Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Decelularyzacja całego narządu oparta na perfuzji zyskała ostatnio zainteresowanie w dziedzinie inżynierii tkankowej jako sposób na tworzenie specyficznych dla miejsca rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury rusztowania. Do tej pory podejście to było stosowane w różnych układach narządów, w tym w sercu, płucach i wątrobie 1-5. Poprzednie metody decelularyzacji tkanek bez łatwo dostępnej sieci naczyniowej polegały na długotrwałym narażeniu tkanki na roztwory detergentów, kwasów lub zabiegów enzymatycznych jako sposób na usunięcie składników komórkowych i jądrowych z otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego6-8. Jednak skuteczność tych metod zależała od zdolności roztworów do przenikania do tkanki poprzez dyfuzję. Natomiast perfuzja narządów przez naturalny układ naczyniowy skutecznie zmniejszała odległość dyfuzji i ułatwiała transport środków decelularyzacyjnych do tkanek i składników komórkowych poza tkankę. W niniejszym artykule opisujemy metodę pełnej decelularyzacji nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję wieńcową. W wyniku protokołu uzyskano w pełni zdekomórkowane rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca (c-ECM) z nienaruszoną trójwymiarową strukturą serca. W naszej metodzie wykorzystano szereg enzymów, detergentów i kwasów w połączeniu z hipertonicznymi i hipotonicznymi płukankami, aby wspomóc lizę i usuwanie komórek. W protokole wykorzystano roztwór trypsyny do odłączenia komórek od macierzy, a następnie roztwory Triton X-100 i deoksycholanu sodu, aby pomóc w usunięciu materiału komórkowego. Opisany protokół wykorzystuje również prędkości perfuzji większe niż 2 l/min przez dłuższy czas. Wysokie natężenie przepływu w połączeniu ze zmianami roztworu umożliwiło transport środków do tkanki bez zanieczyszczenia resztek komórkowych i zapewniło skuteczne płukanie tkanki. Opisana metoda usunęła cały materiał jądrowy z natywnej tkanki serca świni, tworząc specyficzne dla danego miejsca rusztowanie ECM serca, które można wykorzystać do różnych zastosowań.
Protokół
1. Przygotowanie tkanek i konfiguracja eksperymentu
- Natychmiast po eutanazji należy pobrać narządy świń z rzeźni lub placówki badawczej i spłukać nadmiar krwi. Oczyść serce z nadmiaru tłuszczu i tkanki, utrzymując przedsionki i aortę w stanie nienaruszonym. Odetnij tłuszcz, aby oddzielić tętnicę płucną od aorty. Jeśli w tkance są jakiekolwiek skaleczenia, należy je odpowiednio wyrzucić.
- Zawiń każde serce pojedynczo w papier do zamrażania i przechowuj całą chusteczkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie.
- Gdy jest gotowy do użycia (zwykle krócej niż 3 miesiące), rozmrozić jedno....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wpływ decelularyzacji na całe serca świńskie naturalnie różni się ze względu na różnice w wielkości, ciśnieniu i układzie naczyń. W związku z tym dokładny skład uzyskanych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej nie będzie taki sam dla każdego serca. Zakończenie opisanego protokołu pozwoli uzyskać serce o białym lub półprzezroczystym wyglądzie, co wskazuje na utratę materiału komórkowego. Powszechnie przyjmuje się jednak, że tkankę można uznać za „zdecelularyzowaną” na podstawie kombinacji kilku dodatkowych parametrów iloś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W obecnym badaniu opisano metodologię konsekwentnej i skutecznej decelularyzacji serca świni. Protokół był modyfikacją wcześniej opublikowanego raportu 1 i obejmował dłuższą ekspozycję na przepływ i zwiększone ciśnienie, co zapewniło bardziej powtarzalne wyniki. Uzyskana w ten sposób tkanka pozbawiona komórek spełniała wszystkie opublikowane kryteria udanej decelularyzacji tkanki 2. Przeprowadzano częste zmiany roztworu w celu ograniczenia ponownego wprowadzania materiału komórkowego do tkanki, a .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Dr Gilbert był członkiem Naukowej Rady Doradczej w ACell, Inc. podczas prowadzenia badania, a ostatnio został wiceprezesem ds. badań i rozwoju. ACell, Inc. sprzedaje matrycę pęcherza moczowego i nie ma żadnego komercyjnego interesu w niniejszym badaniu.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Brogan Guest, Michelle Weaver i Kristen Lippert. Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez NIH Grant R03EB009237, a także NIH Training Grants T32EB001026-06 z National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering oraz T32HL076124-05.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trypsyna | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Deoksycholan sodu | Sigma | D6750-500G | |
| Kwas nadoctowy | Pfaltz i Bauer | P05020 | 35% CAS # 79-21-0 |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Napęd pompy Masterflex | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Rurka Masterflex | Cole Parmer | 96400-18 | Rozmiar 18 |
| Reduktor kolczasty | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| Zlewka 4L | Fisher Scientific | 02-540T |
Bibliografia
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
