Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Decelularyzacja całego narządu oparta na perfuzji zyskała ostatnio zainteresowanie w dziedzinie inżynierii tkankowej jako sposób na tworzenie specyficznych dla miejsca rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury rusztowania. Do tej pory podejście to było stosowane w różnych układach narządów, w tym w sercu, płucach i wątrobie 1-5. Poprzednie metody decelularyzacji tkanek bez łatwo dostępnej sieci naczyniowej polegały na długotrwałym narażeniu tkanki na roztwory detergentów, kwasów lub zabiegów enzymatycznych jako sposób na usunięcie składników komórkowych i jądrowych z otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego6-8. Jednak skuteczność tych metod zależała od zdolności roztworów do przenikania do tkanki poprzez dyfuzję. Natomiast perfuzja narządów przez naturalny układ naczyniowy skutecznie zmniejszała odległość dyfuzji i ułatwiała transport środków decelularyzacyjnych do tkanek i składników komórkowych poza tkankę. W niniejszym artykule opisujemy metodę pełnej decelularyzacji nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję wieńcową. W wyniku protokołu uzyskano w pełni zdekomórkowane rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca (c-ECM) z nienaruszoną trójwymiarową strukturą serca. W naszej metodzie wykorzystano szereg enzymów, detergentów i kwasów w połączeniu z hipertonicznymi i hipotonicznymi płukankami, aby wspomóc lizę i usuwanie komórek. W protokole wykorzystano roztwór trypsyny do odłączenia komórek od macierzy, a następnie roztwory Triton X-100 i deoksycholanu sodu, aby pomóc w usunięciu materiału komórkowego. Opisany protokół wykorzystuje również prędkości perfuzji większe niż 2 l/min przez dłuższy czas. Wysokie natężenie przepływu w połączeniu ze zmianami roztworu umożliwiło transport środków do tkanki bez zanieczyszczenia resztek komórkowych i zapewniło skuteczne płukanie tkanki. Opisana metoda usunęła cały materiał jądrowy z natywnej tkanki serca świni, tworząc specyficzne dla danego miejsca rusztowanie ECM serca, które można wykorzystać do różnych zastosowań.
Protokół
1. Przygotowanie tkanek i konfiguracja eksperymentu
- Natychmiast po eutanazji należy pobrać narządy świń z rzeźni lub placówki badawczej i spłukać nadmiar krwi. Oczyść serce z nadmiaru tłuszczu i tkanki, utrzymując przedsionki i aortę w stanie nienaruszonym. Odetnij tłuszcz, aby oddzielić tętnicę płucną od aorty. Jeśli w tkance są jakiekolwiek skaleczenia, należy je odpowiednio wyrzucić.
- Zawiń każde serce pojedynczo w papier do zamrażania i przechowuj całą chusteczkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie.
- Gdy jest gotowy do użycia (zwykle krócej niż 3 miesiące), rozmrozić jedno nienaruszone zamrożone serce świni w wodzie typu 1 przez noc zanurzone w 4-litrowej zlewce w temperaturze 4 °C.
- Po całkowitym rozmrożeniu serca osusz je, zważ serce i zapisz wagę. Serce świni o masie rynkowej powinno ważyć około 375-450 g.
- Podłącz rurkę Masterflex w rozmiarze 18 do końcówki 1/4" reduktora kolczastego. Włóż reduktor kolczasty i rurkę do aorty. Umieść 2 zaciski węża lub zabezpiecz opaski zaciskowe wokół aorty, tuż pod tułowiem ramienno-głowowym. Reduktor i rurka muszą pozostać nad zastawką aortalną, aby tętnice wieńcowe mogły być perfundowane (ryc. 1).
- Użyj strzykawki o pojemności 30 lub 60 ml, aby napełnić rurkę wodą typu I. Włożyć rurkę do wkładu pompy rolkowej Masterflex w jej przybliżonym punkcie środkowym. Zanurz końcówkę dopływową rurki w dnie 4-litrowej zlewki wypełnionej 2,5 l wody i zabezpiecz przewód.
