objętościach⁹. W połączeniu z automatyczną poklatkową mikroskopią fluorescencyjną, tysiące interakcji efektor-cel mogą być monitorowane jednocześnie poprzez obrazowanie pojedynczych dołków macierzy nanostudzienek. Przedstawiamy tutaj wysokoprzepustową metodologię monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, która może być szeroko stosowana do badania cytolitycznej funkcjonalności limfocytów T.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj RPMI-PLGH, mieszając po 500 ml RPMI-1640 i po 5 ml roztworu penicyliny-streptomycyny, L-glutaminy i HEPES.
2. Przygotować roztwór R10, mieszając RPMI-PLGH z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). FBS jest inaktywowany termicznie w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed dodaniem.
3. Wstępnie podgrzać w temperaturze 37 °C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS i 15 ml R10 w sterylnych stożkowych probówkach.
4. Wytwarzanie matryc nanodołków w PDMS: Krzemowy wzorzec jest wytwarzany przy użyciu fotolitografii, zasadniczo tak, jak opisano wcześniej¹⁰. Dokładnie wymieszaj bazę zestawu elastomerowego Sylgard....

Wyniki

Przykład zastosowania wysokoprzepustowego testu cytolitycznego pokazano na rysunku 2. Krótko mówiąc, znakowane limfocyty T CAR ⁺ specyficzne dla CD19 inkubowano jednocześnie ze znakowanymi mysimi komórkami docelowymi EL4 w indywidualnych dołkach macierzy nanodołków (sekcje 1-5). Wstępny obraz został zarejestrowany na automatycznym mikroskopie fluorescencyjnym w celu zidentyfikowania zajętości (efektorów i/lub celów) każdej pojedynczej nanostudzienki w matrycy (sekcja 6). Przetwarzanie obrazu w.......

Dyskusja

Nakreśliliśmy protokół wysokoprzepustowego jednokomórkowego testu cytolitycznego możliwego poprzez jednoczesną inkubację efektorów i celów w układach nanodołków (Figura 1). Oprócz przepustowości, główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem efektorów w stosunku do pożądanych komórek docelowych bez konieczności inżynierii komórek docelowych, co z kolei pozwala na wykorzystanie autologicznych lub dopasowanych/pierwotnych komórek nowotworowych jako komórek docel.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI-1640 bez L-glutaminy	Cellgro	15-040-CV
Penicylina-streptomycyna	Cellgro	30-002-CI	10 000 I.U. Penicylina 10 000 μ g / ml Streptomycyna
L-glutamina	Cellgro	25-005-CI	200 mM roztwór
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot testowany
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μ g
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Barwnik kwasów nukleinowych	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μ l
Dulbecco's PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Szlachetny agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0,4% płynny, sterylny filtrowany
Hemocytometr	Hausser Scientifics	1492	Jasna linia
4-dołkowa płytka	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Podstawowa myjka plazmowa
Observer.Z1	ZEISS		Mikroskop fluorescencyjny (współpracuje z trzema poniższymi częściami)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Kontroler filtra
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength
Switcher Hamamatsu EM-CCD Kamera	Hamamatsu	C9100-13	Kamera mikroskopowa CCD
15 ml rurka stożkowa	BD Falcon	352097
50 ml rurka stożkowa	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Naczynie do hodowli zwierząt ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-0	szalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 10 mm