- Umieść serce w zlewce wypełnionej wodą i zalej pompę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki wydobywające się z aorty, do której wprowadzana jest rurka, może być konieczna zmiana położenia aorty lub zabezpieczenie jej dodatkowymi opaskami. Hermetyczne uszczelnienie jest ważne dla utrzymania odpowiedniego ciśnienia podczas procesu decelularyzacji (ilustracja 2).
- Umieścić 4-litrową zlewkę zawierającą 3 litry 0,2% roztworu trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 na płytce mieszającej i ogrzać ją do temperatury 37 °C w ramach przygotowań do procesu decelularizacji.
2. Płukanki do tkanek
- Ustaw pompę na natężenie przepływu 400 ml/min, upewniając się, że wybrano odpowiedni rozmiar rurki. Płucz serce wodą typu I przez 15-25 minut. Po uruchomieniu pompy serce powinno puchnąć i wylewać krew z komór. Świeży roztwór należy podmieniać co 5-10 minut lub w razie potrzeby w zależności od ilości krwi usuniętej z serca. Jeśli krew nie wypływa z serca, wyreguluj rurki i clamps w razie potrzeby.
- Zatrzymaj pompę i przenieś serce do osobnej zlewki wypełnionej 2X solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Po zanurzeniu rurki w roztworze uruchom pompę i zwiększ natężenie przepływu do 700 ml/min. Serce powinno pozostać w roztworze przez 15 minut, zmieniając roztwór co 5 minut. Każda zmiana roztworu wymaga tymczasowego zatrzymania pompy na czas przeniesienia tkanki i rurki do nowej zlewki.
- Przenieś serce do wody typu I na 10 minut i zwiększ natężenie przepływu do 750 ml/min.
3. Decelularyzacja i perfuzja roztworu
- Przenieść serce do zlewki zawierającej 0,2% trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze 37 °C. Zwiększyć prędkość pompy do 1 200 ml/min i uruchomić pompę. Za pomocą mieszadła umieszczonego na dnie zlewki rozprowadzić w niej rozpuścić roztwór. Serce powinno pozostać w roztworze 0,2% trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze 37 °C przez łącznie trzy godziny. Po 1 godzinie zwiększ prędkość pompy do 1 500 ml/min. Po dodatkowej godzinie zwiększyć prędkość pompy do 1 800 ml/min. Tkanka jest powoli poddawana zwiększonym prędkościom perfuzji, aby kondycjonować tkankę i zapobiec pękaniu naczyń. Serce puchnie i prawie podwoi swoją wielkość na tym etapie protokołu. Tkanka straci swój naturalny kolor, postępując od przedsionków do wierzchołka w całym protokole (ryc. 3).
- Po każdej perfuzji roztworu przeprowadza się dwuetapowe płukanie w celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych, pozostałości chemicznych i wspomagania lizy komórek. Każde płukanie składa się z 10-minutowego płukania w wodzie typu I, a następnie 10-minutowego płukania 2X roztworem PBS o temperaturze pokojowej. Każde płukanie polega na usunięciu roztworu z oryginalnej zlewki, dodaniu roztworów płuczących i rozprowadzeniu perfuzatu w zlewce zawierającej zanurzone serce. Po 0,2% roztworze trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3, należy przelać wodę z prędkością 1,900 ml / min, a następnie przelać 2X PBS z prędkością 1950 ml / min.
- Przenieść serce do roztworu 3% Triton X-100/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze pokojowej. Zwiększ prędkość pompy do 2 000 ml/min i uzyskuj roztwór przez godzinę. Wyjmij roztwór ze zlewki i zastąp go świeżym roztworem, zwiększ prędkość pompy do 2100 ml/min i perflejuj świeży roztwór przez dodatkowe półtorej godziny, uzyskując całkowity czas w 3% Triton X-100/0,05% EDTA/0,05% NaN od3 do 2,5 godziny.
- Płukać chusteczkę w wodzie typu I o stężeniu 2150 ml/min i 2X PBS o stężeniu 2180 ml/min przez 10 minut każde.
- Przenieś serce do 4% roztworu deoksycholanu sodu o temperaturze pokojowej. Zwiększ prędkość pompy do 2 200 ml/min i uzyskuj roztwór przez 3 godziny.
- Przepłukać tkankę w wodzie typu I o sile 2 200 ml / min przez 15 minut, zmieniając roztwory po 5-10 minutach dla każdego roztworu. Opisane etapy perfuzji można rozłożyć na kilka dni, wykonując dwukrotnie etap płukania i przechowując serce z dołączonym wężem przez noc w temperaturze 4 °C i zanurzone w wodzie typu I.
- Następnego dnia wykonaj 5-minutowe płukanie wodą typu I o stężeniu 750 ml/min, a następnie 5-minutowe płukanie w 1X PBS o stężeniu 1,500 ml/min. Protokół może być następnie kontynuowany przy opisanym natężeniu przepływu w odpowiednim roztworze.
4. Dezynfekcja i obróbka końcowa
- Przenieść serce do 0,1% roztworu kwasu nadoctowego/4% etanolu i roztworu perfuzyjnego przez 1,5 godziny przy 2,200 ml/min.
- Końcowe płukanie tkanki wykonuje się z prędkością 2 200 ml / min. Perfuzję tkanki za pomocą 1X PBS przez 15 minut, a następnie dwa 5-minutowe płukanie w wodzie typu I. Tę serię płukań powtarza się jeszcze raz w celu zakończenia procedury perfuzji roztworu.
- Wyłącz pompę i wyjmij serce z roztworu, aby opróżnić serce. Odetnij opaski z aorty, usuń wszystkie rurki i umieść serce w pustej zlewce, aby odsączyć przez 1 godzinę. Nadmiar płynu będzie musiał być okresowo spuszczany. Połóż serce na podkładce chłonnej, aby całkowicie opróżnić serce (ryc. 4).
- Po usunięciu większości wody zapisz masę macierzy zewnątrzkomórkowej serca (C-ECM). Można się spodziewać, że serce straci około 20-25% swojej początkowej masy podczas procesu decelularyzacji.
- Rozwiń prawą i lewą komorę, a także przegrodę komorową w celu ilościowego określenia DNA i przetwarzania histologicznego, aby potwierdzić całkowitą decelularyzację tkanki (ryc. 5).
- Zamrażać C-ECM w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny przed liofilizacją.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wpływ decelularyzacji na całe serca świńskie naturalnie różni się ze względu na różnice w wielkości, ciśnieniu i układzie naczyń. W związku z tym dokładny skład uzyskanych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej nie będzie taki sam dla każdego serca. Zakończenie opisanego protokołu pozwoli uzyskać serce o białym lub półprzezroczystym wyglądzie, co wskazuje na utratę materiału komórkowego. Powszechnie przyjmuje się jednak, że tkankę można uznać za „zdecelularyzowaną” na podstawie kombinacji kilku dodatkowych parametrów iloś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W obecnym badaniu opisano metodologię konsekwentnej i skutecznej decelularyzacji serca świni. Protokół był modyfikacją wcześniej opublikowanego raportu 1 i obejmował dłuższą ekspozycję na przepływ i zwiększone ciśnienie, co zapewniło bardziej powtarzalne wyniki. Uzyskana w ten sposób tkanka pozbawiona komórek spełniała wszystkie opublikowane kryteria udanej decelularyzacji tkanki 2. Przeprowadzano częste zmiany roztworu w celu ograniczenia ponownego wprowadzania materiału komórkowego do tkanki, a ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Dr Gilbert był członkiem Naukowej Rady Doradczej w ACell, Inc. podczas prowadzenia badania, a ostatnio został wiceprezesem ds. badań i rozwoju. ACell, Inc. sprzedaje matrycę pęcherza moczowego i nie ma żadnego komercyjnego interesu w niniejszym badaniu.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Brogan Guest, Michelle Weaver i Kristen Lippert. Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez NIH Grant R03EB009237, a także NIH Training Grants T32EB001026-06 z National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering oraz T32HL076124-05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trypsyna | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Deoksycholan sodu | Sigma | D6750-500G | |
| Kwas nadoctowy | Pfaltz i Bauer | P05020 | 35% CAS # 79-21-0 |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Napęd pompy Masterflex | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Rurka Masterflex | Cole Parmer | 96400-18 | Rozmiar 18 |
| Reduktor kolczasty | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| Zlewka 4L | Fisher Scientific | 02-540T |
Bibliografia
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
